重组乙型肝炎疫苗(酿酒酵母).doc

重组乙型肝炎疫苗（酿酒酵母）
Chongzu Yixing Ganyan Yimiao (Niangjiu Jiaomu)
Hepatitis B Vaccine Made by Recombinant DNA Techniques in Saccharomyces CerevisciaeYeast

本品系由重组酵母菌表达的乙型肝炎(简称乙肝)病毒表面抗原（HBsAg）经纯化、加入铝佐剂制成，用于预防乙型肝炎。
1 基本要求
生产和检定用设施、原材料及辅料、水、器具、动物等应符合“凡例”有关要求。
2 制造
2.1 生产用菌种
2.1.1 名称及来源
生产用菌种为美国默克公司以DNA重组技术构建的表达HBsAg的重组酿酒酵母原始菌种，菌种号为2150-2-3（pHBS56-GAP347/33）。
2.1.2 种子批的建立
应符合“生物制品生产和检定用菌毒种管理规程”规定。
由美国默克公司提供的菌种经扩增1代为主种子批，主种子批扩增1代为工作种子批。
2.1.3 种子批检定
主种子批及工作种子批应进行以下项目的全面检定。
2.1.3.1 培养物纯度
培养物接种于哥伦比亚血琼脂平板和酶化大豆蛋白琼脂平板，分别于20~25℃和30~35℃培养5~7天，应无细菌和其他真菌被检出。
2.1.3.2 HBSAg基因序列测定
应与美国默克公司提供菌种的HBSAg基因序列保持一致。
2.1.3.3 质粒保有率
采用平板复制法检测。将菌种接种到复合培养基上培养，得到的单个克隆菌落转移到限制性培养基上培养，计算质粒保有率，应不低于95%。
PR%= [A /（A+L）] ×100
式中 PR为质粒保有率，（％）；
A为在含腺嘌呤的基本培养基上生长的菌落数，CFU/皿；
A+L为在含腺嘌呤和亮氨酸的基本培养基上生长的菌落数，CFU/皿
2.1.3.4 活菌率
采用血细胞计数仪器， 分别计算每毫升培养物中总菌数和活菌数，活菌率应不低于50%
活菌率=活菌数/总菌数×100%
2.1.3.5抗原表达率
取种子批菌种扩增培养， 采用适宜的方法将培养后的细胞破碎，分别用Lowry法测定破碎液的蛋白质含量， 并采用酶联免疫法或其他适宜方法测定HBsAg含量。抗原表达率应不低于0.5%
抗原表达率=抗原含量/蛋白含量×100%
2.1.4 菌种保存
主种子批和工作种子批菌种应于液氮中保存，工作种子批菌种保存于-70℃应不超过6个月。
2.2 原液
2.2.1 发酵
取工作种子批菌种，于适宜温度和时间经锥形瓶、种子罐和生产罐进行三级发酵，收获的酵母菌应冷冻保存。
2.2.2 培养物检定
2.2.2.1 培养物纯度
同2.1.3.1项。
2.2.2.2 质粒保有率
平板复制法测试的质粒保有率应不低于90%。
2.2.3 培养物保存
于－60℃以下保存不超过6个月。
2.2．4 纯化
用细胞破碎器破碎酵母菌，除去细胞碎片，以硅胶吸附法粗提HBsAg，疏水层析法纯化HBsAg，经硫氰酸盐处理后，稀释和除菌过滤后即为原液。
2.2.4 原液检定
按3.1项进行。
2.2.5 原液保存
于2－8℃保存不超过3个月。
2. 3 半成品
2.3.1甲醛处理
原液中按终浓度为100μg/ml加入甲醛，于37℃保温适宜时间。
2．3.2 铝吸附
每微克蛋白和铝剂按一定比例置2-8℃吸附适宜的时间，用无菌生理氯化钠溶液洗涤去上清后再恢复至原体积， 即为铝吸附产物。
2.3.3 半成品配制
蛋白质浓度为20.0~27.0 µg/ml的铝吸附后原液可与铝佐剂等量混合后，即为半成品。
2. 3. 3 半成品检定
按3.2项进行。
2. 4 成品
2.4.1 分批
应符合“生物制品分批规程”规定。
2.4.2 分装
应符合“生物制品分装和冻干规程”规定。
2.4.3规格
每瓶0.5 ml、1.0 ml。每1次人用剂量0.5 ml（含HBsAg 5 µg或10µg）或1.0 ml（含HBsAg 10 µg）。
2.4.4 包装
应符合“生物制品包装规程”规定。
3 检定
3.1 原液检定
3.1.1无菌检查
依法检查（附录XⅡ A）， 应符合规定。
3.1.2 蛋白质浓度
应为20.0~27.0 µg/ml（附录VI B二法）。
3.1.3 特异蛋白带
依法测定(附录IV C)，采用非还原性SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，还原性电泳，上样量为0.5μg，银染法染色， 分离胶浓度为15%，上样量为0.5μg，银染法染色应有分子量为20~25kD蛋白带，可有低于24kD蛋白带及HBsAg二聚体蛋白带。
3.1.4 N末端氨基酸序列测定（每年至少进行一次该项测定）
N末端氨基酸序列应为…………….
3.1.5 纯度
采用免疫印迹法测定（附录 VIII A），所测供试品不得出现国家药品检定机构认可以外的酵母杂蛋白；采用高效液相色谱法（附录III B），亲水硅胶高效体积排阻色谱柱；排阻极限1000kD；孔径45nm， 流动相：pH7.0含0.05%叠氮钠，0.1%SDS的磷酸盐缓冲液；上样量：100μl；检测波长：280nm。HBsAg含量应不低于99.0%，或杂蛋白应不高于1.0%。
3.1.6 细菌内毒素检查
应小于10EU/ml（附录XⅡ E 凝胶限量试验）。
3.2 半成品检定
3.2.1 吸附完全性
取供试品于6500g离心5分钟取上清，依法测定（附录 X A）参考品、供试品及其上清中HBsAg含量。以参考品HBsAg含量的对数对应其吸光度值(或响应值)对数进行直线回归，相关系数应不低于0.99，将供试品及其上清的吸光度值(或响应值)代入回归方程，计算其HBsAg含量，再按下式计算吸附率，应不低于95%。
Cs
P％=100 － ───×100
Ct
式中 P为吸附率（%）；
Cs为供试品上清的HBsAg含量（µg/ml）；
Ct为供试品的HBsAg含量（µg/ml）
3.2.2 化学检定
3.2.2.1硫氰酸盐含量
将供试品于6500 g 离心5分钟，取上清。分别取含量为1.0、2.5、5.0、10.0 µg/ml的硫氰酸盐标准溶液、供试品上清、生理氯化钠溶液各5.0 ml于试管中，每一供试品取2份，在每管中依次加入硼酸盐缓冲液（pH9.2）0.5 ml，2.25 %氯胺T-生理氯化钠溶液0.5 ml，50 %吡啶溶液（用生理氯化钠溶液配制）1.0 ml，每加一种溶液后立即混匀，加完上述溶液后静置10分钟，以生理氯化钠溶液为空白对照，在波长415 nm处测定各管吸光度。以标准溶液中硫氰酸盐的含量对应其吸光度均值进行直线回归，计算相关系数，应不低于0.99，将供试品上清的吸光度均值代入回归方程，计算硫氰酸盐含量，应小于1.0 µg/ml。
3.2.2.2 Triton X-100含量
将供试品于6500 g 离心5分钟，取上清。分别取含量为5、10、20、30、40 µg/ml的Triton X-100标准溶液、供试品上清、生理氯化钠溶液各2.0 ml于试管中，每一供试品取2份，每管分别加入5%（V/V）苯酚溶液1.0 ml，迅速振荡，室温放置15分钟。以生理氯化钠溶液为空白对照，在波长340 nm处测定各管吸光度。以标准溶液中Triton X-100的含量对应其吸光度均值进行直线回归，计算相关系数，应不低于0.99，将供试品上清的吸光度均值代入回归方程，计算Triton X-100含量，应小于15 µg/ml。
3.2.2.3 pH值
应为5.5~7.2（附录V A）。
3.2.2.4游离甲醛含量
应小于20 µg/ml（附录VI L）。
3.2.2.5 铝含量
应为0.35~0.62 mg/ml（附录VⅡF）。
3.2.2.6 渗透压摩尔浓度
应为 280±65 mOsmol/L（附录 V H）。
3.2. 3无菌检查
依法检查（附录XⅡ A），应符合规定。
3.2.4 细菌内毒素检查
应小于5 EU/ml（附录XⅡ E 凝胶限量试验）。
3.3 成品检定
3.3.1 鉴别试验
采用酶联免疫法检测，应证明为HBsAg。
3.3.2 外观
应为乳白色混悬液体，可因沉淀而分层，易摇散，不应有摇不散的块状物。
3.3.3 装量
按附录I A 装量项进行， 应不低于标示量。
3.3.4 化学检查
3.3.4.1 pH值
应为5.5~7.2（附录V A）
3.3.4.2 铝含量
应为0.35~0.62 mg/ml（附录VⅡF）。
3.3.5 体外相对效力测定
应不低于0.5（附录X A）。
3.3.6 无菌检查
依法检查（附录XⅡ A），应符合规定。
3.3.7 异常毒性检查
依法检查（附录XⅡ F），应符合规定。
3.3.8 细菌内毒素检查
应小于5 EU/ml（附录XⅡ E 凝胶限量试验）。
4 保存、运输及有效期
于2~8℃避光保存和运输。自生产之日起， 有效期为36个月。
5 说明书