中药中黄曲霉毒素的检测.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,中药中黄曲霉毒素的检测,目录,真菌毒素介绍,黄曲霉毒素概述,黄曲霉毒素现有检测方法介绍,黄曲霉毒素检测药典收载情况,药典检测方法详解,注意事项及试验室提议,中药中黄曲霉毒素的检测,2/39,真菌毒素介绍,真菌毒素,：由产毒真菌在适宜环境条件下产生有毒代谢产物，由真菌菌核产生。,Mycotoxin,：源于希腊语（,Mykes,）和拉丁语（,Toxicum,）,中药中黄曲霉毒素的检测,3/39,常见真菌毒素分类,真菌种类,所产毒素,曲霉属,黄曲霉毒素、赭曲霉毒素,A,镰刀菌属,玉米赤霉烯酮、,T-2,毒素、呕吐毒素、伏马毒素,青霉属,展青霉素、桔青霉素,中药中黄曲霉毒素的检测,4/39,真菌毒素监控意义,真菌毒素对食品安全危害,真菌毒素对种、养殖业危害,真菌毒素对制药行业危害（中药）,国际贸易中作为技术壁垒,在国际反恐和战争中，真菌毒素可作为大规模杀伤性生化武器,中药中黄曲霉毒素的检测,5/39,黄曲霉毒素概述,黄曲霉毒素是黄曲霉和寄生曲霉等菌种产生次生代谢产物,中药中黄曲霉毒素的检测,6/39,黄曲霉毒素发觉,1960,年，在英国东南部一些农场中，有大约,10,万只火鸡不明原由地突然死亡。,1961,年发觉火鸡饲料中混有花生粉能够使大鼠诱发肝癌。,1962,年，研究发觉花生粉中含有一个荧光物质是造成。火鸡死亡病因，这种荧光物质被证实为黄曲霉代谢产物，故命名为“黄曲霉毒素,(Aflatoxins)”,。,中药中黄曲霉毒素的检测,7/39,存在极其广泛,主要存在于土壤，动植物及各种坚果中。家庭自制发酵食品等也经常发觉黄曲霉毒素。,普通在热带和亚热带地域，食品中黄曲霉毒素检出率比较高。,未能及时晒干或储备不妥粮食轻易产生，在农作物正常生长久中也能够形成。,中药中黄曲霉毒素的检测,8/39,毒性极强,1993,年黄曲霉毒素被世界卫生组织（,WHO,）癌症研究机构（,IARC,）划定为,类致癌物，是一个毒性极强剧毒物质，仅次肉毒毒素，是当前已知霉菌中毒性最强。,急性毒性：比氰化钾大,10,倍，比砒霜大,68,倍,慢性毒性：肝脏损害，呈急性肝炎、出血性坏死、肝细胞脂肪变性和胆管增生。脾脏和胰脏也有轻度病变。,中药中黄曲霉毒素的检测,9/39,中药中轻易产生黄曲霉毒素品种,种子、果实、粮谷类中药材,发酵类中药材,动物类中药材,油性成份多中药材,含上述种类药材中成药,中药中黄曲霉毒素的检测,10/39,黄曲霉毒素种类及性质,依据在紫外线照射下产生荧光颜色不一样，分为,B,族,和,G,族,两大类及其衍生物,B,族,G,族,蓝色荧光,黄绿色荧光,中药中黄曲霉毒素的检测,11/39,化学结构,基本结构：是一组化学结构类似,二呋喃香豆素,衍生化合物,当前发觉约,20,余种,，已分离判定出,12,种：,B1,、,B2,、,G1,、,G2,、,M1,、,M2,、,P1,、,Q,、,H1,、,GM,、,B2a,和毒醇。,B1,：最常见、毒性及致癌性最强,中药中黄曲霉毒素的检测,12/39,化学结构式,中药中黄曲霉毒素的检测,13/39,理化性质,黄曲霉毒素相对分子量,312,346,难溶于水，易溶于油、甲醇、丙酮和氯仿等有机溶剂，但不溶于石油醚、己烷和乙醚,在中性及酸性溶液中较稳定，但在,pH,为,1,3,强酸性溶液中稍有分解，在,pH,为,9,10,碱性溶液中分解快速,中药中黄曲霉毒素的检测,14/39,纯品为无色结晶,耐高温，黄曲霉毒素,B1,分解温度为,268,紫外线对低浓度黄曲霉毒素有一定破坏性,中药中黄曲霉毒素的检测,15/39,黄曲霉毒素现有检测方法介绍,薄层层析法：灵敏度低，定量困难,HPLC-,紫外检测法：不衍生，灵敏度低，采取,UPLC,能够增强灵敏度,HPLC-,荧光检测法：需衍生，灵敏度高,高效液相色谱,-,串联质谱法：不需衍生，灵敏度高，假阳性少，成本高,中药中黄曲霉毒素的检测,16/39,免疫化学分析方法,酶联免疫吸附法：,快速、简便、单一毒素、假阳多,免疫亲和柱,-,荧光分光光度法,：高效、无毒、假阳多,微柱筛选法,：半定量，测总量,一步式黄曲霉毒素检测金标试纸法,：快速、现场大批量初筛,中药中黄曲霉毒素的检测,17/39,黄曲霉毒素检测药典收载情况,年增补本附录,第一次增加了黄曲霉毒素测定法,年版一部,正文：僵蚕、陈皮、酸枣仁、桃仁、胖大海品种项下增加了黄曲霉毒素残留量检验,附录：继续收载了黄曲霉毒素测定法,中药中黄曲霉毒素的检测,18/39,年版一部第二增补本,修订了附录方法,删除了流速要求,增订了另一个衍生方法：即光化学衍生法,取消了免疫亲和柱品牌要求,年版四部通则,2351,黄曲霉毒素测定法,增加了第二法：高效液相色谱,-,串联质谱法,增加附注：“当测定结果超出程度时，采取第二法进行确认”,中药中黄曲霉毒素的检测,19/39,年版四部通则增加,中药中真菌毒素测定指导标准,基本标准（中药中真菌毒素分类、监控品种、测定方法、限值确定）,基本内容（高效液相色谱法、高效液相色谱,-,质谱联使用方法）,中药中黄曲霉毒素的检测,20/39,年版四部通则,9302,中药有害残留物限量制订指导标准,中关于黄曲霉毒素要求,“因为黄曲霉毒素毒性强，当前国际上,不提议设定黄曲霉毒素安全耐受量和无毒作用剂量,，也无最大限量理论值计算公式，限量越低越好”。,中药中黄曲霉毒素的检测,21/39,中国药典,年版正文收载品种,根及根茎类：远志,果实种子类：大枣、肉豆蔻、决明子、麦芽、陈皮、使君子、柏子仁、胖大海、莲子、桃仁、槟郎、酸枣仁、薏苡仁,动物类：僵蚕、水蛭、地龙、全蝎、蜈蚣,共,19,种,，较年版药典,增加,14,种,中药中黄曲霉毒素的检测,22/39,黄曲霉毒素药典检测方法详解,液相条件：,C18,，甲醇,-,乙腈,-,水（,40:18:42,）,衍生方式：,柱后碘衍生、柱后光化学衍生,混合对照品溶液制备：,液体标液,（,B,1,B,2,G,1,G,2,=10.310.3 ug/ml,）梯度稀释,500,倍,中药中黄曲霉毒素的检测,23/39,供试品溶液制备：,15g,粉末，,3gNaCl,，,70%,甲醇提取，免疫亲和柱纯化,测定：,吸收混合对照品溶液,5l,、,10l,、,15l,、,20l,、,25l,，注入色谱仪，绘制标准曲线。吸收供试品溶液,20-25l,，测定,中药中黄曲霉毒素的检测,24/39,方法起源：,中国药典,年版四部通则,2351,黄曲霉毒素测定法,基本步骤,提取,净化（活化、上样、洗杂、洗脱）,测定,随行质量控制（质控样、随行加样回收）,中药中黄曲霉毒素的检测,25/39,泵流操作架,免疫亲和柱,HPLC-,荧光检测器,光化学衍生器,自动固相萃取仪,中药中黄曲霉毒素的检测,26/39,净化步骤,取,15ml,（离心后提取液），加水至,50ml,滤过，取,20ml,，经过免疫亲和柱，,流速,3ml/min,加水洗涤两次，每次,10ml,过空气,10,秒，将水挤出柱子,分次加甲醇,1.5ml,，自然洗脱，过空气，定容至,2ml,中药中黄曲霉毒素的检测,27/39,免疫亲和柱原理,利用,抗原抗体免疫反应,原理，使用大剂量单克隆抗体，选择性将样品提取液中黄曲霉毒素吸附，用水将杂质洗脱除去，再用甲醇定量将黄曲霉毒素洗脱，到达分离净化目标,黄曲霉毒素,单克隆抗体,杂质,中药中黄曲霉毒素的检测,28/39,黄曲霉毒素衍生化,衍生原因,黄曲霉毒素,B,1,、,G,1,荧光遇水要淬灭,，检测前需要衍生化,中药中黄曲霉毒素的检测,29/39,药典附录收载两种衍生方法,碘衍生法：碘作为衍生剂，对衍生温度有要求，试剂对仪器有腐蚀性，需要冲洗,光化学衍生法：紫外光灯（,254nm,）照射，操作简单，对衍生温度无要求，不需要其它衍生剂，无需冲洗,对黄曲霉毒素,B1,和,G1,进行衍生,，黄曲霉毒素,B2,和,G2,不受该衍生步骤影响,中药中黄曲霉毒素的检测,30/39,AFB,1,AFG,1,黄曲霉毒素衍生化,中药中黄曲霉毒素的检测,31/39,黄曲霉毒素衍生化,中药中黄曲霉毒素的检测,32/39,结果汇报,低于检测限（标出检测限）,汇报详细值,未检出,程度内,程度外,汇报详细值,中药中黄曲霉毒素的检测,33/39,方法难点,痕量分析,ppb,级，要求高灵敏度,毒性强，含有一定风险性,安全防护办法,基质复杂,中药中黄曲霉毒素的检测,34/39,注意事项,取样代表性,黄曲霉毒素在样品中分布不均匀,免疫亲和柱使用,储存、使用温度（使用说明书）,安全防护,操作人员专门培训，全程穿工作服佩戴手套,注意事项及试验室提议,中药中黄曲霉毒素的检测,35/39,对照品使用,使用黄曲霉毒素混合对照品,，不使用黄曲霉毒素固体纯品自行配置,对照品贮备液避光、低温、密闭保留，,工作液现配现用,中药中黄曲霉毒素的检测,36/39,试验废弃物处理,残留有黄曲霉毒素废液或废渣玻璃器皿，应泡在专用贮存容器（含,10%,次氯酸钠溶液内，,浸泡,24,小时,以上，再用清水将玻璃器皿冲洗洁净）,流动相单独搜集，先用次氯酸钠灭毒，再按常规处理,中药中黄曲霉毒素的检测,37/39,试验室提议,专门仪器设备和场所,安全办法,废弃物,中药中黄曲霉毒素的检测,38/39,谢谢！,中药中黄曲霉毒素的检测,39/39,