免疫细胞功能的测定.pptx

,#,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,免疫细胞功能的测定,免疫细胞功能的测定,第1页,T,细胞增殖功效测定,基础理论,本技术用于评定,T,细胞对各种刺激增殖能力。,T,细胞增殖能力是反应,T,细胞功效一个主要指标。,免疫细胞功效测定,免疫细胞功能的测定,第2页,T,细胞功效测定,刺激,T,细胞增殖原因及意义,1.,特异性抗原：引发寡克隆活化增殖。,克用于判断抗原免疫效果（疫苗接种）和回想反应能力，也能反应,T,细胞总体功效。,2.,丝裂原：多克隆。,3.,刺激信号转导分子：多克隆。,免疫细胞功能的测定,第3页,T,细胞增殖功效测定,T,细胞增殖测定方法,1.,显微镜下观察细胞形态与细胞计数。,2.,放射性核素掺入试验。,细胞增殖时，,DNA,复制，须从培养液中补充核苷酸。用放射性核素标识培养液中提供胸腺嘧啶（,3,HTdR,），当,DNA,复制时，,3,HTdR,掺入正在分裂细胞,DNA,中。细胞增殖程度与细胞内掺入,3,HTdR,量成正比。经过用液闪仪定量测定培养细胞中放射性强度，就能够确定,T,细胞增殖能力与强度。,免疫细胞功能的测定,第4页,丝裂原诱导增殖反应,诱导,T,细胞增殖反应丝裂原,1.PHA,（植物血凝素）,2.Con A,（刀豆蛋白,A,）,3.PMN,（美洲商陆）,T,细胞增殖功效测定,免疫细胞功能的测定,第5页,丝裂原诱导增殖反应,技术方法,1.,用,RPMI,10,将,PBMC,配成,1x10,6,/ml,悬液。,2.,用,100g/ml,PHA,配制,1:10,、,1:20,和,1:40,稀释液。,3.96,孔板中选择一行（共,12,孔），每孔中加入,100,l,细胞。指定每相邻,3,孔为一组。前,3,组分别加入一个稀释度,PHA,溶液，最终一组加培养液（对照组）。,4.37,C,，,5,CO,2,，,54h,。,5.,配制浓度为,50,ci/ml,3,HTdR,。,T,细胞增殖功效测定,免疫细胞功能的测定,第6页,丝裂原诱导增殖反应,6.,每孔加入,50,ci,3,HTdR,，继续培养,18h,。,7.,用多孔自动搜集仪分别搜集每孔细胞于一小管中。溶解细胞，将,DNA,过滤到滤纸上，洗去未掺入,3,HTdR,，最终用,100,甲醇洗涤，以利滤纸干燥。,8.,将滤纸放入液闪管内，自动计数，打印结果。,9.,扣除本底，计算每一组,3,个复本平均数。,T,细胞增殖功效测定,免疫细胞功能的测定,第7页,丝裂原诱导增殖反应,影响原因,1.,细胞活力：冷冻技术影响细胞活力，复苏后应检验细胞活力。,2.,培养液中添加血清：有些血清可能激活或抑制细胞增殖。如欲测定人体细胞增殖能力，可采取灭活,AB,血清。,3.,细胞培养板类型：依据细胞数量采取不一样形状底部培养板。,4.,微生物污染：可降低细胞增殖能力。,T,细胞增殖功效测定,免疫细胞功能的测定,第8页,单向混合淋巴细胞培养反应,原理,T,细胞受体能够识别同种异型,MHC,分子。当把,2,个不一样个体单个核细胞在体外混合时，能够相互刺激，引发增殖。增殖强度与二者之间,MHC,差异程度成正比。所以同种异型混合淋巴细胞反应强度反应,2,个个体之间,MHC,差异程度，而且因为相互识别与增殖，结果是,2,个个体淋巴细胞增殖能力总和。这种试验就是,双向混合淋巴细胞培养试验。,将参加反应之一方单个核细胞用放射性核素照射，使其失去反应能力，但仍保留刺激能力，成为刺激细胞，则此时反应结果仅反应另一方（反应方）增殖能力。在实质性器官移植时，只需了解受者淋巴细胞对供者,MHC,反应能力，所以适合采取,单向混合淋巴细胞培养反应,。,T,细胞增殖功效测定,免疫细胞功能的测定,第9页,单向混合淋巴细胞培养试验,方法,1.,分离宿主与供者,PBMC,，调整细胞浓度为,1 x 10,6,/ml,。,2.,刺激细胞灭活：用丝裂霉素（终浓度,25,g,，,37,C,，,5,C,，,30min,）或放射性核素照射（,rad,）方法处理刺激细胞。,3.96,孔板中，每孔加入,1x10,5,刺激细胞和,1x10,5,反应细胞。,37,C,，,5,CO,2,，,4,6d,。加,3,HTdR,，继续培养,18h,。阳性对照孔加反应细胞和丝裂原，不加刺激细胞。阴性对照孔只加照射本身细胞。,3,复本。,4.,搜集细胞，液闪仪计数，打印结果。,T,细胞增殖功效测定,免疫细胞功能的测定,第10页,单向混合淋巴细胞培养,5.,计算相对反应（,RR,）,（试验组,cpm,阴性对照组,cpm,）,RR,阳性对照组,cpm,阴性对照组,cpm,T,细胞增殖功效测定,免疫细胞功能的测定,第11页,单向混合淋巴细胞培养,注意点,1.,细胞活力：使用冷冻细胞时，复苏后应检验细胞活力。,2.,培养液中添加血清：有血清可能会刺激或抑制反应。,3.,本底应小于,rpm,，阳性对照组应大于,0 rpm,。,T,细胞增殖功效测定,免疫细胞功能的测定,第12页,抗原诱导特异性增殖反应,原理,本试验测定,T,细胞在体外对某一特定抗原特异性免疫应答能力。所用抗原能够是首次接触抗原，也能够是曾经免疫过抗原。常见测定回想反应抗原有纯化蛋白衍生物（,PPD,）和破伤风类毒素（,TT,）。这,2,种抗原都被常规列入计划免疫接种范围，成人应该对它们有回想反应。在一些免疫缺点病中，对它们特异性回想反应可减弱或消失。,T,细胞增殖功效测定,免疫细胞功能的测定,第13页,免疫细胞功能的测定,第14页,抗原诱导特异性增殖反应,方法,（以,T,细胞对破伤风类毒素刺激增殖反应为例）,1.,分离,PBMC,和,APC,，,APC,用丝裂霉素或放射性核素处理。,2.96,孔板中每孔加入,1x10,5,PBMC,和,1x10,4,APC,。,3.,每孔中加入系列稀释破伤风类毒素溶液，不一样孔中抗原终浓度分别为,0,、,1,、,5,、,10,和,20,g/ml,。每一个浓度设,3,复本。,4.37C,，,5,CO,2,，,6,天。,5.,加,3,HTdR,，继续培养,18,小时。计数。,T,细胞增殖功效测定,免疫细胞功能的测定,第15页,抗原诱导特异性增殖反应,结果解释,1.,对于接种过破伤风疫苗者来说，本试验结果呈低反应反应患者对破伤风类毒素特异性应答能力低下或全身免疫缺点。,2.HIV,感染者反应低下反应,CD4,+,T,细胞降低造成免疫缺点。,T,细胞增殖功效测定,免疫细胞功能的测定,第16页,抗原诱导特异性增殖反应,注意点,1.,培养液中最好用人,AB,血清。,2.,此,T,细胞增殖反应需要,APC,。如使用纯化,T,细胞，需加,5,10,本身,APC,。,T,细胞增殖功效测定,免疫细胞功能的测定,第17页,抗原诱导特异性增殖反应,应用实践,1.,丝裂原诱导增殖反应,临床上用于评定,T,细胞对多克隆刺激剂增殖能力，反应,T,细胞基础免疫功效，即,T,细胞群总体信息，不能反应个别,T,细胞克隆情况,PHA,常见于测试人,T,细胞增殖能力，,Con A,常见于测试小鼠,T,细胞增殖能力。,T,细胞增殖功效测定,免疫细胞功能的测定,第18页,抗原诱导特异性增殖反应,应用实践,2.,单向混合淋巴细胞反应,1,）本方法主要用于预计器官移植前供体与受者之间,MHC,相配程度。,2,）如培养时间超出,96,小时，可制备细胞毒性,T,细胞（,CTL,）。,T,细胞增殖功效测定,免疫细胞功能的测定,第19页,抗原诱导特异性增殖反应,应用实践,3.,抗原诱导特异性增殖反应,用于预计机体对特异性抗原应答能力和机体总体免疫应答能力。,T,细胞增殖功效测定,免疫细胞功能的测定,第20页,B,细胞产生抗体能力测定,基础理论,B,细胞受到多克隆激活剂或特异性抗原刺激后，活化、增殖，最终分化成为浆细胞，产生抗体。抗体能够在血浆和其它体液中检出，检测抗体是测定,B,细胞功效最主要方法。,B,细胞分类：,B1,细胞和,B2,细胞。二者发生学不一样、接收刺激抗原不一样，对,T,细胞依赖性不一样。,因为,B2,细胞反抗原应答依赖,T,细胞，所以，,B,细胞产生抗体能力低下，其缺点也可能起源于,T,细胞缺点。,免疫细胞功能的测定,第21页,丝裂原诱导多克隆抗体产生能力测定,基础理论,人,B,细胞含有,PWM,受体，在体外受到,PWM,刺激时，发生多克隆激活，产生多克隆抗体。,B,细胞产生抗体能力能够用,ELISA,测定培养上清中抗体量预计，也能够用,ELISPOT,方法测定产生抗体,B,细胞数量预计。,B,细胞产生抗体能力测定,免疫细胞功能的测定,第22页,丝裂原诱导多克隆抗体产生能力测定,技术方法与评价,1.,分离,PBMC96,孔板中每孔加入,1x105,细胞和,PWM,终浓度（,1,：,100,）。阴性对照孔内不加,pWM,。每一试验设,2,复本。,2.37C5,CO2,培养,10,天（,ELISA,）或,7,天（,ELISPOT,）。,3.,搜集上清，用,ELISA,法测抗体。搜集细胞，用,ELISPOT,法测产生抗体,B,细胞。,B,细胞产生抗体能力测定,免疫细胞功能的测定,第23页,丝裂原诱导多克隆抗体产生能力测定,应用实践,1.,用于确定,B,细胞活化和分化信号转导机制，以及细胞因子和其它银子对,B,细胞分化影响。,2.,因为,B2,细胞产生抗原需要,T,细胞辅助，所以又能够用于检测,T,细胞辅助功效。,3.,临床上用于研究免疫缺点病和本身免疫病患者,B,细胞分化异常机制。,B,细胞产生抗体能力测定,免疫细胞功能的测定,第24页,丝裂原诱导多克隆抗体产生能力测定,注意点,采取以抗体为基础技术（如磁珠法、淘洗法和流式细胞仪）分离,B,细胞，需考虑抗体对,B,细胞产生抗体影响（促进或抑制作用）。,B,细胞产生抗体能力测定,免疫细胞功能的测定,第25页,ELISPOT,法,基础理论,ELISPOT,全称为酶联免疫斑点试验（,enzyme,linked immunospot assay,），可用于测定产生,IgG,和,IgM,抗体,B,细胞。其方法是用抗原包被固相，然后加入抗原特异性,B,细胞。假如,B,细胞产生抗体，抗体与板上抗原结合。加入酶标二抗和显色剂就会显色。一个斑点就代表一个产生抗体细胞。,B,细胞产生抗体能力测定,免疫细胞功能的测定,第26页,ELISPOT,法,技术方法,1.,抗原包被：,37C2h,，或,4C,过夜。固相载体可用聚苯乙烯平皿、亚硝酸纤维膜、,96,孔板。,2.,抗体生成细胞培育：加入适量抗体生成细胞，,37C,，,5,CO,2,，,3,4h,，或过夜。洗涤，去除为与固相结合细胞。,3.,测定斑点产生细胞：加二抗，,37C,，,5,CO,2,，,2,3h,。加辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶和底物显色。,4,计数：,24h,后用,10,30,倍显微镜下计数斑点形成细胞。,B,细胞产生抗体能力测定,免疫细胞功能的测定,第27页,ELISPOT,法,评价,1.,在操作中应使用无关抗原作阴性对照；病应排除细胞标本终抗体污染。,2.,硝酸纤维素膜灵敏度高于聚苯乙烯。,3.,与,ELISA,联合使用，能够预计单个细胞抗体产量。,4,当淋巴细胞受到严重污染时，也能够使用本法，所以适合用于测定组织中抗体生成细胞。,应用实践,用途同,ELISA,法。本方法可用于任何可溶性抗原。,B,细胞产生抗体能力测定,免疫细胞功能的测定,第28页,ELISA,测定各类免疫球蛋白,基础理论,B,细胞受抗原刺激后，最初产生,IgM,抗体，然后在,Th,细胞产生各种细胞因子作用下，可转类成为,IgG,、,IgA,、,IgE,类抗体。应用不一样单抗，结合,ELISA,方法，能够测定,B,细胞产生抗体类别。,B,细胞产生抗体能力测定,免疫细胞功能的测定,第29页,ELISA,测定各类免疫球蛋白,方法,1.,包板：,96,孔板用浓度为,10,g/ml,特异性单抗包被。盖上盖板，,37C,，,5,CO,2,，,2h,，或,4C,过夜。常规洗板，封闭。,2.,上样：每孔内加入,1:10,或,1:20,稀释细胞培养上清液,100,l,。阳性对照为标准品，阴性对照为培养液。每试验设,2,复本。室温培育,2h,，或,4C,过夜。,3.,加酶标二抗：每孔加,100,l,碱性磷酸酶标识羊抗人,IgM,或,IgG,或,IgA,二抗。室温培育,2h,，或,4C,过夜。,4.,显色：洗板，每孔加,100,l,底物（,p,nitrophenyl phosphate,）。,5.,自动酶标仪读数，从标准曲线读出抗体浓度。,B,细胞产生抗体能力测定,免疫细胞功能的测定,第30页,ELISA,测定各类免疫球蛋白,评价,ELISA,法灵敏、简单、快速、特异性高、重复性好，是测定上清和体液中,Ig,首选方法。碱性磷酸酶标识二抗显色显著，无须用碱中止反应，尤其适合用于测定体外产生抗体。,应用实践,ELISA,可测定各种体液中抗体，其结果反应被检个体,B,细胞功效。测定免疫球蛋白各种亚类水平有利于判定免疫缺点病。,B,细胞产生抗体能力测定,免疫细胞功能的测定,第31页,CTL,杀伤功效测定,基础理论,CTL,为细胞毒性,T,淋巴细胞简称。是,CD8,T,细胞识别,APC,表面,MHC I,类分子递呈肿瘤或病毒特异性抗原肽后，分化形成。当,CTL,碰到对应肿瘤细胞或病毒感染细胞时，能够经过细胞接触机制或裂解机制杀伤靶细胞。,免疫细胞功能的测定,第32页,CTL,杀伤功效测定,1.,细胞接触机制,CTL,表示,FasL,，靶细胞表示,Fas,，,FasL,与,Fas,配接，经过,Fas,传入信号激活靶细胞内细胞凋亡路径，造成靶细胞死亡。,2.,细胞裂解机制,CTL,激活后，胞质内颗粒向,2,个细胞接触点移动。颗粒膜与细胞膜融合经过外吐释放颗粒内容物。穿孔素插入靶细胞膜后聚合，喜爱细胞膜上形成孔，造成细胞裂解。颗粒酶诱导靶细胞凋亡。,免疫细胞功能的测定,第33页,CTL,杀伤功效测定,51,Cr,标识法原理,如在将靶细胞与,CTL,混合之前，先用放射性核素,51,Cr,培育，,51,Cr,能穿过细胞膜进入胞浆，与胞浆中小分子蛋白质牢靠结合，不能自由从细胞内释放。当靶细胞膜被,CTL,破坏后，,51,Cr,被释放进入上清。因为上清中放射性强度与细胞杀伤程度呈正比，经过测定上清中放射性强度，就能够判定,CTL,杀伤能力。,免疫细胞功能的测定,第34页,免疫细胞功能的测定,第35页,CTL,杀伤功效测定,技术方法,1.,从肿瘤组织中分离淋巴细胞和肿瘤细胞。,2.,51,Cr,标识肿瘤细胞。,3.96,孔培养板每孔中加入淋巴细胞和靶细胞，效：靶比为,50:1,，,25:1,，,12.5:1,。另设最大释放对照（靶细胞加去污剂）和自发释放对照（不加,CTL,）。,4.37C,，,5,CO,2,，,4h,。,5.,搜集上清，,计数器测定,放射活性（,cpm,）。,免疫细胞功能的测定,第36页,CTL,杀伤功效测定,计算公式,试验组平均,CPM,值自发释放组平均,cpm,值,溶解,最大释放平均,cpm,值自发释放平均,cpm,值,注意点,因为,CTL,杀伤靶细胞受,MHC,限制，所以靶细胞必须来自本身，或选取表示适当,MHC,肿瘤细胞系。,评价,优点,：,方法简单、快速，能定量,。,缺点,：,自然释放率较高，需要靶细胞量多。使用放射性核素。,免疫细胞功能的测定,第37页,CTL,杀伤功效测定,应用实践,这一方法常见于评定肿瘤患者,CTL,杀伤肿瘤能力，可作为判断雨后和观察疗效指标之一。,免疫细胞功能的测定,第38页,NK,细胞毒性测定,基础理论,NK,细胞存在于外周血、淋巴组织中，尤以脾脏最为丰富。因细胞体积大和胞浆内含大量颗粒，故称大颗粒淋巴细胞。表型特征是,CD16,（,Fc,RIII A,）,和,CD56,（神经细胞粘附分子）。当,NK,细胞识别肿瘤细胞活病毒感染细胞时，,CD16,分子被交联，引发脱颗粒，并分泌,IFN,和,TNF,。颗粒中含有穿孔素、颗粒酶和,proteoglycans,，引发靶细胞溶胀性死亡和凋亡。,NK,细胞,CD16,与,IgG1,和,IGg3,结合，可介导,ADCC,作用。,NK,细胞表示一个能识别,HLA,A,、,B,、,C,抗原受体，向细胞发出一致性信号，阻止,NK,细胞杀伤活性。当靶细胞不表示或低表示,HLA I,类分子时，抑制解除，,NK,细胞活化，杀伤靶细胞。,K562,细胞系不表示,HLA,分子，对,NK,细胞杀伤作用敏感，常见作,NK,细胞靶细胞，用于检测,NK,细胞活性。,免疫细胞功能的测定,第39页,NK,细胞毒性测定,技术方法,1.NK,细胞分离：用抗,CD3,、,CD19,、,CD14,单抗和淘洗法，去除,T,细胞、,B,细胞和,Mo,，获取,NK,细胞。,2.,加板：方法同,CTL,杀伤试验。不一样是，靶细胞为,K562,细胞。最大释放组为靶细胞中加去污剂，自发释放对照组中不加,Nk,细胞。,37C,，,5,CO,2,，,4h,。,3.,搜集上清液，,计数器测各孔,cpm,值。,4.,计算溶解值：方法同,CTL,法。,免疫细胞功能的测定,第40页,NK,细胞毒性测定,评价,1.,本方法稳定，但,51,Cr,污染环境。,2.,从外周血中 分离,NK,细胞是静止细胞，只能杀死对峙敏感,K562,细胞系，不能杀伤其它肿瘤细胞。,3.,冷冻保留影响,NK,细胞活性，故宜采取新鲜分离,NK,细胞。,4.,人血清中含有,IgG,会抑制,NK,细胞杀伤活性，故培养液中宜使用小牛血清。,免疫细胞功能的测定,第41页,NK,细胞毒性测定,应用实践,检测,NK,细胞免疫活性。在疾病状态下，,NK,细胞功效会受到影响。,免疫细胞功能的测定,第42页,LAK,细胞毒性测定,基础理论,LAK,细胞是淋巴因子激活杀伤细胞简称。,NK,细胞在大剂量,IL,2,刺激下扩增并分化成为,LAK,细胞。,LAK,细胞对新鲜分离肿瘤细胞或肿瘤细胞系含有非特异性杀伤作用。临床上用,LAK,细胞过继性治疗一些肿瘤患者，比如肾细胞癌、黑色素瘤合霍奇金病，有一定疗效。,免疫细胞功能的测定,第43页,LAK,细胞毒性测定,技术方法,1.,制备：抽取患者外周血,20ml,，分离,PBMC,。培养皿中加入重组,IL,2,，是终浓度为,100U/ml,。,37C,，,5,CO2,，培养，每,3,4,天换液；细胞数增加时分瓶。,2.,培养,7,10,天。搜集细胞，计数。细胞需要量为,10,9,10,10,。,3.LAK,细胞毒性检测：方法同,NK,细胞毒性检测，不一样是，本方法使用靶细胞为肿瘤细胞系,Daudi,细胞。,免疫细胞功能的测定,第44页,LAK,细胞毒性测定,应用实践,1.,用于检测,NK,细胞功效：正常人,NK,细胞在大剂量,IL,2,作用下能够分化成为,LAK,细胞。,NK,细胞功效缺点者，分化能力降低。检测,LAK,细胞活性能够作为衡量,NK,细胞功效活性指标。,2.,检测,LAK,细胞细胞毒性：预测,LAK,细胞功效活性。,免疫细胞功能的测定,第45页,