吡咯啉-5-羧酸合成酶在人肝癌组织中表达及其对人肝癌细胞系铁死亡的调控作用观察.pdf

山东医药2023 年第 63 卷第 30 期吡咯啉-5-羧酸合成酶在人肝癌组织中表达及其对人肝癌细胞系铁死亡的调控作用观察张玉衡，陈鸣，曹科，王刚，朱章华，虞文魁南京大学医学院附属鼓楼医院重症医学科，南京210009摘要：目的观察吡咯啉-5-羧酸合成酶（Pyrroline-5-carboxylate synthase，P5CS）在肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）组织中的表达变化及其对人肝癌细胞系铁死亡的调控作用。方法HCC及癌旁组织P5CS检测：选择10例HCC患者的癌组织及癌旁组织，采用免疫组化法检测HCC及癌旁组织P5CS蛋白；P5CS对人肝癌细胞系Li-7、Huh-7铁死亡的调控作用观察：取对数生长期Li-7、Huh-7，用siALDH18A1 乙醛脱氢酶家族18成员A1（ALDH18A1）可编码P5CS蛋白 转染细胞，采用qRT-PCR法检测转染前后Li-7及Huh-7细胞脂质过氧化物合成相关基因ACSL4、LPCAT3、LOX-15，采用WESTERN Blotting法检测转染前后Li-7及Huh-7细胞铁死亡相关蛋白溶质载体家族 7 成员 11（SLC7A11）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPX4）。取转染前后 Li-7 及 Huh-7 细胞各分为 2 组，分别加入5 mol/L的铁死亡诱导剂Erastin、同体积DMSO，采用C11-BODIPY荧光探针检测各组细胞脂质过氧化物含量。取转染前、后Li-7及Huh-7细胞各分为2组，分别加入5 mol/L的GPX4靶向抑制剂RSL-3、5 mol/L的Erastin、同体积DMSO，采用C11-BODIPY荧光探针检测各组细胞脂质过氧化物含量。结果HCC及癌旁组织P5CS蛋白相对表达量分别为6.80 2.10、0.40 0.20，二者比较，P0.05。与转染前比较，转染后Li-7及Huh-7细胞SLC7A11、GPX4蛋白相对表达量低（P均0.05）。与转染前比较，转染后加入Erastin、RSL-3的Li-7、Huh-7 细胞脂质过氧化物含量均升高（P均0.05）。与加入Erastin者比较，转染后加入RSL-3的Li-7、Huh-7 细胞脂质过氧化物含量高、细胞活性低（P均0.05）。结论HCC组织中P5CS表达升高。P5CS可抑制Li-7及Huh-7细胞的铁死亡，P5CS可能通过抑制细胞GPX4表达，调控Li-7及Huh-7细胞的铁死亡。关键词：吡咯啉-5-羧酸合成酶；铁死亡；谷胱甘肽过氧化物酶4；肝肿瘤；肝细胞癌doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2023.30.003 中图分类号：R735.7 文献标志码：A 文章编号：1002-266X（2023）30-0011-05Expression of pyrroline-5-carboxylate synthase in hepatocellular carcinoma tissues and its regulatory effect on ferroptosis in human hepatoma cell linesZHANG Yuheng，CHEN Ming，CAO Ke，WANG Gang，ZHU Zhanghua，YU WenkuiDepartment of Intensive Care Unit，The Affiliated Hospital of Nanjing University Medical School，Nanjing 210009，ChinaAbstract：Objective To observe the expression changes of pyrroline-5-carboxylate synthase（P5CS）in hepatocellular carcinoma（HCC）tissues and its regulatory effect on ferroptosis in human hepatoma cell lines.Methods Detection of P5CS in HCC and adjacent tissues：The cancer tissues and adjacent tissues of 10 patients with HCC were collected，and P5CS was detected by immunohistochemistry.The regulatory effect of P5CS on ferroptosis of human hepatoma cell lines Li-7 and Huh-7：Human hepatoma cell lines Li-7 and Huh-7 in the logarithmic growth phase were transfected with siALDH18A1（targeting P5CS coding gene ALDH18A1）.Before and after the transfection of siALDH18A1 in Li-7 and Huh-7 cells，qRT-PCR was used to detect the expression levels of ACSL4，LPCAT3 and LOX-15 genes related to lipid peroxide synthesis，and Western blotting was used to detect the content of ferroptosis-related protein solute carrier family 7 member 11（SLC7A11）and glutathione peroxidase（GPX4）.Li-7 and Huh-7 cells with or without siALDH18A1 transfection were divided into two groups，and 5 mol/L Erastin or the same volume of DMSO were added，respectively.The content of lipid peroxide in each group was detected by C11-BODIPY fluorescent probe.Another group of cells with or without siALDH18A1 transfection were divided into two groups，and 5 mol/L GPX4 targeted inhibitor RSL-3，5 mol/L Erastin or 基金项目：国家重大科研仪器研制项目（81927808）；国家自然科学基金青年基金项目（82002082）第一作者简介：张玉衡（1991-），男，博士研究生在读，主要研究方向为细胞死亡与肿瘤。E-mail：开放科学（资源服务）标识码（OSID）11山东医药2023 年第 63 卷第 30 期the same volume of DMSO were added，respectively.The content of lipid peroxide in each group was detected by C11-BODIPY fluorescent probe.Results The expression of P5CS protein of HCC and adjacent tissues were 6.80 2.10 and 0.40 0.20，respectively（P0.05）.The relative expression levels of SLC7A11 and GPX4 protein were lower in comparison with those before inhibition（both P0.05）.Compared with those before inhibition，the lipid peroxide content in Li-7 and Huh-7 cells added with Erastin or RSL-3 after transfection increased（all P0.05）.The lipid peroxide content of Li-7 and Huh-7 cells added with RSL-3 after transfection was higher and the cell activity was lower in comparison with those of cells added with Erastin（all P0.05）.Conclusions P5CS was highly expressed in HCC tissues.P5CS inhibits ferroptosis of Li-7 and Huh-7 cells possibly by inhibiting GPX4 expression.Key words：pyrroline-5-carboxylate synthase；ferroptosis；glutathione peroxidase 4；liver neoplasms；hepatocellular carcinoma肝癌是世界第六大常见的恶性肿瘤。单独应用靶向药物治疗晚期肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）的效果不佳，部分患者在治疗后发生耐药1-2。因此，探索HCC的细胞耐药机制是目前的研究重点与难点。铁死亡是一种新发现的调节性细胞死亡形式，主要表现为铁催化的脂质过氧化物对细胞各类膜结构的破坏，被以还原性谷胱甘肽（Glutathione，GSH）-谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione peroxidase 4，GPX4）为主的抗氧化系统负性调控3。研究4发现，索拉非尼等靶向药物在诱导HCC肿瘤细胞凋亡、抑制血管新生的同时，还可抑制肿瘤细胞脂质过氧化物的产生、上调抗抗氧化系统 GSH-GPX4的活性，抑制HCC细胞铁死亡，最终导致肿瘤耐药。吡咯啉-5-羧酸合成酶（Pyrroline-5-carboxylate synthase，P5CS）是催化脯氨酸合成的限速酶之一，除催化合成作用外还能维持细胞内GSH含量，从而保护肿瘤细胞免受氧化应激损伤，具有潜在的抗氧化作用5。P5CS可通过增加脯氨酸的合成，促进肿瘤的发生发展，但具体作用机制尚不明确6。P5CS是否通过调控肝癌细胞的铁死亡影响细胞耐药，目前相关研究较少。为此，2023年1-6月，我们观察了P5CS在HCC组织中的表达及其对人肝癌细胞系铁死亡的调控作用，进一步探讨其可能作用机制，现报告如下。1 材料与方法 1.1HCC癌组织及癌旁组织P5CS检测2020年9月2021年 9月间于南京鼓楼医院就诊的 HCC患者10例。患者纳入标准：结合临床表现、影像学诊断（B 超/增强 CT 或 MRI）和血清 AFP 检测（400 g/L）临床确诊为HCC；术前未经放疗、化疗和靶向治疗；不伴有其他类型肝占位、肝内胆管结石等。排除标准：不愿意接受手术治疗或出现肝内/肝外广泛转移，暂无法进行手术治疗；肝功能和/或其他脏器功能出现严重不全，无法耐受手术治疗；术后病理证实为非HCC的其他类型肝癌。10例患者均留取HCC组织和对应癌旁组织（5 cm）标本，并对标本的使用知情同意。取 HCC 及癌旁组织，固定后石蜡包埋切片，Triton-X通透组织细胞后封闭非特异性抗原，anti-P5CS一抗孵育，4 过夜。次日孵育二抗并滴加DAB显色剂，苏木素复染后封片观察。染色强度为阴性计0分、弱阳性计1分、阳性计2分、强阳性计3分；阳性染色细胞（阳性、强阳性染色强度细胞）百分比为25%者计1分、26%50%者计 2 分、51%75%者计 3 分、76%100%者计 4分；以染色强度、阳性染色细胞百分比相加为 P5CS 的蛋白的相对表达量。重复测算 3 次，取平均值。1.2P5CS 对人肝癌细胞系铁死亡的调控作用观察1.2.1细胞、试剂及仪器人肝癌细胞系 Li-7、Huh-7 购自中国科学院上海细胞库；Huh-7 在含有10%胎牛血清的DMEM高糖培养基中培养，Li-7在含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中培养，置于37、含5%CO2的细胞培养箱内。siALDH18A1乙醛脱氢酶家族18成员A1（ALDH18A1）基因可编码 P5CS 蛋白，基因序列 GTTCGTTCTTGGAGCAACA 购自广州锐博生物；逆转录及荧光定量PCR试剂盒购自武汉赛维尔公司；qPCR所需引物购自北京擎科生物，具体序列GAPDH基因qPCR引物正向序列 TCAAGGCTGAGAACGGGAAG、反 向 序 列 TCGCCCCACTTGATTTTGGA，ALDH18A1 基 因 qPCR引物正向序列 GCCCTTCAACCAACATCTTCT、反向序列 AGGGGTACAGTGATAAACGGG，ACSL4 基因qPCR 引物正向序列 GCTATCTCCTCAGACACACCGA、反向序列 AGGTGCTCCAACTCTGCCAGTA，LPCAT3 基因 qPCR 引物正向序列 GGAGCTGAGCCT12山东医药2023 年第 63 卷第 30 期TAACAAGTT、反 向 序 列 CAAAGCAAAGGGGTAACCCA，15-LOX 基 因 qPCR 引 物 正 向 序 列 ACC TTCCTGCTCGCCTAGTGTT、反 向 序 列 GGCTACAGAGAATGACGTTGGC。一抗（anti-P5CS、anti-actin、anti-SLC7A11、anti-GPX4）及二抗（羊抗鼠、羊抗兔）购自美国Proteintech公司；CCK8试剂盒购自武汉赛维尔公司；细胞活性氧簇（ROS）检测试剂盒、转染试剂 Lipo8000购自碧云天生物公司；C11-BODIPY染料购自美国Thermo Fisher公司；SLC7A11靶向抑制剂Erastin、GPX4靶向抑制剂RSL-3购自美国Selleck公司。1.2.2Li-7、Huh-7 细胞培养及 siALDH18A1 转染方法取接种于6孔板内的对数生长期 Li-7、Huh-7细胞，按说明书将适量Lipo8000和siALDH18A1混合，室温孵育15 min后转染细胞，控制siALDH18A1终浓度为50 nmol/L。继续培养48 h后TRIzol提取总RNA，采用qPCR法检测细胞ALDH18A1 mRNA，与转染前比较，转染48 h时Li-7、Huh-7细胞中ALDH18A1 mRNA 相对表达量减少至 27.10 13.30、30.20 3.60（P0.05），采用 WESTERN Blotting 法检测转染前后 Li-7、Huh-7 细胞 P5CS 蛋白，转染前 Li-7、Huh-7 细胞 P5CS 蛋白相对表达量分别为1.07 0.23、0.65 0.02，转染后 Li-7、Huh-7 细胞P5CS 蛋白相对表达量分别为 0.35 0.01、0.02 0.01，转染前后Li-7、Huh-7细胞P5CS蛋白相对表达量比较，P均0.05。说明转染siALDH18A1后，Li-7、Huh-7 细胞中 P5CS 蛋白被成功抑制，可进行后续实验。1.2.3转染前后人肝癌细胞系铁死亡程度观察采用 C11-BODIPY 荧光探针检测转染前、后 Li-7及Huh-7细胞内脂质过氧化物含量。C11-BODIPY 是一种脂溶性的荧光探针，能够自由进入细胞并与细胞或细胞器膜结合，借助流式细胞仪可以在不破坏细胞膜完整性的情况下检测细胞膜及细胞内脂质过氧化物的含量，是目前已知准确度最高的铁死亡检测指标之一7。取转染前后的Li-7、Huh-7细胞培养至汇合度 80%90%时，换液并加入 5 mol/L 的C11-BODIPY，37 避光孵育20 min。用无血清培养基洗涤细胞3次，胰酶消化后PBS重悬，用流式细胞仪FITC通道测算细胞脂质过氧化物含量，重复测算3次，取平均值。1.2.4转染前后人肝癌细胞系脂质过氧化物合成相关基因 ACSL4、LPCAT3、LOX-15 检测采用 qPCR 法 检 测 转 染 前、后 Li-7 及 Huh-7 细 胞 内 ACSL4、LPCAT3、LOX-15基因的mRNA，所有操作均同“1.2.2”。重复测算3次，取平均值。1.2.5转染前后人肝癌细胞系SLC7A11、GPX4蛋白检测采用 WESTERN Blotting 法检测转染抑制前、后 Li-7 及 Huh-7 细胞内 SLC7A11、GPX4 蛋白。收集6孔板内Li-7及Huh-7细胞并使用RIPA裂解液提取总蛋白，BCA试剂盒测定蛋白浓度，SDS-PAGE凝胶电泳分离后转至PVDF膜上，5%脱脂牛奶封闭2 h孵育相应一抗，4 过夜，TBST洗去膜上多余一抗，室温孵育相应二抗 2 h，加入 ECL显色液曝光。Image J软件测算SLC7A11、GPX4蛋白灰度值，重复测算3次，取平均值。1.2.6加入Erastin的Li-7、Huh-7细胞铁死亡程度观察Li-7、Huh-7细胞分别转染对照siRNA（D组）或 siALDH18A1（E 组），转染 48 h 时分别取 Li-7 及Huh-7细胞，各分为2组，每组6个复孔。其中E组细胞换液后加入5 mol/L的Erastin，D组换液后加入同体积的DMSO作为对照，继续培养24 h。采用C11-BODIPY 荧光探针检测 Li-7及 Huh-7细胞两组脂质过氧化物含量，所有操作均同“1.2.3”。重复检测3次，取平均值。1.2.7加入 RSL-3的 Li-7、Huh-7细胞铁死亡程度观察Li-7、Huh-7细胞分别转染对照siRNA（D组）或 siALDH18A1（E组），48 h时分别取 Li-7及 Huh-7细胞，各分为2组，每组6个复孔。抑制前、抑制后的R组细胞换液后加入5 mol/L的RSL-3，D组换液后加入同体积的DMSO作为对照，继续培养24 h。采用C11-BODIPY荧光探针检测Li-7及Huh-7细胞两组脂质过氧化物含量，所有操作均同“1.2.3”，采用CCK-8 试剂盒检测细胞活性，重复检测 3 次，取平均值。1.3统计学方法采用 SPSS 22.0 统计软件进行数据处理，采用Graphpad Prsim 8.0软件绘图。计量资料通过 ShapiroWilk 进行正态性检验，符合正态分布的以-x s表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，不同处理组内、组间比较采用两因素方差分析；方差分析前检验方差齐性，方差不齐者进行秩变换后具备方差齐性，再进行方差分析。P0.05为差异具有统计学意义。2 结果 2.1HCC 及癌旁组织 P5CS 蛋白相对表达量比较HCC及癌旁组织P5CS蛋白相对表达量分别为13山东医药2023 年第 63 卷第 30 期6.80 2.10、0.40 0.20，二者比较，P0.05。2.2.2转染前、后 Li-7 及 Huh-7 细胞 ACSL4、LPCAT3、LOX-15 基因相对表达量比较转染后 Li-7细胞ACSL4、LPCAT3、LOX-15基因相对表达量分别为转染前的 74.00 6.10、30.60 29.70、31.30 9.50，转染后Huh-7细胞的三种基因相对表达量分别 为 转 染 前 的 53.50 11.10、31.90 7.50、72.00 12.70。与转染前比较，转染后Li-7及Huh-7组细胞三种脂质过氧化物合成基因相对表达量间比较，P均0.05。2.2.3转染前后Li-7细胞SLC7A11、GPX4蛋白相对表达量比较转染前、后Li-7细胞SLC7A11蛋白相对表达量分别为 0.48 0.07、0.17 0.01，二者比较，P0.05；转染后Li-7细胞GPX4蛋白相对表达量分别为00.29 0.01、0.05 0.01，二者比较，P0.05。2.2.4转染前后加入Erastin的Li-7、Huh-7细胞脂质过氧化物含量比较加入Erastin诱导铁死亡后，转染前Li-7 E组、Huh-7 E组细胞脂质过氧化物含量分别为1.03 0.01、1.03 0.01；转染后Li-7 E组、Huh-7 E 组细胞脂质过氧化物含量分别为 1.15 0.03、1.17 0.02。与转染前比较，转染后 Li-7 E组、Huh-7 E组细胞脂质过氧化物含量升高（P均0.05）。2.2.5转染前后加入Erastin和RSL-3的Li-7、Huh-7细胞脂质过氧化物含量及细胞活性比较转染前 Li-7 E组、Li-7 R组、Huh-7 E组、Huh-7 R组细胞脂质过氧化物含量分别为 1.27 0.01、1.05 0.02、1.23 0.01、1.16 0.03；转 染 后 Li-7 E组、Li-7 R组、Huh-7 E组、Huh-7 R组细胞脂质过氧化物含量分别为 1.31 0.02、1.21 0.02、1.29 0.01、1.23 0.02。与转染前比较，转染后 Li-7 E组、Li-7 R组、Huh-7 E组、Huh-7 R组细胞脂质过氧化物含量高（P均0.05）。转染后 Li-7 R组、Huh-7 R 组 细 胞 相 对 活 性 分 别 为 78.04%1.79%，81.16%0.40%，Li-7 E组、Huh-7 E组细胞相对活性分别为 89.22%1.68%，87.14%2.51%，R 组和E组比较，P均0.05。3 讨论 以索拉非尼为代表的肝癌靶向药物理论上具有抗血管生成、抑制细胞增殖以及诱导凋亡的多重抗肿瘤作用，但临床上索拉非尼或同类药物仅针对部分基因型突变患者有效，其中相当一部分患者在用药后不同时间还出现了肿瘤耐药，总体生存期延长有限8。对索拉非尼作用机制的进一步探索发现，类似药物可以通过p62-Keap1/NRF2途径诱导肿瘤细胞合成较多的GSH，同时抑制细胞内脂质过氧化物的蓄积，避免出现脂质过氧化物介导的细胞铁死亡寻找并明确调控HCC细胞氧化-抗氧化平衡的内在因素，对于揭示肝癌耐药的相关分子机制具有重要意义9。以脯氨酸及其代谢酶为核心的代谢途径是近年来新发现的哺乳动物细胞抗氧化机制8。P5CS是线粒体内合成脯氨酸的关键酶之一，作为谷氨酸合成脯氨酸的第一个催化酶，由 ALDH18A1 基因编码，能够将谷氨酸转化为P5C，为脯氨酸提供核心结构吡咯啉环；其催化活性依赖于 ATP 和 NAD（P）H7。乳腺癌细胞中P5CS在癌基因c-MYC的调控下含量升高并促进癌细胞增殖；敲除P5CS的编码基因ALDH18A1会导致细胞线粒体呼吸链受损，降低细胞对氧化应激的抵抗能力，表明P5CS具有潜在的抗氧化作用，并且都与肿瘤细胞中更多的还原当量相关7。本研究发现，相较于癌旁组织和正常肝细胞，HCC组织中和细胞中P5CS含量均显著升高，提示 P5CS 在 HCC 进程中可能具有潜在的促癌作用。铁死亡是一种以脂质过氧化物累积导致细胞膜结构氧化损伤的细胞死亡方式，现有研究认为，铁死亡的始动环节为铁离子催化下的脂质过氧化物过量合成，同时细胞内抗氧化作用相对不足，导致累积的脂质过氧化物破坏细胞膜结构3。可见，铁死亡强调细胞整体的氧化-抗氧化平衡状态；抑制以GSH-GPX4为核心的抗氧化作用，能够显著降低细胞抗氧化能力，使细胞趋向于铁死亡10。研究9，11发现，结直肠癌和HCC中P5CS含量异常升高，而且抑制其基因 ALDH18A1表达后肿瘤细胞均出现了增殖减慢、下游癌基因表达降低。我们进一步分析了P5CS与肝癌细胞铁死亡的相关性，发现抑制P5CS没有显著影响细胞内脂质过氧化物含量；然而在使用小分子抑制剂Erastin诱导铁死亡后，缺少P5CS的14山东医药2023 年第 63 卷第 30 期肝癌细胞明显出现铁死亡趋势。由于 Erastin具有诱导铁死亡的特性，某种意义上也具有抗肿瘤效应，因此，上述结果提示P5CS的存在可能保护了肝癌细胞免于药物诱导的铁死亡，赋予了HCC肿瘤耐药能力。这也是国内外首次将脯氨酸代谢与肿瘤铁死亡联系起来。脂质过氧化物的产生增多和细胞抗氧化作用的缺失是出现铁死亡的两个核心机制，我们进一步探索了P5CS与以上两种机制的相关性。细胞内乙酰辅酶 A 在乙酰辅酶 A 羧化酶的作用下合成多不饱和脂肪酸（PUFA），游离 PUFA 经 ACSL4 和 LPCAT3两步催化结合磷脂（PL），形成PUFA-PL并参与构成膜脂质双分子层。然而，PUFA具有易于过氧化的特点，因此当细胞内LOX-15增多时，PUFA-PL就会被过氧化为含有过氧自由基的PUFA-PLOOH，对细胞各类膜结构造成氧化损伤3。因此，ACSL4、LPCAT3和LOX-15通常被认为是铁死亡中调控脂质代谢的关键基因。除了以上脂质过氧化物的异常产生外，以SLC7A11-GSH-GPX4为核心的抗氧化功能缺失同样是铁死亡的特征12。合成GSH所需三种底物氨基酸之一的半胱氨酸，主要由通道蛋白SLC7A11逆向转运进入细胞；进一步合成的 GSH 在 GPX4 催化下氧化为氧化型谷胱甘肽（GSSG），同时为细胞提供抗氧化当量。因此，SLC7A11 的逆向转运功能、GSH 的合成以及 GPX4的催化功能是细胞抵抗铁死亡的最主要因素12-13。本研究发现，抑制 P5CS并不能影响肝癌细胞内脂质过氧化关键基因ACSL4、LPCAT3和LOX-15的表达，但能显著降低 SLC7A11 及 GPX4 的蛋白含量，表明 P5CS并不能影响铁死亡的起始过程，而是通过增强抗氧化能力抑制了细胞铁死亡。为了进一步明确 P5CS发挥抗氧化能力的靶点，我们对比了使用 Erastin 或 RSL-3 后，肝癌细胞铁死亡的情况。结果显示，两种铁死亡诱导剂均能诱导缺乏 P5CS的肝癌细胞铁死亡，但使用RSL-3后细胞活性降低更为显著、细胞内脂质过氧化物蓄积更为明显，表明 P5CS主要通过维持 GPX4含量阻止了肝癌细胞铁死亡。综上所述，相比于癌旁组织，HCC组织中P5CS表达升高。P5CS 可抑制 Li-7 及 Huh-7 细胞的铁死亡，其机制可能为 P5CS抑制细胞内 GPX4表达，促进肝癌细胞的铁死亡。参考文献：1SUNG H，FERLAY J，SIEGEL R L，et al.Global Cancer Statistics 2020：GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries J.CA Cancer J Clin，2021，71（3）：209-249.2GORDAN J D，KENNEDY E B，ABOU-ALFA G K，et al.Systemic therapy for advanced hepatocellular carcinoma：ASCO guideline J.J Clin Oncol，2020，38（36）：4317-4345.3STOCKWELL B R，FRIEDMANN ANGELI J P，BAYIR H，et al.Ferroptosis：A regulated cell death nexus linking metabolism，redox biology，and disease J.Cell，2017，171（2）：273-285.4BYUN J K，LEE S，KANG G W，et al.Macropinocytosis is an alternative pathway of cysteine acquisition and mitigates 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