不同信号肽对酿酒酵母蔗糖转化酶Suc2分泌表达水平的影响.pdf

基金项目:国家自然科学基金青年基金项目()辽宁省科学研究项目()作者简介:王天琦 男硕士研究生 研究方向为分子生物学:.通讯作者 女教授博士博士生导师 研究方向为分子微生物与酶工程:.收稿日期:不同信号肽对酿酒酵母蔗糖转化酶 分泌表达水平的影响王天琦 王碧莹 付 彤 陈晓艺 李宪臻 杨 帆(大连工业大学 生物工程学院辽宁 大连)摘 要 目前绝大多数酿酒酵母()菌株利用菊糖生产乙醇的能力有限而蔗糖转化酶 是酿酒酵母水解菊糖的关键酶其分泌水平直接影响酿酒酵母转化菊糖为乙醇的性能 为提高酿酒酵母中蔗糖转化酶 的分泌表达水平利用生物信息学的分析方法选择出 种不同的分泌信号肽包括酿酒酵母内源性、其他菌株来源以及已报道序列优化改造的信号肽将它们融合至 并构建了相应的酿酒酵母 重组菌 其中酿酒酵母内源分泌信号肽 能使蔗糖转化酶 更有效的分泌含有信号肽 的重组菌 的蔗糖酶酶活和菊糖酶酶活相对于含有天然信号肽的原始菌 分别提高 和其利用菊糖产乙醇能力较原始菌提高了 乙醇产量达到./在使用毕赤酵母()分泌信号肽 时蔗糖转化酶 的分泌水平也有提高含有信号肽 的重组菌 较原始菌 的蔗糖酶酶活和菊糖酶酶活分别提高了 和 同时利用菊糖产乙醇能力也提高了 产量达到./最后对重组菌 摇瓶发酵过程中的生物量、蔗糖酶酶活、残糖总量和乙醇产量进行了监测结果表明重组菌 的发酵性能较原始菌 有显著提高 本研究为提高蔗糖转化酶 的分泌水平、构建高效菊糖基乙醇生产菌株提供参考关键词 酿酒酵母蔗糖转化酶 菊糖分泌水平分泌信号肽生物乙醇中图分类号.文献标识码 文章编号 ():./.(.)./.微生物学杂志 年 月第 卷 第 期 ./.燃料乙醇作为一种清洁的生物质能源具有可再生及改善、保护生态环境的作用 以甘蔗、玉米为原料生产乙醇因争粮争地问题发展受到限制 而以纤维素为原料生产乙醇由于其预处理方法成本较高造成工业化生产进程缓慢研究发现富含菊糖的菊芋可以代替玉米淀粉生产乙醇且每吨乙醇的生产成本是利用淀粉生产成本的 菊糖是由 呋喃果糖通过 糖苷键相连而成的多聚果糖 目前仅有少数几种微生物可以利用菊糖生产乙醇并且生产乙醇能力有限 酿酒酵母()具有其他菌株无法比拟的优点如产乙醇能力强、遗传操作平台成熟、抗逆性强、适合大规模生产是利用菊糖产乙醇的首选微生物 目前已有少数几种酿酒酵母被证明能够直接利用菊糖生产乙醇 而蔗糖转化酶 是这些酿酒酵母中分解代谢菊糖的关键水解酶 有研究表明隶属于糖苷水解酶 家族()的蔗糖转化酶 具有菊糖外切酶活力是这些酿酒酵母中分解代谢菊糖的关键水解酶 能够催化菊糖中呋喃果糖苷末端非还原性 呋喃果糖苷残基水解释放出的果糖可以转化为 二磷酸果糖进入糖酵解过程随后启动厌氧发酵生成乙醇研究表明酿酒酵母中蔗糖转化酶表达水平直接影响其转化菊糖产乙醇的效率 因此通过优化分泌表达途径来提高蔗糖转化酶 的分泌表达效率对于提高酿酒酵母发酵菊糖产乙醇的能力至关重要 利用酿酒酵母分泌信号肽增强重组蛋白分泌表达水平是目前最有效的策略之一分泌信号肽位于分泌蛋白的 端由短链氨基酸组成并分为三个不同的区域:个氨基酸组成带正电荷的 端 个疏水氨基酸组成的 核心区 个能被信号肽酶切割的亲水氨基酸组成的 端 很多研究表明使用合适的分泌信号肽对细胞外分泌蛋白的表达至关重要 等使用酿酒酵母信号肽 将 葡聚糖苷酶 和里氏木霉内切葡聚糖酶 的细胞外活性提高至.倍和.倍并且 使毕赤酵母()中 的细胞外活性提高了.倍 等在酿酒酵母 中使用 的启动子和分泌信号肽融合 使其表达量显著提高并有效分泌至周质空间中 研究表明使用一些异源的分泌信号肽也会使目的蛋白的表达量显著提高 等在酿酒酵母中表达人体溶菌酶 时利用人血清蛋白 的分泌信号肽可以很好的指导其分泌 此外还有研究通过对信号肽进行序列优化改造来实现蛋白质分泌水平的提高 等对 信 号 肽 中 个 位 点(、)进 行 突 变 优 化 后 的使两种漆酶 和 的分泌水平相较于未优化的 分别提高了 倍和 倍 为了使 更有效分泌到细胞外选择一种合适的分泌信号肽至关重要 对于不同的分泌信号肽宿主菌株内源的分泌信号肽是很有潜力的候选者因为它们可以保证被宿主的分泌表达系统所识别 已有研究表明 种源自酿酒酵母内源的分泌信号肽、和 能够有效介导酿酒酵母对不同蛋白的分泌另有研究表明来自于毕赤酵母和解脂耶氏酵母的分泌信号肽、和 能够实现多种外源蛋白的高效表达如胰岛素前体、真菌防御素 等 此外近期研究成果还对天然信号肽一级结构进行了优化构建了新型分泌信号肽、和 这些序列均源自分泌蛋白或者质膜表达的蛋白 由此本研究选择 种不同来源的分泌信号肽进行生物信息学的初步筛选及预测随后使用 克隆 微 生 物 学 杂 志 卷()的策略将不同的分泌信号肽与蔗糖转化酶 融合对重组菌进行蛋白质分泌水平、酶活力、分泌效率以及乙醇产量进行分析期望获得菊糖基乙醇高效生产菌株 材料与方法.材料.菌株与质粒 、获赠于大连化学物理研究所赵宗宝研究员课题组 质粒 获赠于中国科学院青岛生物能源与过程研究所 本研究所构建的质粒与重组菌株如表 所示表 本实验涉及的质粒与重组菌信息列表 菌株与质粒基因型质粒 融合有天然信号肽的 表达载体 融合有 信号肽的 表达载体质粒 融合有 信号肽的 表达载体质粒 融合有 信号肽的 表达载体质粒 融合有 信号肽的 表达载体质粒 融合有 信号肽的 表达载体质粒 融合有 信号肽的 表达载体质粒 融合有 信号肽的 表达载体质粒 融合有 信号肽的 表达载体质粒 融合有 信号肽的 表达载体质粒 融合有 信号肽的 表达载体质粒 融合有 信号肽的 表达载体质粒菌株 含有 的 重组菌 含有质粒 的 重组菌 含有质粒 的 重组菌 含有质粒 的 重组菌 含有质粒 的 重组菌 含有质粒 的 重组菌 含有质粒 的 重组菌 含有质粒 的 重组菌 含有质粒 的 重组菌 含有质粒 的 重组菌 含有质粒 的 重组菌 含有质粒 的 重组菌.主要试剂与仪器设备 质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒、山梨醇、蛋白胨等购自上海生工生物工程股份有限公司 酵母浸粉、琼脂粉购自 公司 氯化钠、异丙醇、无水乙酸钠、硫酸镁等购自天津市科密欧化学试剂有限公司 核酸染料购自北京赛百盛生物工程公司 菊糖购自上海蓝季科技发展有限公司 聚 合 酶、聚 合 酶、限制性内切酶(、)等购自大连 公司 其他常规试剂均为分析纯购自上海国药集团 梯度 仪(公司)电转仪(公司)凝胶成像分析系统(美国通用公司)微量分光光度计(美国通用公司)紫外分光光度计(上海元析仪器有限公司)多功能酶标仪(公司)数字式全自动压力灭菌锅(日本 公司).方法.不同分泌信号肽序列的获取与引物的合成 本研究选择的酿酒酵母、解脂耶氏酵母和毕赤酵母的分泌信号肽序列 从 (:/./)和(:/./)获取人工合成及优化改造的分泌信号肽序列从文献中获取为了更好地构建重组载体所有序列均添加了载体和蔗糖转化酶 的一部分送至上海生工生物工程股份有限公司进行合成扩增带同源臂的不同信号肽序列所用引物使用 设计上游引物 序列()为 下游引物 序列()为 送至上海生工生物工程股份有限公司进行合成.生物信息学分析方法信号肽在线预测软件.(:/./)蛋白亲疏水性预测软件 在线软件(:/./).不同分泌信号肽重组质粒的构建及鉴定 使用引物 和 扩增.合成的片段并使用胶回收试剂盒进行纯化 通过 克隆的方法将质粒 上 的原始分泌信号肽替换为目的分泌信号肽 通过电击转化的方法将重组质粒转化至大肠埃希菌 中挑取长势较好的单菌落进行菌落(菌落 引物 和)验证验证正确后送至吉林省库 期 王天琦等:不同信号肽对酿酒酵母蔗糖转化酶 分泌表达水平的影响 美生物科技有限公司测序鉴定.不同分泌信号肽重组菌的构建与鉴定将测序结果正确的重组质粒电击转化至酿酒酵母挑取长势较好的单菌落接入 后使用质粒提取试剂盒提取酿酒酵母质粒通过电击转化的方法转入大肠埃希菌 中挑取单菌落进行菌落(菌落 引物 和)验证验证正确后送至吉林省库美生物科技有限公司测序鉴定.重组菌发酵培养方法 种子液培养方法:从平板挑取重组菌 环接种至 培养基中、/摇床培养 取 种子液接入 菊糖培养基中、/摇床培养 摇瓶发酵培养方法:取 种子液接入菊糖培养基中、/摇床培养并在发酵过程中分别于、取样.蔗糖转化酶 酶活力测定方法 研究表明蔗糖酶 同时具有菊糖外切酶活力因此基于已报道方法为了更加全面的考察 的水解活性本研究同时检测 对蔗糖和菊糖两种底物的活性 重组菌在 菊糖培养基发酵 时取样测定 的蔗糖酶活和菊糖酶活 酶活测定方法:使用./缓冲液(.)将发酵菌液稀释适当倍数取 稀释菌液与 蔗糖或菊糖底物(/.)混匀 反应 采用 法测定酶活重组菌的酶活用还原糖含量表示 蔗糖酶及菊糖酶酶活定义:条件下每分钟水解 蔗糖或 菊糖释放 葡萄糖当量所需要的酶含量为 .分泌效率测定方法发酵液上清蔗糖酶活测定:重组菌在 菊糖培养基发酵 后取发酵液 离心 取发酵液上清液使用./缓冲液(.)稀释适当倍数后按照.方法测定蔗糖酶活 破碎细胞后上清蔗糖酶活测定:重组菌在 菊糖培养基发酵 后取发酵液 离心 弃发酵 液 上 清 后 加 入 等 体 积 缓 冲 液()重悬菌体后加入适量.酸洗玻璃珠利用组织破碎仪进行反复破碎直至 以上酿酒酵母被破碎 随后将破碎液 离心 取破碎液上清使用./缓冲液(.)稀释适当倍数后按照.方法测定蔗糖酶活 的分泌效率由重组菌发酵液上清蔗糖酶活占重组菌总蔗糖酶活的比率来表征其中总蔗糖酶酶活为发酵液上清蔗糖酶活和破碎细胞后上清蔗糖酶活的总和 分泌效率计算具体见公式:分泌效率()()式中:为发酵液上清蔗糖酶酶活为破碎细胞后上清蔗糖酶酶活.重组菌 分析 接种重组菌至菊糖培养基 后收获发酵液浓缩进行 凝胶电泳电转移至 膜封闭液室温封闭 一抗为稀释后的 特异性抗体 过夜孵育室温下 洗 次每次 二抗为用 稀释的羊抗兔 孵育 室温下 洗 次每次 显色显色后用图像处理软件 对 结果进行灰度分析.发酵产乙醇能力的测定取发酵液上清过.滤膜所得滤液进行气相色谱检测气相色谱操作条件:色谱柱为安捷伦(.)顶空方法进行进样加热箱温度为 定量环温度为 传输线温度为 样品瓶平衡时间为 进样持续时间为 循环 进样量 检测器温度 程序升温条件:保持 以 /升至 保持 .发酵液残糖总量测定方法 取 离心所得上清加入 ./溶液和 沸水浴 后加入 ./溶液混匀 采用 法测定还原糖浓度.生物量的测定采用比浊法测定生物量取 重悬发酵液加入 测定在 波长下的吸光值()结果与分析.不同分泌信号肽切割位点及疏水性分析首先从(:/./)和(:/./)数 微 生 物 学 杂 志 卷据库中获得 种不同蛋白的氨基酸序列 如表所示使用 .(:/./)预测以上蛋白氨基酸序列中分泌信号肽序列有实验证明分泌信号肽的疏水核心长度及疏水性也影响蛋白质的分泌表达强疏水性的分泌信号肽能够高效引导新生肽的转运 有研究表明对抗体蛋白阿瓦斯汀()的分泌信号肽疏水区进行改造后用新的疏水性较低的分泌信号肽代替原有的分泌信号肽造成了产量降低 此外 等发现酵母 分泌信号肽疏水核心 与 的比值为 时前体蛋白分泌加工能力最高在此比值附近信号肽分泌加工能力随疏水性的增强而提高 因此使 用(:/./)预测了蛋白的亲疏水性如表 所示 种不同的分泌信号肽的疏水值在 之间均较高 其中疏水值最高的为毕赤酵母黏性蛋白 的分泌信号肽最低的为酿酒酵母内源可溶性细胞壁蛋白 的分泌信号肽 因此本研究选择的 种分泌信号肽可以进行后续实验表 本实验涉及分泌信号肽序列及生物信息学分析 名称 来源蛋白 序列 疏水值内源分泌信号肽 凝集素亚单位.葡聚糖外切酶.磷脂酶.酸性磷酸酶.可溶性细胞壁蛋白.异源分泌信号肽 解脂耶氏酵母的碱性蛋白酶.毕赤酵母细胞壁蛋白.粘蛋白家族成员的蛋白质.优化分泌信号肽 信息素交配因子.信息素交配因子.人工合成的信号肽.内源分泌信号肽对 分泌能力的影响为了确定蔗糖转化酶 最适分泌信号肽首先利用 克隆策略将 种酿酒酵母内源分泌信号肽、及 与 蔗 糖 转 化 酶 融 合 并 转 化 至.中 得到 种重组菌、及 由于蛋白前体跨膜转运效率与分泌信号肽及成熟蛋白质的氨基酸序列相关对于特定的蛋白质疏水性较高的分泌信号肽通常会产生较高的易位效率 由于 的疏水性较高可以合理的预测对于蔗糖转化酶 可以提供较高的跨膜效率首先利用 检测了 种重组菌发酵 后细胞内 的表达水平(图)灰度分析结果如图 所示 种重组菌细胞内 的表达水平与野生型 相似(.)以上结果说明不同分泌信号肽对 细胞内的表达水平几乎没有影响 为了进一步确定不同信号肽对 的分泌能力的影响利用 检测了 种重组菌发酵 后发酵液上清中 的表达水平如图 所示在 处可见明显 条带 灰度分析结果如图 所示其中 中的 表达水平明显最高与预测结果一致说明 可以使 更有效地分泌到细胞外 而 中的 表达水平与野生型 相似、及 中的 表达水平相较于野生型 有所降低 期 王天琦等:不同信号肽对酿酒酵母蔗糖转化酶 分泌表达水平的影响 图 重组菌株菊糖发酵 后 表达水平分析.:胞内中 的蛋白质印迹:胞内 表达水平定量分析:发酵液上清中 的蛋白质印迹:发酵液上清中 表达水平定量分析以 中 的表达量进行归一化处理设置为.:.为观察不同分泌信号肽对 分泌能力的影响测定 种重组菌酶活 在 菊糖发酵条件下、及 的蔗糖酶酶活如图 所示其中蔗糖酶酶活最高的为 相对于未改造分泌信号肽野生型 提高 而 的蔗糖酶酶活相对于野生型则降低了、和 的蔗糖酶酶活与野生型的相似 由于 是酿酒酵母水解菊糖产乙醇的关键酶对该酶以菊糖为底物的酶活进行了测定 在 菊糖发酵的条件下、和 的菊糖酶酶活如图 所示其中最高的 相较于野生型的 提高了 而、和 均与野生型 相似图 重组菌株菊糖发酵 后的蔗糖酶酶活()及菊糖酶酶活().()()“”代表实验菌株与对照存在极显著性差异(.)图、同 (.)并且与菊糖酶酶活结果保持一致 本研究结果与 等学者的研究一致 该团队使用 融合 半乳糖苷酶 的菌株上清液表现出的 活性是野生型的.倍而融合 的菌株上清活性是野生型的.倍 以上结果说明使用 替换 原始分泌信号肽可以有效提高 在酿酒酵母 中的分泌水平图 重组菌株菊糖发酵 后 的分泌效率.为了研究 种重组菌利用菊糖发酵产乙醇的能力利用气相色谱对重组菌发酵液中的乙醇含量进行了测定 种重组菌的乙醇产量如图 所示其中 的乙醇产量最高可达到(.)/相较于野生型 发酵液中的乙醇含量提高了 并且与蔗糖酶酶活及菊糖酶酶活结果一致 而、及 与野生型 的乙醇产量相似(.)同样与菊糖酶酶活结果保持一致 因此使用 融合 的重组菌 的 分泌表达水平显著提高同时 也是一株能够利用菊糖高效产乙醇的重组菌图 重组菌株菊糖发酵 后的乙醇产量分析.异源及优化的分泌信号肽对 分泌能力的影响为了探究酿酒酵母异源分泌信号肽及优化的分泌信号肽对蔗糖转化酶 分泌能力的影响利用 克隆策略将 种酿酒酵母异源的分泌信号肽、及 种优化后的分泌信号肽、融合转化至.中 得到 种重组菌、及 如表 所示其中 的疏水性最高为.根据替换内源分泌信号肽后的结果可以预测对于蔗糖转化酶 而言 将提供更高的跨膜效率从而使 的表达量提高首先本研究利用 检测了 种重组菌发酵 后细胞内 的表达水平(图)灰度分析结果如图 所示 种重组菌细胞内 的表达水平与野生型 相似(.)以上结果与内源信号肽重组菌结果一致进一步验证不同分泌信号肽对 细胞内的表达水平几乎没有影响 为了进一步确定不同信号肽对 的分泌能力的影响利用 检测了 种重组菌发酵 后发酵液上清中 的表达水平如图 所示在 处可见明显 条带 灰度分析结果如图 所示、及 中的 表达水平有明显提高其中 的表达量最高与预测结果一致 而 中的 表达水平与野生型 相似 中的 表达水平相较于野生型 有所降低 期 王天琦等:不同信号肽对酿酒酵母蔗糖转化酶 分泌表达水平的影响 图 重组菌株菊糖发酵 后 表达水平分析.:胞内 的蛋白质印迹:胞内 表达水平定量分析:发酵液上清中 的蛋白质印迹:发酵液上清中 表达水平定量分析以 中 的表达量进行归一化处理设置为.:.为了比较不同异源及优化分泌信号肽和内源分泌信号肽 对 分泌能力的影响在 菊糖发酵的条件下、及 的蔗糖酶酶活如图 所示、及 相较于未改造分泌信号肽的野生型 的蔗糖酶酶活有显著提高其中最高的 较野生型提高了同时 较改造内源分泌信号肽的 提高了 与 的蔗糖酶酶活与野生型相似(.)而 的蔗糖酶酶活则较野生型降低了 在 菊糖发酵的条件下、及 的菊糖酶酶活如图 所示 及 相对于野生型 的菊糖酶酶活有显著提高其中最高的 较野生型提高了 较 提高了 、及 的菊糖酶酶活与野生型相似(.)而 则较野生型降低了 结果表明异源分泌信号肽具有提高 的表达水平的潜力而序列优化改造的信号肽却使 的表达水平显著降低说明不适用于蔗糖转化酶 为验证上述结果对、及 的分泌效率进行了测定 如图 所示分泌效率最高的 较野生型 提高了 分泌效率最低相较于野生型降低了 且与蔗糖酶酶活和菊糖酶酶活结果一致 而、及 的分泌效率与野生型相似(.)因此使用 融合 的重组菌 的 分泌 微 生 物 学 杂 志 卷表达水平显著提高同时 也是一株能够利用菊糖高效产乙醇的重组菌图 重组菌株菊糖发酵 后的蔗糖酶酶活()及菊糖酶酶活().()()“”代表实验菌株与对照存在显著性差异(.)“”代表实验菌株与对照存在极显著性差异(.)图、同 (.)(.)图 重组菌株菊糖发酵 后 的分泌效率.图 重组菌株菊糖发酵 后的乙醇产量分析.摇瓶发酵性能分析为了对先前实验中发酵性能最优异的重组菌 进行进一步表征将 与 分别以 的接种量接种到菊糖培养基进行厌氧发酵在对数生长前期每 取一次样此后每 取一次样对样品生物量、蔗糖酶酶活、残糖总量及乙醇产量进行测定 如图 所示随着菌体不断生长 与 的菊糖消耗量均不断增加两者均在 生物量达到峰值且 显著高于(.)推测是由于 的蔗糖转化酶 表达量提高更有效的利用菊糖供给重组菌生长 随后由于发酵过程中代谢物质的产生如乙醇、乙酸等以上物质不利于菌体生长此后生物量呈现出逐渐下降趋势 与此同时 与 的蔗糖酶酶活随着时间推移逐渐升高可能是由于 在发酵过程中逐渐积累的原因在 时 的蔗糖酶酶活达到(.)/显著高于 的(.)/(.)最后 与 的乙醇产量均在 达到峰值其中 发酵液中的乙醇产量(.)/显著高于 的(.)/(.)且 乙醇生产强度(./()显著高于(./()等在酿酒酵母 的染色体上整合了黑 期 王天琦等:不同信号肽对酿酒酵母蔗糖转化酶 分泌表达水平的影响 曲霉的菊糖内切酶基因并优化了其启动子和信号肽结果表明含有启动子 和信号肽 的重组菌可以有效水解菊糖其利用比本工作初始浓度更高的/菊糖发酵 的乙醇产量达到./与之相比 利用更低浓度的菊糖(/)在相同的发酵时间内生产了更高浓度的乙醇(./)表现出更好的发酵性能 以上结果表明 中蔗糖转化酶 的表达水平显著高于野生型 同时可以更好的利用菊糖生产乙醇图 重组菌株()、()发酵过程中生物量、蔗糖酶酶活、乙醇产量和残糖总量的测定.()()讨 论燃料乙醇是一种可再生的清洁生物质能源其工业化生产对缓解能源压力、保护及改善生态环境具有重要意义 以菊糖为原料利用酿酒酵母生产生物乙醇具有节约生产成本、产量高等优点 其中天然酿酒酵母中利用菊粉的关键水解酶蔗糖转化酶 分泌表达水平较低直接影响其转化菊糖产乙醇的效率无法满足工业需求 本研究为提高酿酒酵母中蔗糖转化酶 的分泌水平选择了 种不同的分泌信号肽包括酿酒酵母内源性、其他菌株来源以及已报道序列优化改造的信号肽随后使用 克隆的策略将 种分泌信号肽与蔗糖转化酶 融合并构建了相应的表达菌株 对所有重组菌的蛋白分泌水平、酶活及乙醇产量的测定结果表明不同的分泌信号肽指导 分泌到细胞外的能力各有不同 其中含有来源于毕赤酵母黏性蛋白信号肽 的重组菌 的蛋白分泌水平、酶活及乙醇产量相对于未改造分泌信号肽的原始菌有显著提高 重组菌 的蔗糖酶酶活与菊糖酶酶活较野生型 分别提高了 和 蔗糖转化酶 的分泌效率提高了 同时重组菌 利用菊糖产乙醇的能力提高了 产量达到./最后对重组菌 摇瓶发酵性能分析时发现发酵 时 的乙醇生产强度达到峰值 乙醇生产强度(./()较野生型(./()提高了 目前越来越多的新策略被用于酿酒酵母的菊糖发酵过程优化、菌种改良及代谢调控中以克服菌株自身局限性 等比较了酸处理菊糖法和菊糖酶水解菊糖后发酵生产乙醇的效果结果表明当用硫酸水解菊芋汁后进行乙醇发酵时其生产能力为./()而用菊糖酶水解菊芋汁后发酵生产乙醇的生产能力为./()等将马克斯克鲁维酵母和假丝酵母外切菊糖酶基因在酿酒酵母中的表达并比较了两种重组子利用菊糖发酵产乙醇的性能结果表明来自于假丝酵母的外切菊糖酶基因更适于构建酿酒酵母工程菌其乙醇生产强度为./()等在酿酒酵母 中异源表达了马克斯克鲁维酵母外切菊糖酶基因并优化改造了其启动子和分泌信号肽结果表明含有启动子 和分泌信号肽 的重组菌利用./菊糖发酵 乙醇产量达到.微 生 物 学 杂 志 卷/乙醇生产强度为./()与以上研究成果相比本研究构建的酿酒酵母重组菌 利用低于文献报道的菊糖浓度(/)发酵时乙醇生产强度(./()更高表现出更好的发酵菊糖产乙醇性能 本研究为提高蔗糖转化酶 的分泌水平、构建高效菊糖基乙醇生产菌株提供参考参考文献:程序.现代生物能源第二波研发和产业化浪潮.中外能源 ():.:.():.周正 曹海龙 朱豫等.菊芋替代玉米发酵生产乙醇的初步研究.西北农业学报 ():.李丽丽 侯英敏 郭小宇等.菊糖酶提高酿酒酵母利用菊糖产乙醇能力的研究进展.食品工业科技 ():.华艳艳 赵鑫 赵金等.圆红冬孢酵母发酵菊芋产油脂的研究.中国生物工程杂志 ():.():.何秀萍.国内酿酒酵母分子遗传与育种研究 年.微生物学通报 ():.():.:.():.():.():.陈龙冠 覃锦红 黄云娜等.信号肽优化对重组抗体分泌表达的影响及研究进展.中国生物工程杂志 ():.():.():.():.():.():.():.():.:.():.():.郭小宇 刘志成 杨帆等.酿酒酵母 利用菊糖生产乙醇发酵条件的研究.微生物学杂志 ():.诸葛健 王正祥.工业微生物实验技术手册.北京:中国轻工业出版社.():.():.期 王天琦等:不同信号肽对酿酒酵母蔗糖转化酶 分泌表达水平的影响 ():.():.().():.():.:.():.():.():.():.微 生 物 学 杂 志 卷