NY∕T 3288-2018 菵草对乙酰辅酶A羧化酶抑制剂类除草剂靶标抗性检测技术规程(农业).pdf

ICS 65.100 B17 NY 中华人民共和国农业行业标准NY/T 3288一2018商草对乙酷辅酶A竣化酶抑制剂类除草剂靶标抗性检测技术规程Guideline for the detection of Beckmannia syzigachne (Steud.) Fernald target-site resistance to acetolactate synthase inhibiting herbicides 2018-07 -27发布2018-12一01实施(! 中华人民共和国农业农村部发布目。吕本标准按照GBjT1. 1-2009给出的规则起草。本标准由中华人民共和国农业农村部提出并归口。本标准起草单位:中国农业科学院植物保护研究所。本标准主要起草人:崔海兰、李香菊、黄兆峰、王京京、魏守辉、于惠林。NY j T 3288-2018 I NY/T 3288-2018 商草对乙酷辅酶A竣化酶抑制剂类除草剂靶标抗性检测技术规程范围本标准规定了菌草Beckmannias zyme A carboxylase, ACCase)抑本标准适用于商草对乙2 规范性引用文件下列文件对于本件。凡是不注日期NY/ T 1667 NY/ T 185 3 NY/ T 1 3. 1 靶标抗性由于除草3.2 杂3. 3 整株生通过整株杂草地上部生物量受除草3.4 生长抑制中量使杂草生物量降低50%3.5 抗性指数r臼istanceindex (RI ) 对乙酷辅酶A竣化酶(acetyl-coen-、结果分析及注意事项。关检测。除草剂对杂草疑似抗药性种群与敏感种群的生长抑制中量的比值。3.6 靶标基因突变阳电仕sitegene mutation 由于靶标基因DNA分子中碱基对的取代，导致mRNA的某一密码子发生变化，从而引起编码的氨基酸变成另-种氨基酸，最终导致靶标酶多肤链中的氨基酸序列发生改变。4 检测程序4. 1 种子采集1 NY/T 3288-2018 当商草种子成熟时，在疑似发生抗药性的田块采集种子。采样田块应具有代表性，面积不小于667m2，成熟种子量不少于2000粒。及时晾干采集的种子，装人种子保存罐，置于阴凉干燥处保存。4. 2 材料培养选择无菌草种子、无除草剂残留的农田地表土，混合20%30%的草炭土，混合均匀后装人直径不小于10cm的培养钵;待测种群及敏感对照种子经过O.05%0.1%的赤霉素溶液浸泡12h24 h，冲洗干净，分别定量均匀撒播在土壤表面，覆土O.2 cmO. 5 cm，采用盆钵底部渗灌方式补充水分;置于150C250C，光照时间8h10 h条件下培养。待商草长至2叶期，间苗，每盆保留长势一致的10个植株。4.3 生物测定4.3. 1 单剂量盟别法待植株长至3叶期，用待测除草剂(ACCase抑制剂类除草剂)进行茎叶喷雾处理，除草剂剂量采用敏感种群的最低致死剂量，每个处理不少于4次重复，每个重复30株。用药21d后，调查存活株数，按式(1)计算株防效(%)。式中:E=旦X 100. (1) NT E一-存活植株数占总处理植株数的百分比，单位为百分率(%); NL一一处理后存活植株数，单位为株;NT一一处理植株总数，单位为株。4. 3. 2 剂量反应曲线法经单剂量盟别法检测而明确有抗性的植株，进行繁殖，获得的种子用剂量反应曲线法进一步检测抗药性指数。待植株长至3叶期，用待测除草剂(ACCase抑制剂类除草剂)进行茎叶喷雾处理，药剂处理至少设置5个剂量，每个剂量不少于4次重复，每个重复10株。以杂草鲜重或干重为指标，建立剂量反应方程，按式(2)计算生长抑制中量。式中:D-C y=C十(2)1 + (X/GRso)b Y 一一在除草剂处理下杂草地上部分鲜重或干重与对照鲜重或干重的百分比，单位为百分率(%);C 一一待测指标下限，单位为百分率(%); D 待测指标上限，单位为百分率(%); X 除草剂剂量，单位为克每公顷(g/hm2); GRso 生长抑制中量，单位为克每公顷(g/hm2); b 一一斜率。按式(3)计算抗药性指数RI。GR RI = 一旦旦 (3) GRsos 式中:RI 一一抗药4性指数;GRSOR一-抗药性种群生长抑制中量，单位为克每公顷(g/hm2); GRsos一一敏感性种群生长抑制中量，单位为克每公顷(g/hm2)。4. 4 靶标基因检测4.4. 1 DNA提取NY / T 3288-2018 取杂草幼嫩叶片，约200mg，采用十六烧基三甲基澳化镀(CTAB)法或商品化试剂盒提取总DNA。每个抗药性种群随机检测10个20个抗药性植株。用1%琼脂糖凝胶电泳检测提取的DNA质量是否合格，电泳出现一条清晰明亮的条带，表示DNA较完整，无降解。DNA样品的纯度及浓度检测:用分光光度计测定DNA溶液在260nm处的吸光值(ODZ60)0 ODZ60 值等于1时，样品中DNA浓度为50g/mL。按式(4)计算DNA浓度。CDNA = ODZ60 X A X 50 (的, ，iiLU凶式中:CDNA一-DNA浓度，单位为微克每毫升(g/mL); ODZ60一-DNA溶液在260nm处的吸光值;A 一一稀释倍数。通过测定DNA溶液在260nm和280nm处的吸光值(ODZ60和ODZ80)检测DNA纯度，ODZ60/ODZ80值在1.72. 0之间，表明DNA的纯度较好。经过电泳和吸光度检测，质量和纯度符合要求的DNA样品可用于后续检测。4. 4. 2 聚合酶链式反应(PCR)用l对特异性引物扩增菌草ACCase，上下游引物序列分别为:5 - AAACTCTGGTGCTCGGA T-TG-3和5-T AGGCTTCCA TTTGCTCCC - 3 ，扩增片段大小为1308忡。PCR反应体系如下:2.5mmol/L的dNTP混合液2L，10 X PCR Buffer 2. 5L，10mol/L的引物各O.5L，5 U/L的TaqDNA聚合酶O.5L，提取的待测DNA样品1L，加人18L无菌蒸馆水至反应体系为25LoPCR反应条件如下:950C加热5min，使DNA裂解变性;进入反应循环，在每一个循环中，950C裂解30s，580C退火30s, 720C延伸1min，共35个循环;最后720C延伸5rnin，使产物延伸完整。PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，判断产物片段大小与预期是否相符，根据条带亮度和有无杂带，判断产物浓度和扩增特异性。4.4.3 PCR产物测序PCR产物的电泳检测结果符合预期时，采用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒对产物进行回收纯化，纯化后的PCR产物送测序公司测序，测序引物分别为上述引物对。5 结果分析5. 1 单剂量盟别结果分析喷施最低致死剂量的除草剂21d后调查株防效，敏感对照全部死亡，说明检测结果有效。如果待测种群有存活植株，说明产生抗性，通过调查株防效可以初步了解该采样点是否产生抗性及抗性比例。5. 2 剂量反应曲线结果分析根据RI值判断抗药性水平高低。5. 3 靶标基因检测结果分析测序峰图序列与大穗看麦娘(Aloecurusm yosuroides H uds. ) (GenBank上的登记号为AJ310767)和菌草(GenBank上的登记号为KF501577)的ACCase序列进行比对，分析靶标基因突变的位点。目前在抗ACCase抑制剂类除草剂的杂草中发现有7个位点氨基酸被取代与抗性相关，分别是1781位异亮氨酸被亮氨酸/缴氨酸/苏氨酸取代;1999位色氨酸被半脱氨酸/亮氨酸/丝氨酸取代;2027位色氨酸被半脱氨酸取代;2041位异亮氨酸被天冬酷胶/绩氨酸取代;2078位天冬氨酸被甘氨酸取代;2088位半脱氨酸被精氨酸取代;2096位甘氨酸被丙氨酸/丝氨酸取代(氨基酸序列以大穗看麦娘为参照)。靶标基因序列的测序峰图中上述位点发生相应的突变，即判断为有靶标抗性。3 NY / T 3288-2018 5. 4 抗药性判断如果检测结果中5.1、5.2和5.3均满足条件，p判断为靶标抗t性;如果5.1和5.2检测结果为有抗性，5.3检测结果为没有发生突变的情况，判断可能是非靶标抗性。6 注意事项6. 1 剂量反应曲线法中除草剂剂量的设置，应根据预实验来确定，敏感和抗药性种群的剂量可以不完全一致。6.2 PCR反应体系和反应条件，因所使用讲剂和付嚣的不同而有所差异，需要前期预备试验摸索适合各自实验室的最佳条件。6. 3 测序峰图中，在76. 4 随着抗药性机理面呢标晴在lSrI有报酬-恒最新研究报道来判断结果。4 goN|N的HFZ中华人民共和国农业行业标准南草对乙酷辅酶A搓化酶抑制剂类除草剂靶标抗性检测技术规程NY/ T 3288- 2018 * 中国农业出版社出版(北京市朝阳区麦子店街18号楼)(邮政编码100125网址.ccap. corn. cn) 北京印刷一厂印刷新华书店北京发行所发行各地新华书店经销9号争夺导开本880rnrnX1230rnrn 1/16 印张O.75 字数15千字2018年11月第1版2018年11月北京第1次印刷书号16109 4587 定价18.00元争e争等版权专有僵权必究举报电话[phone]