NY∕T 3278.1-2018 微生物农药 环境增值试验准则 第1部分：土壤(农业).pdf

, ICS 65.020 B 17 NY 中华人民共和国农业行业标准NY/T 3278.1一2018微生物农药环境增殖试验准则第1部分:土壤Environmental reproduction test guidelines for microbial pesticides-Part 1 :Soil 2018-07 -27发布2018 -12 -01实施中华人民共和国农业农村部发布NY/T 3278. 1-2018 剧昌NY/ T 3278 (微生物农药环境增殖试验准则)，分为3个部分:一一第1部分:土壤;一一第2部分:水;一一第3部分:植物叶面。本部分为NY/T3278的第1部分。本部分按照GB/T1. 1-2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由农业农村部种植业管理司提出并归口。本部分起草单位:农业农村部农药检定所、环境保护部南京环境科学研究所。本部分主要起草人:卡元卿、周欣欣、单正军、朱旦璇、袁善奎、姜辉、张燕宁、张兰。I 范围微生物农药环境增殖试验准则第1部分:土壤本部分规定了微生物农告等的基本要求。本部分适用于2 下列文件对件。凡是不注日GB 7172 GB 15618 3 术语下列术3.1 微生物农NY/T 3278. 1-2018 据处理、质量控制、试验报以细菌、真回回日在二二哥黯韬隘亟章程髓摇摇能GA病、虫、草、鼠等有害生3.2 供试物test 试验中需要测3.3 菌落形成单位由单个菌体或聚集3.4 细菌芽抱bacterial spore 某些细菌在其生长发育后期，在细胞内眠体。3.5 真菌抱子fungaI spore 真菌的主要繁殖器官。分为有性抱子和元性抱子两大类。抱子在适宜条件下发芽，形成菌丝而进行分裂繁殖;当外界环境不适宜时，可以呈休眠状态长时间生存。3.6 细菌抱囊bacterial cyst 某些细菌尤其是一些固氮菌在外界缺乏营养的条件下，由整个营养细胞外壁加厚、细胞失水而形成的一种抗干旱但不抗热的圆形休眠体。1 NY/T 3278. 1-2018 3.7 原生动物抱囊protozoan cyst 某些原生动物在外界环境不利条件下，形成的能高度抵抗干旱、冰冻和高温的休眠体。3.8 细菌营养体vegetative bacterium 单个活的生物体，通常是指能在合适的培养基上形成一个CFU的实体。3.9 原生动物protozoa 最原始、最低等的单细胞动物。原生动物除了具有真核细胞的一般特征(具细胞膜、细胞核和细胞质等)外，其细胞本身是一独立完整的有机体，通过细胞内和细胞表面的一些特殊细胞器来完成运动、营养和生殖等生命活动。3. 10 宿存sun唯val具有活性的微生物在施用后的一段时间内可在动物、土壤或植物内体或表面保持活性的状态。3. 11 增殖multiplication 微生物生长到一定阶段，由于细胞结构的复制与重建并通过特定方式产生新的生命个体，即引起生命个体数量增加的生物学过程。3. 12 延滞期lag phe 少量微生物接种到新鲜培养基后，在开始培养的一段时间内，因代谢系统适应新环境的需要，微生物数目没有增加的一段时期。3. 13 指数期log phase 在生长曲线中，紧接着延滞期的一段微生物数量以几何级增长的时期。3. 14 稳定期stationary phase 新增殖的微生物数量与衰亡的微生物数量相等的时期，这个时期的菌体数量达到最高。3. 15 衰亡期death ph描e微生物的个体死亡速度超过新增殖速度，整个群体呈现负生长状态的时期。4 试验概述将供试物接种到元菌土壤中，在适宜的条件下培养，定时取样测定其数量，得到供试物在土壤中的动态变化。5 试验方法5. 1 材料和条件5. 1. 1 试验用土推荐黑土作为试验用土，或采用供试物拟施用地区土壤作为试验用土，试验用土满足GB15618二级标准的要求。取土壤表面以下ocm20 cm的新鲜土样，封口带回实验室，除去粗大枝叶、动物躯壳等，风干保藏。风干土壤含水量测定按照GB7172的规定执行。风干土壤研磨过0.42mm筛，用自来, NY/T 3278. 1-2018 水调节土壤含水量为最大田间持水量的40%60%。然后每份100g分装人500mL锥形瓶，至少8份，1210C灭菌25min30 min。5. 1.2 供试物5. 1. 2. 1 类型供试物包括微生物农药母药、制剂产品。5. 1.2.2 批次试验中供试物应采用同一批次的产5. l. 3 主要仪器设备超净工作台。灭菌锅。显微镜。分光光度计。荧光定量温度计。天平。5. 2. l. 1 5.2.4 取样与存放自接菌后第1d开始取样，试。4d后，每隔1d取一次样品。. 菌水补充失水量。试验期间，维持土壤含水间可根据供试物的生长情况调整。样品40C保存。5. 2. 5 计数方法5.2.5. 1 细菌、放线菌、真菌、酵母以根据推荐的菌液。土壤充分混合均、氧气、光照等培养品各1.0 g，进行计数测次取样后质量差量为失水量，元的40%60%。取样量和取样间隔时以CFU为计数单位，可采用稀释平板菌落计数法(参见附录A)、绿色荧光蛋白基因标记-平板计数法(参见附录B)测定。以基因拷贝数为计数单位，可采用分子标记-荧光定量PCR法(参见附录C)测定。5. 2. 5. 2 原生动物、真菌抱子、酵母以个体数目为计数单位，可采用直接计数法(参见附录D)等测定。5. 2. 6 试验周期3 NY/T 3278. 1-2018 试验持续时间应能够反映供试物的延滞期、指数期、稳定期和衰亡期;或在28d内持续检测确认供试物含量维持稳定或显著低于接种量，则可结束试验。5. 2. 7 生长-消亡曲线以培养时间为横坐标、以供试物含量的对数为纵坐标做图，绘出供试物的生长-消亡曲线。5. 3 数据处理5.3. 1 独立样本t检验2组均值比较时可进行独立样本t检验。独立样本t检验按式(1)计算。式中:瓦，王;一一分别为两样本平均数;31，iz一一分别为两样本方差;n 一一样本容量。5.3.2 单因子方差分析(One-Way ANOVA) 3组及以上均值比较时可进行方差分析。单因子方差分析LSD检验按式(2)计算。. (1) LSD. = t.(df.) S王27(2)式中:t.(df.)一-在F检验中误差自由度下，显著水平为的临界t值;S-一一均数差异标准误，按式(3)计算。式中:MS.一-F检验中误差均方; 一-各处理重复数。S一可= J2MS./ n . (3) 5. 4 质量控制第Od时灭菌土壤不得检出微生物活菌。使用荧光定量PCR法计数微生物数量时，扩增效率的范围应为90%1l0%。6 试验报告试验报告应至少包括下列内容:a) 试验名称、试验单位名称和联系方式、报告编号;b) 试验委托单位和联系方式、样品受理日期和封样情况;c) 试验开始和结束日期、试验项目负责人、试验单位技术负责人、签发日期;d) 供试物基本信息(如含量和组成信息，以及任何改变供试物生物活性物质的含量和组成信息、施用量、施用方法等); e) 试验系统的详细描述;f) 试验条件，包括试验土壤含水量、pH、有机质含量、温度、光照等;g) 试验结果，绘制供试物的生长一消亡曲线。4 、A. 1 方法原理将土壤样品经无菌落，根据形成的菌A.2 试剂A. 2.1 A. 2. 2 A. 2. 3 A. 2. 4 A. 2. 5 A. 2. 6 A. 2. 7 A. 2. 8 A. 2. 9 A.2.10 A. 2.11 A. 2.12 A. 2.13 吐温80。A. 2.14 孟加拉红。A. 2.15 氯霉素。A. 2.16 氢氧化铀溶液:1 A. 2.17 盐酸溶液:1mol/L。A. 2.18 琼脂。注:以上化学试剂均为分析纯。A.3 仪器设备A. 3.1 高压蒸汽灭菌锅。A. 3. 2 恒温培养箱。A.3. 3 超净工作台。A. 3. 4 酸度计等。NY/T 3278. 1-2018 附录A(资料性附录)稀释平板菌落计数法生长并繁殖成一个菌5 NY/T 3278. 1-2018 A.4 固体培养基平板的制备1)A. 4. 1 细菌培养基平板用于细菌的培养。称取蛋白陈10g、牛肉浸膏3g、氯化锅5g、琼脂粉15g18g，于900mL蒸馆水中，煮沸搅拌至完全溶解，加蒸馆水补足至1000mL。以1mol/L氢氧化锅溶液或1mol/L盐酸溶液调节pH至7.07. 2。分装于500mL三角瓶中，每瓶200mL, 121 oC高压灭菌20min30 min。培养基温度降至约500C后倒人直径为9cm的元菌培养皿中，每板约15mL。A. 4. 2 高氏1号培养基用于放线菌的培养。称取可溶性淀粉20g、硝酸饵1g、氯化铀0.5g、磷酸氢二饵0.5 g、七水硫酸镜0.5g、七水硫酸亚铁0.01g、琼脂粉1 5g，于900mL蒸馆水中，煮沸搅拌至完全溶解，加蒸馆水补足至1000mL。以1mol/L氢氧化铀溶液或1mol/L盐酸溶液调节pH至7.07. 2。分装于500mL =: 角瓶中，每瓶200mL, 121 oC高压灭菌20min30 min。培养基温度降至约500C后倒人直径为9cm的无菌培养皿中，每板约15mL。A. 4. 3 孟加拉红培养基用于酵母菌和真菌的培养。称取蛋白陈5g、葡萄糖10g、磷酸二氢梆1g、硫酸镜0.5g，琼脂粉15 g18 g、孟加拉红0.03g，于900mL蒸馆水中，煮沸搅拌至完全溶解，加蒸馆水至1000mL。分装于500 mL三角瓶中，每瓶200mL, 1210C高压灭菌20min 30 min。培养基温度降至约500C后，按照1000 mL中含有氯霉素0.1g的比例加人氯霉素，轻摇混匀，倒人直径为9cm的无菌培养皿中，每板约15 mL。A. 4. 4 酵母培养基用于酵母菌的培养。称取酵母膏3g、麦芽汁3g、蛋白陈5g、葡萄糖10g、琼脂粉20g，于900mL 蒸馆水中，煮沸搅拌至完全溶解，加蒸馆水至1000mL。分装于500mL三角瓶中，每瓶200mL, 121 oC 高压灭菌20min30 mino培养基温度降至约500C后倒入直径为9cm的无菌培养皿中，每板约15mL。A.5 土壤样品的处理称取1.0g新鲜土样，加人盛有9mL元菌水或0.05%吐温80溶液的三角瓶中，定容至10mL，振荡10min使土壤充分分散，即成10-1土壤悬液。A.6 样品的稀释涂布用元菌刻度吸管吸取1mL上述10-1土壤悬液到9mL无菌水中，充分振荡，即成10-2土壤悬液。按此方法逐步稀释，通常稀释到10 -6。根据土壤中微生物的数量选择合适倍数的悬液接种，细菌一般采用10-6 10-4土壤悬液用于平板涂布;真菌一般10-31O-1土壤悬液用于平板涂布。吸取100L土壤悬液置于培养基平板表面，立即用无菌玻璃涂棒均匀涂抹于培养基表面。用同一支吸管接种同一样品不同稀释浓度时，应从高稀释度开始，然后依次吸取较低稀释度的悬液。将涂布后的平板倒置于温度适宜的培养箱中黑暗培养。A.7 菌落计数6 细菌培养基平板培养1d3 d后取出，选择细菌菌落数量20200之间的培养皿进行计数。放线菌培养基平板培养5d7 d后取出，选择菌落数量20200之间的培养皿进行计数。酵母、真菌培养基平板培养3d5 d后取出，选择真菌菌落数量10100之间的培养皿进行计数。1) A. 4. 1A. 4. 4培养基配方仅供参考，可根据供试物生物学特征选择最适合的培养基配方。菌落计数按式(A.1)计算。C=A X F X 10 Wsoil 式中:C -一每克土壤中菌落数含量，单位为菌落形成单位每克(CFU/g); CA -一平板菌落平均数，单位为菌落形成单位(CFU); F 一-稀释倍数;Wsoil一一烘干土重，单位为克(g)。NY/T 3278. 1-2018 . (A. 1) 7 NY/T 3278. 1-2018 附录B(资料性附录)绿色荧光蛋白基因标记-平极计数法备设器01234仪lnJua斗只JVhu叮/nHMQd嘈l1l唱l唱lnJnJn/nJnJnJ内/nJnJnJnJ内/n/nJnJ内JVRUBDRURURURURDRUEDRUEDRUBBEDRHRU 的供试物能够在紫荧光菌落得到供试物B.1 方法原理本方法可用于将含有外透射下发出数量。日，10mmol/L CaC12。B. 3. 1 超净工作台。B.3.2 摇床。B. 3. 3 恒温水浴锅。B. 3. 4 低温高速离心机。B. 3. 5 恒温培养箱等。B.4 绿色荧光蛋白基因标记菌株的制备B. 4. 1 细菌B. 4. 1. 1 细菌感受态细胞制备取供试细菌划线接种在LB固体培养基(膜蛋白陈10g、酵母提取物5g、NaCl10 g、琼脂粉8 NY/T 3278. 1-2018 15g18g，蒸馆水1000mL, 1210C高压灭菌20min)平板上，370C培养过夜。从长好的平板上挑取一个单菌落，转接在含有3mLLB液体培养基的试管中，370C振荡培养过夜。取0.3mL菌液接种于20mLLB液体培养基的100mL三角瓶中，37C振荡培养2h3 h，待OD600值达到O.30. 4时，取下三角瓶，立即置冰浴10min 15 min。将细菌转移到一个灭菌的50mL离心管中，40C、3000r/min离心10min，弃去上清液，收集菌体。加入20mL用冰预冷的O.1 mol/ L CaClz溶液，重新悬浮菌体，使菌体分散均匀，置冰浴中30min. 40C、3000r/min离心10min，弃去上清液。再加人2mL用冰预冷的0.1mol/L CaClz溶液，小心重新悬浮菌体。在4.C冰箱中放置12h24 h，即可应用于转化。B. 4. 1.2 细菌的转化取供试细菌新鲜感受态细胞100L于1.5 mL离心管中，加入50ng100 ng含绿色荧光蛋白基因及氯霉素抗性的质粒，轻轻旋转以混合内容物，在冰浴中放置30min. 420C热休克120s，不要摇动离心管。加人LB液体培养基900L，3 7C保温60min.取100L转化液涂布在含氯霉素的LB固体平板上，37C倒置培养16h24 h。观察平板，长出的菌落可能就是转化子，可进一步提取质粒鉴定。含有抗性基因的菌株作为供试物用于土壤增殖测试。B.4.2 真菌B. 4. 2. 1 真菌原生质体制备分别称取溶壁酶(2%)、蜗牛酶(4%)共溶于5mL O. 8 mol/ L MgS04溶液(pH5.0)中，经0.22m灭菌微孔滤膜过滤除菌，制备成复合酶液。将获得的真菌抱子配置成1X 107个/mL抱子悬浮液。在250 mL三角瓶中装人100mL马铃薯震糖液体培养基(马铃薯200g、煎糖20g、蒸馆水1000mL, 1210C 高压灭菌20min) ，加人上述抱子悬液1mL，在25.C28.C、180r/min摇床培养12h后收集菌丝。然后称1g湿菌丝，加人4mL复合酶液，于300C下缓慢振荡温浴2h3 h，经放置有4层无菌纱布的漏斗过滤，离心收集原生质体，40C保存以备转化。B. 4. 2.2 原生质体转化转化采用PEG/CaClz融合法。取上述巳纯化的原生质体100L(浓度为108个/mL)，加入5L含绿色荧光蛋白基因及潮霉素抗性的质粒(含10L DNA) ，混匀后冰浴20min30 min;然后加人1. 25 mL PEG溶液，室温静置10min;加人1mL STC溶液稀释，4.C、3000r/min离心30min;弃上清液，将沉淀的原生质体悬浮于400L高渗再生液体培养基(蛋白陈19、葡萄糖19、酵母粉0.5g、牛肉膏。.5g、NaClO. 5 g、廉糖17.1g、MgClz0.19 g、蒸馆水100mL，灭菌20min)中。30.C摇床培养12h 16 h后，涂布于含潮霉素的培养基平板上，30.C静置培养5d7 d，筛选含有抗性基因的菌株(即转化子)。含有抗性基因的菌株作为供试物用于土壤增殖测试。B.5 样晶的处理称取1.0g新鲜土样，加人盛有9mL无菌水的三角瓶中，定容至10mL，振荡10min使土壤充分分散，即成10一1土壤悬液。B.6 样品的稀释涂布用无菌刻度吸管吸取1mL上述10-1土壤悬液到9mL元菌水中，充分振荡，即成10-z土壤悬液。按此方法逐步稀释，通常稀释到1。一飞根据土壤中微生物的数量选择合适倍数的悬液接种，细菌一般采用10-610-4土壤悬液用于平板涂布;真菌一般10-31O-1土壤悬液用于平板涂布。吸取100L土壤悬液稀释液置于培养基平板表面，立即用元菌涂布棒均匀涂抹于培养基表面。用同一支吸管接种同一样品不同稀释浓度时，应从高稀释度开始，然后依次吸取较低稀释度的悬液。将涂布后的平板倒置于温度适宜的培养箱中黑暗培养。9 NY/T 3278. 1-2018 B.7 菌落计数细菌在培养基平板培养1d3 d后取出，在紫外透射仪波长230nm下计数荧光菌落，选择荧光菌落数量20200之间的培养皿进行计数。真菌在培养基平板培养3d5 d后取出，在紫外透射仪波长230nm下计数荧光菌落，选择荧光菌落数量10100之间的培养皿进行计数。菌落计数与式(A.l)同。10 NY/ T 3278. 1-2018 附录C(资料性附录)分子标记-荧光定量PCR法C.1 方法原理本方法可用于细菌、真菌、原生生物等微生物计数。在普通聚合酶链式反应的基础上，加入一条特异的荧光探针。该探针为一寡核昔酸，两段分别标记一个报告荧光基团和一个洋灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被摔灭基团吸收，PCR扩增时，Taq酶的5-3外切酶活性将探针酶切降解，使报告基团和萍灭基团分离，从而荧光监测系统可接受到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的积累与PCR产物形成完全同步。最后通过参照标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。C.2 试验材料C. 2. 1 10Xbuffer200 mrnol/L Tris HC1(pH 8. 4) ,500 mmol/L KC1。C. 2. 2 dNTP。C. 2. 3 rTaq酶。C. 2. 4 引物对。C. 2. 5 TaqMan探针。C. 2. 6 土壤基因组DNA提取试剂盒。C.3 主要仪器C. 3. 1 荧光定量PCR 仪。C. 3. 2 普通PCR仪。C. 3. 3 超净工作台。C. 3. 4 紫外分光光度计等。C.4 土壤微生物基因组DNA提取土壤微生物基因组DNA的提取参照提取试剂盒的步骤进行，将最终获得的土壤基因组DNA在i -200C下保藏。C.5 荧光PCR检测荧光PCR扩增反应体系如下:10 X buffer 2. 5L;dNTPC10 mrnol/L) 2L;菌种特异性正反引物各lL;rTaq酶0.5L;双蒸水15L;荧光定量探针(2mol/L)1L;基因组模板2L，共计25LoPCR 扩增反应程序如下:950C预变性3min; 950C 10 s变性，600C30 s退火延伸，60oC时收集FAM荧光;共40个循环，阴性对照使用灭菌双蒸水。反应完毕后，荧光定量PCR仪检测系统根据阔值自动生成的动力曲线及Ct值。C.6 标准曲线的建立将梯度稀释的含有目的片段的(101拷贝/L108拷贝/L)的DNA作为模板，进行荧光定量NY/T 3278. 1-2018 PCR，以模板拷贝数的对数值为X轴、Ct值为Y轴做图，建立检测标准曲线。扩增效率计算CE):E的范围应为90%110%，保证qPCR每完成一个循环，底物浓度扩增l倍;E按式Cc.1)计算。E = (10一1/是一1)X 100. Cc. 1) 式中:E一-扩增效率，单位为百分率C%); 是一-标准曲线斜率。C.7 的基因片段的拷贝数。12 D.1 方法原理附录D(资料性附录)直接计数法本方法可用于原生动物、真菌抱子、酵母等微生物计数。将土样与无菌水混合，制备成悬浊液，直接在显微镜下计数。D.2 仪器设备D. 2.1 显微镜。D. 2. 2 锥形瓶。D. 2. 3 滴管。D. 2. 4 载玻片、盖玻片。D. 2. 5 超净工作台等。D.3 样品的制备NY/T 3278. 1-2018 取1.0g新鲜土壤，加人10rnL元菌水，充分振荡摇匀，避免土壤颗粒薪附在容器壁上。D.4 样晶的检测取1mL土壤悬液分多次滴加在载玻片上，显微镜下计数，直到将全部1mL悬浮液检测查完为止。D.5 数量计数供试物数量计数按式CD.D计算。式中:C=CI!.XF =一一一一 CD.DWsoil C 一-每克烘干土壤中供试物含量，单位为个每克(个/g) ; CA 一-lmL稀释液中供试物的平均数;F 一-土壤悬液稀释倍数;W时一一-烘干土重，单位为克Cg)。13 NY/T 3278. 1-2018 参考文献lCanada PMRA, 1998. Guidelines for the Registration of Microbial Pest Control Agents and Products. 2GB 4789.2-2010食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定.3Japan MAFF,1997. Guidelines for Safety Evaluation of Microbial Pesticides. 4Primrose S,Twyrnan R,Old B，2002.基因操作原理M.第六版.瞿礼嘉，顾红雅，译.北京:高等教育出版社.5SN/ T 2101-2016 出口乳及乳制品中结核分枝杆菌检测方法荧光定量PCR法.6US-EPA,1996. Microbial Pesticides Testguidelines OPPTS 885. 4050. 14 FON|FChN的H问Z中华人民共和国农业行业标准微生物农药环境增殖试验准则第1部分:土壤NY/ T 3278.1- 2018 关中国农业出版社出版(北京市朝阳区麦子店街18号楼)(邮政编码:100125网址:.ccap. corn. cn) 北京印刷一厂印刷新华书店北京发行所发行各地新华书店经销* 争舍头印张1.25 字数25千字2018年11月北京第1次印刷9峰开本880rnrnX1230rnrn 1/16 2018年11月第1版书号16109 4634 定价30.00元争等版权专有侵权必究举报电话[phone] NY /T 3278.1- 2018