不同成熟度烤烟萜类物质含量及相关基因研究.pdf

中国烟草科学 Chinese Tobacco Science 2023,44(4):79-86 DOI:10.13496/j.issn.1007-5119.2023.04.011 不同成熟度烤烟萜类物质含量及相关基因研究 刘 芳1，宋笑龙1，马浩波1，孟智勇1，宗胜杰1，王 宏2*，张 昭1，田洪彰3（1.河南省农业科学院烟草研究所，河南 许昌 461000；2.河南省烟草公司洛阳市公司，河南 洛阳 471000；3.山东临沂烟草有限公司费县分公司，山东 临沂 276000）摘 要：为探究不同成熟度烤烟萜类物质代谢规律及与烟叶内在品质的关系，以中烟 100 为试验材料，采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术对萜类物质合成与降解关键基因表达量进行测定，利用气-质联用仪（GC-MS）检测烤后烟叶萜类物质及其降解产物，同时对烟叶感官质量进行评价。研究结果显示，随着成熟度的增加，烟叶腺毛脱落加剧，类胡萝卜素降解关键基因 PAL 表达量呈上升趋势，类胡萝卜素含量逐渐下降；西柏烷类物质含量与相关基因 DXR、CYP71D16、C4H、CHS表达量变化趋势基本一致，整体呈现“先升后降”，并在完熟期达到高峰。中、上部烟叶均以完熟烟叶的感官质量评价最优，与萜类物质合成及相关基因表达上调密切相关，起到了柔和烟气、提质增香的作用。生产上中烟 100 宜在成熟采收基础上推迟 57 d，使烟叶成熟度达到完熟，可有效提高中上部烟叶内在品质及工业可用性。关键词：成熟度；烤烟；萜类化合物；基因表达；烟叶品质 中图分类号：S572.01 文献标识码：A 文章编号：1007-5119（2023）04-0079-08 Study on the Content of Terpenoids and Related Genes in Flue-cured Tobacco with Different Maturity Levels LIU Fang1,SONG Xiaolong1,MA Haobo1,MENG Zhiyong1,ZONG Shengjie1,WANG Hong2*,ZHANG Zhao1,TIAN Hongzhang3(1.Tobacco Research Institute of Henan Academy of Agricultural Sciences,Xuchang,Henan 461000,China;2.Henan Tobacco Company Luoyang Company,Luoyang,Henan 471000,China;3.Shandong Linyi Tobacco Co.,Ltd.,Fei County branch,Linyi,Shandong 276000,China)Abstract:In order to explore the relationship between the biosynthesis and catabolism of terpenoids in flue-cured tobacco of different maturity levels and the intrinsic quality of tobacco leaves,using Zhongyan 100 as the test material,real-time fluorescence quantitative PCR(RT-PCR)technology was used to measure the expression levels of key genes for terpenoid synthesis and degradation,and gas chromatography-mass spectrometry(GC-MS)detection technology was used to detect terpenoids and their degradation products after modulation and processing.At the same time,the smoking quality of tobacco leaves was evaluated.The results showed that as maturity increased,the shedding of glandular hairs intensified,the content of carotenoids and the expression level of PAL gene increased gradually;The content of siberians and genes expression level of DXR,CYP71D16,C4H,CHS showed a“increase first and then decrease”trend,and reached the peak during the ripening period.The sensory quality evaluation of the fully mature tobacco leaves in the middle and upper parts was the best.Maturation was found to be closely related to the upregulation of gene expression related to the synthesis of terpenoids,playing a role in softening smoke and improving quality and aroma.In tobacco production,it is recommended to further delay the harvest of tobacco leaves by 5-7 days on the basis of mature harvest,so that the maturity of the tobacco leaves can reach fully maturity,which can effectively improve the intrinsic quality and industrial usability of middle and upper tobacco leaves.Keywords:maturity;flue-cured tobacco;terpenes;gene expression;tobacco quality 香气是评价烟叶内在质量的核心内容和重要指标。烟叶烤后散发出来的细腻清新的香气大多来源于致香前体物质的降解，萜类是其中重要一类。烟草中萜类致香前体物主要有类胡萝卜素（四萜类化合物）、类西柏烷类和赖百当类（二萜类化合物）1-3。赖百当类化合物一般只存在于香料烟和部分雪茄烟中，西柏烷类4-6则是由烤烟表皮腺毛合成并分泌产生，调制后主要降解为茄酮及其衍生物7。类胡萝卜素属于四萜化合物，其降解产物是烤烟中性致香物质的重要组成成分，并且香味物质阈值相对较低、刺激性较小、香气质较好，能够使烟叶产生木香、花香、果香和甜香等诸多特色香气8-9。前人大 基金项目：河南省农业科学院自主创新项目（2022ZC19）作者简介：刘 芳（1992-），女，助理研究员，硕士，主要从事烟草调制与加工工作。E-mail：。*通信作者，E-mail： 收稿日期：2023-03-30 修回日期：2023-06-01 80 中国烟草科学 2023年第44卷 量研究了萜类化合物合成和降解途径10-12，也有部分学者对萜类化合物合成关键酶基因13-14进行分析，但关于不同成熟阶段的烤烟萜类化合物相关基因表达与烟叶品质综合分析的报道较少。成熟度是影响烟叶品质的重要因素，采收成熟度偏低或偏高会导致烤后烟叶表现出青杂气、刺激性重，香气不足，口味寡淡等弊端，严重影响烟叶原料的工业可用性15-19。只有深入研究致香物质在不同成熟度的差异规律，才能精准把握烟草采收最佳成熟度20-22。中烟 100 是河南烟区的主栽品种，本项目针对中烟 100 不同成熟度腺毛特性和叶面分泌物合成关系进行差异性分析，并分析了萜类化合物合成和降解通路中相关酶基因表达的差异性，结合不同成熟度烤后烟叶香气物质含量开展比对分析，以期探明烟叶的最适采收期，为进一步提高烤烟香气质量和工业可用性奠定基础。1 材料与方法 1.1 试验材料 试验于 2022 年在河南省农业科学院烟草研究所试验田开展，试验品种为中烟 100。试验地块肥力中等、均匀一致，行株距为 1.2 m0.5 m，其他田间栽培管理及病虫害防治按照当地优质烟生产技术规程实施。试验烤房为密集烤房，符合 DB43T 16352019 密集烤房建设及配套设备技术规范标准。烤房装烟室规格为：8.0 m2.7 m3.5 m。1.2 试验设计 以 1618 叶位和 1013 叶位分别代表上部叶和中部叶作为研究目标，以常规成熟采收为对照，根据实际生产，设置采收成熟度差异梯度试验，成熟度设置及外观标准如表 1。表 1 不同成熟度标准 Table 1 Criteria for different maturity levels 处理 Treatment 外观特征 Appearance characteristics 11 采收时间 Harvest time T1 初熟 叶面颜色绿中泛黄，叶片落黄 60%，主脉除叶基部基本全白，茸毛脱落较少，叶面发亮，茎叶角度小于 90，微下垂。较生产上提前 35 d T2 成熟（对照）具备明显可辩认成熟特征，叶面绿黄色，叶片落黄 70%，主脉基本全白，茸毛开始脱落，出现成熟斑，茎叶角度呈 90下垂。生产上常规采收期 T3 完熟 叶片落黄 80%，主脉基本全白，支脉变白 50%，叶耳黄绿色。叶面皱缩，绒毛脱落明显，成熟斑较多。有焦边现象。较生产上延迟采收 57 d T4 过熟 叶面基本全黄，叶片落黄大于 90%，叶脉全白，支脉基本变白，叶面皱缩明显，绒毛基本脱落，叶尖叶缘有明显枯焦现象。较生产上延迟采收 911 d 分别在各部位叶片不同成熟度阶段，取 5 株代表性烟株的鲜烟叶，沿主脉两侧截取8片直径为5 cm的圆形叶片混合用于叶表面分泌物的提取与检测，同时取 10 cm 左右的长条状叶片混合用于腺毛密度观察、类胡萝卜素测定和 RNA 的提取，每个处理重复 3 次。其他叶片按照设定成熟度采收后，分别以三段式工艺在相同的烘烤条件下进行调制，烤后各处理样品分别取 2 kg 用于常规化学成分测定、香气成分测定及感官质量评价。1.3 测定项目与方法 1.3.1 烟叶腺毛形态观察及腺毛密度统计 用FAA 固定液固定烟叶，每个样本做 3 次重复，经 0.2%罗丹明染料染色 30 min 后，用清水去除未结合的罗丹明 B，通风条件下自然晾干，沿着叶片中部主脉两侧 1 cm 处剪取 1 cm1 cm 左右的叶片组织，使用超景深显微镜观察并拍照，观察腺毛形态并对腺毛密度进行统计。1.3.2 类胡萝卜素含量测定 采用95%乙醇浸提，分光光度计法检测23。1.3.3 西柏烷二萜醇的测定 取样后采用气相色谱-质谱联用仪（Agilent 7890-5977）按照行业标准YC/T 4702013 进行西柏烷二萜醇含量的测定与分析，每个处理重复 3 次。1.3.4 烟叶总RNA的提取 采用RNA提取试剂盒（TaKaRa MiniBEST Plant RNA Extraction Kit）提取参试烟叶的总 RNA，将提取的 RNA 用适量的DEPC 水（经焦碳酸二乙酯处理过并经高温高压灭菌的超纯水）溶解后，置于80 冰箱保存备用。1.3.5 萜类化合物合成关键酶基因表达量测定 采用 One Step RT-PCR 反应试剂盒（TaKaRa One 第 4 期 刘 芳等：不同成熟度烤烟萜类物质含量及相关基因研究 81 Step TB Green PrimeScript RT-PCR Kit）在同一反应管内连续进行 RNA 的反转录和 PCR 扩增反应，每个处理重复 3 次。根据 GenBank 发布的 DXR、CYP71D16、PAL、C4H、CHS、4CL 和 L25（内参基因）序列设计基因扩增引物（见表 2）。qRT-PCR反应体系为 20 L：2PCR Buffer 10 L，TaqHS 0.4 L，Mix 0.4 L，正反向引物各 0.4 L，50 ROX 0.4 L，Total RNA 2 L，ddH2O 6 L。扩增反应条件：42 5 min，95 10 s（前两步为反转录反应）；95 变性 5 s，60 延伸 34 s，40 个循环；95 15 s，60 1 min，95 15 s，根据 Ct值计算相对表达量。表 2 荧光定量 PCR 引物序列 Table 2 Sequences of fluorescence quantitative PCR primers 基因 Gene 上游引物（5-3）Upstream primer（5-3）下游引物（5-3）Downstream primer（5-3）DXR TTGCTGAAGCCCGGAAAAC GAACCAGCAGCTAGTGCAACA CYP71D16 ACTGCATCCTCCACTACCTC CAGGGCAAATTCTCCTTCCG PAL CTCACTGGTTTTGGTGCTACT AGGCTGCAACTCGAAAAATC C4H GGCAATCCCTCTTTTAGTCCC CTCCTACCAACAAACCCTGGA CHS TCAAAGCACTTACCCTGATTAT CTATCCAAGTGGGTGTCATTG 4CL GAACTCAAATCGAACGAATC ATGACCCTCCTGAAAATTGTTTAC L25（内参）TGAGGACAACAACACCCTTG GGCAACGTCCAAAGCATCAT 1.3.6 萜类化合物降解的中性致香物质含量测定 以二氯甲烷为萃取溶剂，采用 Agilent 7890-5977 气相-色谱质谱联用仪离子扫描内标（北京微标标物公司）相对定量法对烘烤调制后烟叶的中性致香物质进行定性定量分析18，每个处理重复 3 次。1.3.7 常规化学成分测定 不同成熟度烟叶采集后通过同一工艺进行烘烤处理，利用连续流动分析仪，参照行业标准 YC/T 1592002 测定总糖、还原糖，YC/T 1602002 测定烟碱，YC/T 1612002测定总氮，YC/T 1622002 测定氯含量，YC/T 1732003 测定钾含量。1.3.8 感官质量评价 各处理烘烤后的烟叶经过恒温恒湿回潮，切丝，卷制成（90015）mg/支、长度为 85 mm/支的单料烟支。由评吸专家参照行业标准 YC/T 1381998 对香气质、香气量、杂气、浓度、劲头、刺激性、余味、燃烧性和灰色 9 个单项指标进行打分，取其平均值，采用专家咨询法并借鉴相关研究方法24，对 9 个指标分别赋以 25%、15%、12%、10%、10%、13%、10%、2.5%和 2.5%的权重，采用加权平均法计算各处理的感官质量综合分值。1.4 数据分析 采用 Excel 2010、SPSS 19.0 进行处理与分析。2 结 果 2.1 不同成熟度烟叶腺毛形态密度分析 腺毛按其形态可分为长柄腺毛、短柄腺毛和保护毛，一般认为，腺毛密度大、腺毛分泌物多的烤烟吃味醇和、香气浓郁7。腺毛形态如图 1 所示，腺毛密度统计详见表 3。图 1 不同处理烟叶腺毛形态 Fig.1 Glandular hair morphology in flue-cured tobacco under different treatments 82 中国烟草科学 2023年第44卷 表 3 不同处理烤烟腺毛密度 Table 3 Glandular hair density in flue-cured tobacco with different treatments 叶位 Position 处理 Treatment 长柄腺毛/(根mm-2)Long stalked glandular hair 短柄腺毛/(根mm-2)Short stalked glandular hair 保护毛/(根mm-2)Guard hair 总量/(根mm-2)Total 长柄腺毛/短柄腺毛 Long stalked glandular hair/Shortstalked glandular hair 中部叶 T1 17.90 a 7.08 a 4.75 a 29.73 a 2.53 a T2 15.34 b 6.40 b 4.68 ab 26.42 b 2.40 b T3 11.17 c 5.57 c 4.11 b 20.85 c 2.01 c T4 6.51 d 4.17 d 3.17 c 13.85 d 1.56 d 上部叶 T1 17.24 a 6.42 a 4.00 a 27.66 a 2.69 a T2 14.83 b 5.75 b 3.67 a 24.25 b 2.58 b T3 11.04 c 4.68 c 3.33 bc 19.05 c 2.36 c T4 7.34 d 3.09 d 3.00 c 13.43 d 2.38 d 注：不同小写字母表示差异显著（p0.05）。下同。Note:Different lowercase letters indicate significant differences(p上部叶。表 4 不同处理烤烟类胡萝卜素含量 Table 4 Carotenoid content in flue-cured tobacco under different treatments 叶位 Position 处理 Treatment 类胡萝卜素含量 Carotenoid content/(gg-1)上部叶 T1 84.47 a T2 63.97 b T3 42.33 c T4 34.02 d 中部叶 T1 109.22 a T2 91.66 b T3 54.83 c T4 39.66 d 2.3 不同成熟度鲜烟叶西柏烷二萜醇含量 西柏三烯二醇是烟草表面腺毛最主要的分泌物，一般认为，西柏三烯二醇含量越高，烟叶香气越醇11。从图 2 可知，中部叶-西柏三烯二醇（-CBD）随着成熟度的提高呈现先升高后降低的趋势，T3 处理含量达到最高，分别较 T1、T2、T4高出 13.77%、6.91%、2.42%；-西柏三烯二醇（-CBD）随着成熟度的提高呈现不断降低的趋势；(+)-西柏三烯二醇含量在 T3 处理时最高，显著高于其他3个处理。上部叶-CBD、-CBD、(+)-CBD含量变化趋势与中部叶一致，-CBD 含量 T3 处理最高，T3 和 T4 处理均显著高于 T1、T2，-CBD含量 T1 处理最高，且不同处理间差异显著；(+)-CBD 含量 T3 处理最高，达到 289.89 g/g。注：不同小写字母表示差异显著（p0.05）。下同。Note:Different lowercase letters indicate significant differences(p上部叶，与 2.3 中西柏烷二萜醇的研究结果相一致。2.6 不同成熟度烤后烟叶常规化学成分差异 从表 6 可知，随着成熟度的增加，上部叶总糖、还原糖呈先升高后降低的趋势，以 T3 处理最高，且显著高于其他 3 个处理。总氮含量逐渐降低，各处理的钾离子、氯离子和烟碱含量差异不显著，其中烟碱含量（3.55%3.96%）偏高。中部叶总糖、还原糖呈先升高后降低的趋势，以 T2 处理最高，各处理的总氮、烟碱、氯离子含量差异不显著，钾离子含量 T3 处理显著高于 T1、T2、T4，分别高出16.84%、17.89%、15.79%。从化学成分协调性25来看，上部叶 T3 处理的糖碱比、钾氯比均最高，各处理的氮碱比差异不大；中部叶糖碱比、氮碱比、钾氯比均以 T3 处理最高。结果表明，在一定范围内，成熟度的增加有利于总糖和还原糖含量及糖碱比和钾氯比的提升，使烤后烟叶化学成分更协调。图 3 不同处理萜类化合物合成与降解关键基因表达量 Fig.3 Expression levels of key genes for synthesis and degradation of terpene compounds under different treatments dcddcdcccccbaabababbabac0510152025CYP71D16DXRPALC4H4CLCHS相对表达量Relation expression上部叶 Upper leafT1T2T3T4cbbdbcabbcbbbabaaaccabcb012345CYP71D16DXRPALC4H4CLCHS相对表对量Relation expression中部叶 Middle leafT1T2T3T484 中国烟草科学 2023年第44卷 表 5 不同处理烤后烟叶萜类化合物降解的中性致香物质含量 Table 5 Contents of neutral aroma components degraded by terpenes in flue-cured tobacco leaves with different treatments g/g 萜类化合物 Terpenoid 降解产物 Degradation products 上部叶 Upper leaves 中部叶 Middle leaves T1 T2 T3 T4 T1 T2 T3 T4 类胡萝卜素类 大马酮 0.253 0.215 0.205 0.226 0.377 0.213 0.260 0.179 二氢大马酮 0.001 0.001 0.003 0.002 0.004 0.002 0.003 0.001 3-羟基-大马酮 0.060 0.061 0.056 0.027 0.047 0.108 0.075 0.075 香叶基丙酮 3.455 4.360 3.128 2.976 3.282 4.361 1.001 2.767 巨豆三烯酮 1 4.714 3.937 3.644 3.655 13.084 5.365 5.983 3.228 巨豆三烯酮 2 0.762 0.728 0.721 0.736 8.363 1.691 1.483 0.698 巨豆三烯酮 3 2.611 1.700 2.197 1.787 5.351 3.382 3.236 1.479 巨豆三烯酮 4 2.121 1.200 1.707 1.092 4.864 2.882 2.747 0.992 异佛尔酮 3.039 3.470 3.400 3.540 3.618 3.964 3.768 3.003 氧化异佛尔酮 8.090 3.668 2.225 1.919 5.436 6.553 4.506 0.841 二氢-2-甲基-3(2H)-呋喃酮 0.001 0.001 0.002 0.001 0.004 0.001 0.001 0.001 二氢猕猴桃内酯 0.636 0.740 0.609 0.428 0.645 0.740 0.655 0.580 6-甲基-2-庚酮 0.245 0.341 0.216 0.231 0.168 0.190 0.204 0.218 6-甲基-5-庚烯-2-酮 0.243 0.367 0.248 0.237 0.422 0.442 0.378 0.282 6-甲基3,5庚二烯-2-酮 0.960 0.881 1.093 0.821 2.029 1.561 1.148 0.863 3-羟基-2-丁酮 1.917 2.195 2.614 1.786 5.746 1.153 1.689 1.617 芳樟醇 0.045 0.157 0.153 0.134 0.160 0.157 0.135 0.100 3-呋喃甲醛 0.009 0.005 0.003 0.007 0.008 0.003 0.003 0.010 2-甲基香豆酮 0.754 1.387 0.409 0.767 2.586 1.403 0.964 2.902 紫罗兰酮 0.020 0.033 0.222 0.139 0.041 0.032 0.072 0.046 3,4-脱氢-紫罗兰酮 0.005 0.004 0.007 0.001 0.009 0.006 0.002 0.006 香豆酮 0.014 0.011 0.009 0.004 0.011 0.011 0.004 0.004 2-己烯醛 2.915 2.114 2.040 0.865 1.100 0.643 1.376 2.337 2-环戊烯-1,4-二酮 4.568 1.202 1.088 1.039 1.240 1.324 1.157 1.170 2-环己烯-1-醇 0.159 0.025 0.017 0.037 0.012 0.015 0.012 0.115 2-环己烯-1-酮 0.010 0.005 0.011 0.015 0.012 0.005 0.012 0.003 2-甲基香豆酮 0.754 1.387 0.409 0.253 2.586 1.403 0.964 2.902 螺岩兰草酮 0.008 0.008 0.005 0.003 0.005 0.006 0.013 0.013（E,E)-2,4-庚二烯醛 0.266 0.247 0.276 0.106 0.269 0.306 0.258 0.319 合计 38.694 30.509 26.772 22.868 61.526 38.027 32.183 26.824 西柏烷类 茄酮 28.630 30.029 31.361 29.544 33.994 38.556 46.739 41.461 表 6 不同处理烤后烟叶常规化学成分 Table 6 Conventional chemical components of flue-cured tobacco leaves with different treatments 叶位 Position 处理 Treatment 总糖/%Total sugar 还原糖/%Reducing sugar 总氮/%Total nitrogen 钾/%Potassium 氯/%Chlorine 烟碱/%Nicotine 糖碱比 Sugar/nicotine 氮碱比 Nitrogen/nicotine 钾氯比 Potassium/chlorine 上部叶 T1 25.33 bc 15.92 b 1.96 a 0.78 a 0.46 a 3.89 a 4.09 b 0.47 a 1.74 c T2 26.07 b 15.91 b 1.83 b 0.81 a 0.43 a 3.96 a 4.02 b 0.49 a 1.80 bc T3 29.45 a 17.57 a 1.63 c 0.89 a 0.41 a 3.68 a 4.77 a 0.44 a 2.18 a T4 24.79 c 15.81 c 1.61 c 0.85 a 0.42 a 3.55 a 4.45 a 0.45 a 2.02 b 中部叶 T1 22.81 b 14.76 b 1.76 a 0.79 b 0.41 a 2.65 a 5.91 b 0.66 a 1.92 bc T2 25.88 a 15.83 a 1.72 a 0.78 b 0.42 a 2.60 a 5.67 b 0.66 a 1.87 c T3 25.37 a 15.70 a 1.70 a 0.95 a 0.45 a 2.51 a 6.31 a 0.68 a 2.11 a T4 24.24 a 15.73 a 1.71 a 0.80 b 0.41 a 2.57 a 6.12 a 0.67 a 1.96 b 2.7 不同成熟度烤后烟叶感官质量 由表 7 可知，中、上部烟叶不同成熟度的感官质量评价结果均以 T3 处理表现最佳。上部叶 T3 处理的香气质好、劲头足、刺激性小、余味绵长，吸食口感表现为细腻柔和，有回甜香，T1 处理燃烧性稍差，香气透发性不佳，香气量略显不足，而 T4处理烟气口感较差，刺激性明显，浓度稍低。中部叶 T3 处理表现为香气质好、香气量大，烟气状态较好，抽吸时满足感强，相比于 T3 处理，T2 处理香气量、烟气浓度较好，稍有杂气，余味稍残留，T4 处理香气量略欠缺，浓度偏低，劲头、燃烧性较差，而 T1 处理烟气质量略粗糙，香气质欠佳，杂气重，余味平淡，综合表现最差。中部叶感官质量综合得分表现为：T3T2T4T1。第 4 期 刘 芳等：不同成熟度烤烟萜类物质含量及相关基因研究 85 表 7 不同处理烤后烟叶感官质量 Table 7 Sensory quality of flue-cured tobacco leaves with different treatments 叶位 Position 处理 Treatment 香气质 Aroma quality 香气量 Aroma volume 浓度 Concentration 杂气 Miscellaneous 劲头 Strength 刺激性 Stimulation 余味 Aftertaste 燃烧性 Combustibility 灰色 Ash 综合得分 Score 上部叶 T1 7.05 b 7.02 b 6.93 c 6.75 c 6.92 b 6.53 b 6.55 bc 7.08 b 7.07 a 6.87 b T2 7.05 b 7.15 a 7.45 a 6.83 b 7.12 a 6.30 c 6.78 b 7.20 a 6.35 b 6.95 a T3 7.17 a 7.15 a 7.32 b 7.08 a 7.25 a 6.97 a 7.07 a 7.12 ab 6.05 c 7.11 a T4 6.07 c 6.08 c 6.47 d 6.50 d 6.70 c 6.43 bc 6.28 c 6.03 c 5.95 c 6.29 c 中部叶 T1 6.80 c 6.77 b 6.78 bc 6.50 c 6.87 b 6.78 a 6.50 c 7.25 a 7.17 a 6.75 b T2 6.83 bc 6.82 ab 6.97 a 6.75 b 6.95 a 6.72 a 6.72 a 7.20 a 7.17 a 6.84 a T3 6.92 a 6.83 a 6.93 a 6.80 a 6.95 a 6.78 a 6.80 a 7.20 a 7.08 a 6.88 a T4 6.87 b 6.67 c 6.67 c 6.83 a 6.77 c 6.83 a 6.77 b 7.12 b 7.23 a 6.80 b 3 讨 论 本研究通过测定 6 个与对萜类化合物合成与降解相关基因表达量，结合成熟过程中烟叶表面腺毛变化情况及烤后烟叶品质，证实烟叶成熟度是影响烤烟香气成分的重要因素，与烤后烟叶香气含量及感官评吸质量密切相关。随着叶片逐渐成熟，长柄腺毛的腺头逐渐脱落，腺毛密度降低，与前人研究一致7。在完熟叶片中基因 CYP71D16 和 DXR 的表达量最高，对应烤后完熟烟叶中性致香成分总量最多、感官评价得分最高，表明烟草中二萜类物质的降解物无论是在提升烟香、改善烟气余味还是在降低烟气刺激性、增进吸味等方面都发挥了重要的作用，与彭国岗等11、张思琦等13研究结果一致。随着成熟度的增加，基因 PAL 的表达量上调，C4H、CHS 基因在完熟叶片中表达量最高，表明类胡萝卜素转化、降解过程关键基因表达量与烟叶品质密切相关，与文利超14等研究结果中类胡萝卜素降解基因 PAL 表达下调趋势相反。该文献中烟叶样品主要集中在大田旺长期，烟叶中的类胡萝卜素处于积累阶段，而本文烟叶采集于成熟衰老后期，类胡萝卜素以降解为主，这可能是类胡萝卜素降解酶基因表达量存在差异的重要原因。本研究表明，在一定程度上，成熟度越高的烟叶物质转化越充分，化学成分越协调，香气越饱满，但过熟烟叶会导致内含物质降解过度，烟气平淡无味，满足感降低，整体质量下降，与前人研究结果一致。由于烘烤工艺也是影响烟叶色素降解幅度及香味物质含量的重要因素，不同成熟度烟叶自身生理生化变化不同，导致失水、变黄过程对烘烤条件的需求可能存在差异，但本文通过对烤前烟叶的萜类物质及相关基因表达量进行差异分析，避免了烘烤工艺对烟叶质量的影响，为选择适宜成熟度提供了更有效的数据支撑。本文涉及的西柏烷类只是腺毛分泌物中的一类，其他腺毛分泌物含量及对烟叶质量的影响有待于进一步研究。4 结 论 本研究观测了不同成熟度中烟 100 腺毛形态、结构以及主要萜类化合物含量的差异，利用qRT-PCR 技术初步探索了烤烟萜类化合物合成与降解相关酶基因表达量，结合烟叶内在品质综合分析表明，在当前烟叶生产中烟 100 成熟采收基础上推迟采收 57 d，使烟叶达到完熟程度，可提高烟叶的香气物质生成量，减轻烤后烟叶烟气杂气、刺激性，提高中上部烟叶质量及工业可用性。参考文献 1 曹晓玉，杨佳玫，杨虹琦，等.烟草萜烯类化合物种类及其分析方法研究进展J.作物研究，2013，27（3）：296-301.CAO X Y,YANG J M,YANG H Q,et al.Research progress in the types and analytical methods of tobacco terpenesJ.Crop Research,2013,27(3):296-301.2 聂梦云.烟草萜类代谢途径相关基因的克隆及功能分析D.重庆：西南大学，2016.NIE M Y.Cloning and functional analysis of genes related to terpene metabolism pathways in tobaccoD.Chongqing:Southwest University,2016.3 申培林，杨铁钊，张小全，等.烟草类萜生物合成途径中关键酶基因的克隆与表达调控J.江苏农业科学，2012，40（1）：37-40.SHEN P L,YANG T Z,ZHANG X Q,et al.Cloning and expression regulation of key enzyme genes in tobacco terpene biosynthesis pathwaJ.Jiangsu Agricultural Sciences,2012,40(1):37-40.4 郑庆霞，刘萍萍，陈千思，等.气相色谱-串联质谱检测新鲜烟叶中的萜类成分J.烟草科技，2019，52（7）：61-68.ZHENG Q X,LIU P P,CHEN Q S,et al.Determination of terpenoids in fresh tobacco leaves by GC-MS/MSJ.Tobacco 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