实验室常用载体介绍(Gateway技术)课件.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,载体构建的基本原理,1.TA克隆(T4连接酶),Promega 的T-easy载体（pGEM-T Easy）,TAKRA T载体(pMD18-T),2.TOPO,TA克隆(pCR8/GW/TOPO),定向克隆(pENTR),3.酶切连接,实验室常用,4.Gateway 技术,TOPO异构酶,1.创建入门克隆，通过PCR或传统的克隆方法将目的基因克隆进入门载体。,2.混合包含目的基因的入门克隆和合适的目的载体及Gateway LR Clonase酶，产生表达克隆。,致死基因：DB 3.1,Gateway attB引物,att,B1,5-GGGGACAAGTTTGTAC,AAAAAA,GCAGGCT,NN,-3,att,B2,5-GGGGACCAC,TTTGTA,CAAGAAAGCTGGGT,N,-3,Proline rich protein like protein(PRPL),Sense primer,GGGGACAAGT,TTGTACAAAA,AAGCAGGCTA,TGAACATAAG,CCCCCTGTC,Antisense primer,GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCCATAAGCACTCTCGCTAGT,酶切连接载体,超表达,pCAMBIA2300S,启动子,pBIN m-gfp5-ER和pBI121,Gateway技术载体,超表达,pGWB401,pGWB501,pGWB402,pGWB502,pGWB402,pGWB502,可能都要做融合蛋白了，与gfp或者his标签，这样以后就可以做WESTERN了。这边他们的超表达都是做的融合蛋白，不过要事先确定融合基因放在还是，免得影响其功能。如果不确定就两种同时做。,RNAi,启动子,启动子（截短策略）,attL1,attL2,pDONR201+promoter,棉花自己的启动子？,诱导表达,怎么工作的？,我们怎么用？,可以用在哪些地方？,loxP 34bp CRE gene,Glucocorticoid GR intron,EGFP,效率低的问题：,连接反应效率低？,BP、LR反应效率低？,转化效率低？,切记抗生素,邓锋林负责载体的保管,谭家福负责相关酶的管理,每个人只给划平板,转基因过程中的注意事项,大小皿及滤纸不能混用,转基因的共培皿及一些摇菌的三角瓶灭完菌再洗,转基因所挑的克隆块，每个克隆块分化苗的棵数,烟草转基因的假阳性问题（抗生素）,拟南芥的转化,公共卫生：到完皿之后，继完代之后，配完培养基之后,转基因苗移栽,