超高效液相色谱——串联质谱法同时测定农田环境中16种磺胺类抗生素.pdf

辽宁农业科学 2023(5):3742Liaoning Agricultural Sciences文章编号:1002-1728(2023)05-0037-06 doi:10.3969/j.issn.1002-1728.2023.05.007超高效液相色谱 串联质谱法同时测定农田环境中 16 种磺胺类抗生素张 彤1,孟祥勇1,杨智宇2,徐宜宏1,付海滨1,栗 杰3,粟有志4,张 敏3,于 丽1(1.沈阳海关技术中心,辽宁 沈阳 110016;2.辽阳海关综合技术服务中心,辽宁 辽阳 111000;3.沈阳农业大学,辽宁 沈阳 110866;4.伊宁海关技术中心,新疆 伊宁 835000)摘要:QuEChERS 作为前处理方法,乙腈(5 mmol/L)-乙酸铵(含 0.1%甲酸)作为流动相,UPLC-MS 确证检测,外标法定量。建立了超高效液相色谱串联质谱同时测定畜农田环境中 16 种磺胺类抗生素残留的分析方法。结果表明,该方法定量限 0.52.0 g/kg,回收率 61.3%92.8%,相对标准偏差 3.2%9.7%。该方法定量限低,稳定性好,适用于环境 16 种磺胺类抗生素残留的检测。关键词:磺胺类抗生素;液相色谱串联质谱;农田环境中图分类号:S141;X502文献标识码:B 磺胺作为一类广谱抗菌药物,主要用于临床上传染病的防治。被畜牧业和兽医诊所广泛用于饲料添加剂和动物疾病的治疗14,由于兽用抗生素并不能完全被动物体所吸收,约 30%90%抗生素随着畜禽粪便排泄出来56,而畜禽粪便通常会作为肥料回到农田中,从而也对农田环境(水、土壤)造成了污染712。据调查显示,目前国家标准中检测磺胺类药物的方法有 SC/T 9436-2020,可以同时检测 21 种磺胺类药物,在水产养殖环境中养殖水中检出限为 15 ng/ml,养殖环境底泥中检出限为 12.50 50 ng/g。GB 31658.17-2021 可以同时检测 19 种磺胺类药物,且动物组织检出限为2.0 g/kg;GB/T 22966-2008 使用范围窄仅适用于牛奶和奶粉,可以检测 16 种喹诺酮类物,检出低限 1.0 g/kg;GB/T 22947-2008,可以同时检测 18 种磺胺类药物但是基质只适用于蜂王浆,检测低限 5.0 g/kg。所以综上所述,现有的国家标准中并没有应用于农田环境中 16 种磺胺类药物的检测方法。而且现有的相关文献中对于磺胺类药物残留的检测也多为食品,仅有的水和土壤中的检测方法也因为磺胺种类少而应用较少1318。为此,本研究针对农田环境中磺胺咧类抗生素检测方法存在不足的现状,运用 UPLC-MS S 技术,建立了农田环境中 16 种磺胺类抗生素残留的快速筛查方法,为处理农田环境中的磺胺类化合物,以及后期农田环境的使用安全提供了技术支持。1 材料与方法1.1 仪器与试剂仪器:UPLC-MS 8060,日本岛津公司)、固相萃取仪(美国 Supelco 公司)超纯水机(乐枫公司)、电子天平、氮吹仪、离心机、均质器。试剂:16 种磺胺类化学标准品(购自德国 Dr.Ehren-storfer,纯度96%),乙腈、甲醇、甲酸为色谱级、PSA、500 mg/6ml MCX 固相萃取柱(均购自美国迪马公司)。1.2 样品提取与净化1.2.1 试样制备土壤:按照YC/T 386-2011 土壤中有机氯农药残留量的测定 气相色谱法方法制备。水样:每个采集到的水样至少为 1 L,密闭容器中保存待用,测定前摇匀。1.2.2 提取土壤:称取 10.0 g 混合均匀试样,于 100 ml 离心管中,加入 50 ml 乙腈,4 000 r/min 超声提取 30 min,过滤提取液,重复提取 1 次,合并滤液,加入 5.0 g 无水硫酸钠,涡混 1 min、4 000 r/min 离心 5 min,取上清液,待净化。收稿日期:2023-04-20基金项目:国家自然科学基金项目(31400442);辽宁省自然科学基金项目(2023-MS-213);沈阳市科技计划项目(21-108-9-37、17-159-8-00)作者简介:张彤(1992-),女,工程师,从事食品检测工作。E-mail:1471408980 通讯作者:栗杰(1979-),女,博士,讲师,从事农田土壤肥力与质量安全方面的研究。E-mail:lijie200298 辽 宁 农 业 科 学 2023 年养殖废水:称取 250 ml 水样于 500 ml 分液漏斗中,加入 2 g 无水硫酸钠溶解后,用 50 ml 乙腈溶液,振摇萃取,静置分层后,收集有机相,共萃取 3 次,合并有机相。40 真空条件下快速浓缩至 5 ml 左右。1.2.3 净化土壤:提取液中加入 0.4 g PSA 粉末,涡混 2 min、5 000 r/min,离心 5 min,上清液经 5 g 无水硫酸柱除水后,于 40 真空条件下快速浓缩至近干。1.0 ml 色谱纯乙腈定容、涡混 1 min,4 000 r/min 离心 3 min,上清液过0.22 m 微孔滤膜,供 UPLC-MS 测定。养殖废水:提取液经 5 g 无水硫酸柱除水后,于 40 真空条件下快速浓缩至近干。1.0 ml 色谱纯乙腈定容,涡混 1 min,过 0.22 m 微孔滤膜,供 UPLC-MS 测定。1.3 样品分析1.3.1 色谱条件色谱柱:岛津 C18(100 mm2.1 mm,2.0 m);柱温:40;进样体积:1.0 l;流速:0.20 ml/min;流动相:乙腈(A)和 5 mmol/L 乙酸铵含 0.1%甲酸水溶液(B),梯度洗脱,00.5 min B 保持 90%;0.55 min B 由 90%变化至75%;510 min B 由 75%变化至 50%;1012 min B 保持50%;1214 min B 由 50%变化至 90%;1419 min B 保持90%。1.3.2 质谱条件离子源:ESI+;DL 温度:250;加热块温度:400;接口温度:300;接口电 压:3.0 KV;雾 化 气 流 量:3.0 L/min;干 燥 气 流 量:10.0 L/min;加 热 气 流 量:10.0 L/min。2 结果与分析2.1 色谱条件的优化2.1.1 流动相的选择优化比较了有机相(甲醇和乙腈),水相(水、0.1%甲酸、5 mmol/L 乙酸铵、5 mmol/L 乙酸铵含 0.1%甲酸)的各种组合,分析了不同流动相组合对 16 种磺胺的分离度,试验结果表明:乙腈+5 mmol/L 乙酸铵含 0.1%甲酸水溶液作为流动相时,16 种磺胺经梯度洗涤完全分离且具有更好的峰值形状和更高的灵敏度,因此,本研究选择甲醇+0.1%甲酸水溶液作为流动相,此流动相条件下 16 种磺胺类药物的保留时间和 MRM 图如图 1 所示。2.1.2 质谱条件的优化首先对 16 种浓度为 0.1 g/ml 的磺胺的单标标准液进行全扫描,根据峰高、峰形,以及干扰度等因素确定母离子、定量离子和定性离子,然后在 MRM 模式下,对 Q1 Pre Bias、Q3 Pre Bias、和 CE 进行优化参数,最终确定质谱参数,如表 1 所示。2.2 前处理条件的优化2.2.1 提取溶剂的选择根据现有文献及标准,本方法对比了 16 种分析物在不同提取溶剂(甲醇、乙腈、乙酸乙酯、丙酮)下的提取效果。表 2 的实验结果表明,采用乙酸乙酯和丙酮作为提取溶剂,16 种磺胺回收率不到 60%,部分药物甚至低于50%,可能是磺胺类药物在乙酸乙酯和丙酮中的溶解性不好,提取率过低。而使用乙腈和甲醇的提取效果具有明显优势,其中乙腈的提取效果最好,回收率为 65.4%105.4%。因此,本研究采用乙腈作为提取溶剂。2.2.2 净化方法的选择QuEChERS 是最常见的用于检测食品中的多种药物残留的样品预处理方法。由于养殖废水中含有畜禽粪便、饲料、抗生素等多种残留,基质较土壤更为复杂,因此,本研究以养殖废水为研究对象,针对其所含有的特殊杂质进行净化方法优化。对比了 QuEChERS 和 MCX 固相萃取柱的净化效果。根据图 2 的实验结果,采用 MCX固相萃取柱净化的 16 种磺胺其回收率明显低于 QuECh-ERS 净化的回收率。其中经过 MCX 固相萃取柱净化的磺胺甲噻二唑、磺胺对甲氧嘧啶等的回收率更是低于60%,这是因为净化过程中 MCX 柱吸附了过多的化合物,导致回收率偏低。使用 QuEChERS 净化的16 种磺胺其回收率稳定为 63.5%105.4%。所以本研究采用 QuECh-ERS 作为净化方法。2.2.3 基质效应(ME)农田环境中养殖废水的成分最为复杂,虽然经过净化处理,但仍有部分杂质会与待测物一起随流动相进入质谱离子源,进而对目标化合物的离子化效果产生影响,从而导致基质效应(ME)。图 3 列出了 16 种磺胺在养殖废水中的基质效应。结果显示,ME 的范围为 2.5%36.2%,低于 50%,表明养殖废水不存在强基质效应。由图 3 可知,磺胺醋酰和磺胺吡啶等具有基质减弱效应,磺胺噻唑和磺胺氯哒嗪等存在基质增强效应。因此,本研究采用空白基质加标曲线来校正,以克服基质效应。2.3 方法学验证将空白基质按 1.2 处理,并配制混合工作曲线。16种磺胺的曲线范围如表 3 所示,以被测组分的浓度为横坐标,被测组分的峰面积为纵坐标拟合工作曲线,得到相关系数、检出限和定量限。结果见表 3。根据检出限的不同,分别添加检出限的 1 倍、2 倍和 10 倍制成模拟的加标样品,测定 16 种的回收率、变异系数见表 3。实验结果表明 16 种的相关系数均高于 0.9933,回收率为 65.4%107.1%,相对标准偏差为 3.2%10.7%,方法检出限为0.030.6 g/kg,定量限为 0.12.0 g/kg。2.4 实际样品检测用本方法分别对养殖废水和周边土壤开展 16 种抗83第 5 期 张 彤等:超高效液相色谱 串联质谱法同时测定农田环境中 16 种磺胺类抗生素生素检测,其中养殖废水样品 20 件、周边土壤样品20 件。16 种目标分析物在 20 份养殖废水中有 5 份样品中检出,20 份土壤中有 3 份样品有检出。检出的种类和含量如表4 所示。图 1 16 种磺胺类药物的保留时间和 MRM 图Figure 1 Retention time and MRM of 16 quinolones93辽 宁 农 业 科 学 2023 年表 1 待测抗生素的质谱参数Table 1 Mass spectrum parameters of antibiotics to be tested中文英文母离子子离子驻留时间Q1 Pre Bias(V)CE(V)Q3 Pre Bias(V)磺胺醋酰Sulfacetamide215.2108.230-17-24-22215.292.030-19-22-20磺胺嘧啶Sulfadiazine251.2156.2 30-14-15-17251.2185.230-17-19-13磺胺噻唑Sulfathiazole256.0156.2 30-14-15-28256.0107.530-20-30-28磺胺吡啶Sulfapyridine250.2156.2 30-12-17-11250.2184.230-10-20-13磺胺甲基嘧啶Sulfamerazine265.1156.230-30-18-29265.192.130-30-29-18磺胺二甲嘧啶Sulfamethazine279.0156.130-12-20-17279.0204.230-21-16-11磺胺甲噻二唑Sulfamethizole271.1156.130-10-13-17271.1107.530-17-22-21磺胺对甲氧嘧啶Sulfameter281.2156.230-10-17-17281.2215.230-15-18-23磺胺甲氧哒嗪Sulfamethoxypyridazine281.2156.130-19-20-13281.2215.130-30-17-17磺胺-6-甲氧嘧啶Sulfamonomethoxine281.2156.230-15-17-11281.2215.130-20-20-28磺胺氯哒嗪Sulfaclorazina285.1156.130-10-16-30285.1108.330-23-22-20磺胺间二甲氧嘧啶Sulfamethoxine311.1156.130-30-21-17311.1218.030-23-18-16磺胺甲基异噁唑Sulfamethoxazole254.2156.230-11-16-18254.2147.230-11-15-15磺胺二甲异噁唑Sulfadimethoxazole268.1156.130-30-16-30268.1113.330-12-20-21磺胺邻二甲氧嘧啶Sulfadoxine311.1156.130-10-19-17311.1108.130-15-27-22磺胺苯吡唑Sulfaphenazole315.1156.130-18-22-27315.1160.330-10-23-17 注:为定量离子表 2 不同酸性条件下 16 种兽药的回收率Table 2 Recovery rate of 16 veterinary drugs under different acid conditions抗生素不同提取溶剂的回收率乙酸乙酯丙酮甲醇乙腈Sulfacetamide34.340.144.358.650.856.173.189.4Sulfadiazine31.942.043.856.062.872.167.689.4Sulfathiazole40.351.743.458.362.267.171.687.1Sulfapyridine39.150.041.052.059.765.168.185.7Sulfamerazine44.858.141.855.952.460.189.4107.8Sulfamethazine42.846.943.550.459.061.684.292.0Sulfamethizole35.540.547.859.461.671.570.277.8Sulfameter49.456.649.754.358.665.966.992.2Sulfamethoxypyridazine44.247.047.959.554.861.273.582.7Sulfamonomethoxine39.953.546.656.855.663.668.692.6Sulfaclorazina39.047.544.252.260.260.673.584.7Sulfamethoxine41.053.345.356.353.866.265.492.5Sulfamethoxazole46.854.741.957.652.061.265.890.2Sulfadimethoxazole31.842.144.267.449.760.684.996.3Sulfadoxine42.654.951.560.352.460.876.989.9Sulfaphenazole33.550.543.257.161.068.782.892.8Sulfacetamide34.340.144.358.650.856.173.189.404第 5 期 张 彤等:超高效液相色谱 串联质谱法同时测定农田环境中 16 种磺胺类抗生素图 2 不同净化方法下 16 种兽药的回收率Figure 2 Recovery rate of 16 veterinary drugs under different purification methods图 3 16 种兽药的基质效应Figure 3 Matrix effect of 16 veterinary drugs表 3 16 种磺胺的曲线范围、相关系数、检出限、定量限、回收率、相对标准偏差Table 3 Curve range,correlation coefficient,detection limit,quantitation limit,recovery rate and relative standard deviation of 16 sulfonamides抗生素曲线范围(ng/ml)相关系数r2检出限(g/kg)定量限(g/kg)空白基质(g/kg)回收率(%)RSD(%)Sulfacetamide11000.99620.31.0 ND73.189.46.99.7Sulfadiazine11000.99380.31.0 ND67.689.43.25.6Sulfathiazole11000.99650.31.0 ND84.6107.13.410.1Sulfapyridine11000.99920.31.0 ND76.198.76.210.5Sulfamerazine11000.99840.31.0ND65.490.83.86.2Sulfamethazine11000.99790.31.0ND70.292.04.59.2Sulfamethizole22000.99910.62.0ND70.277.83.39.4Sulfameter0.51000.99560.150.5ND66.992.24.09.6Sulfamethoxypyridazine0.51000.99940.150.5ND77.5104.77.810.7Sulfamonomethoxine11000.99330.31.0ND68.692.66.910.5Sulfaclorazina22000.99760.62.0 ND77.592.74.97.6Sulfamethoxine0.21000.99820.060.2ND74.492.56.59.5Sulfamethoxazole22000.99850.62.0 ND65.890.24.69.3Sulfadimethoxazole11000.99770.31.0ND82.990.34.88.0Sulfadoxine0.11000.99790.030.1ND86.997.94.310.2Sulfaphenazole22000.99800.62.0 ND82.892.85.910.014辽 宁 农 业 科 学 2023 年表 4 实际样品中 16 种磺胺的残留量Table 4 Residues of 16 sulfonamide sin actual samples抗生素养殖废水农场土壤含量(g/kg)Sulfacetamide-Sulfadiazine-Sulfathiazole531.72.9Sulfapyridine-Sulfamerazine-Sulfamethazine-Sulfamethizole2-2.05.7Sulfameter-Sulfamethoxypyridazine-Sulfamonomethoxine-Sulfaclorazina322.75.6Sulfamethoxine211.02.5Sulfamethoxazole-Sulfadimethoxazole3-1.52.3Sulfadoxine-Sulfaphenazole-3 结论本研究建立了农田环境中同时测定 16 种磺胺的超高效液相色谱串联质谱测定方法,16 种磺胺的方法检出限 0.030.6 g/kg,定量限 0.1 2.0 g/kg。该定性定量分析方法简便、快速、灵敏、重现性好,符合实验分析要求。可同时检测16 种磺胺在农田环境中的残留。扩大了磺胺类药物检测的基质,降低了检出限和定量限,可同时推广到行业其他实验室,具有一定的创新和推广价值。参考文献:1Zhang Min,Meng jun,Liu qingyu,et al.Corn Stovers Derived Biochar for Efficient Adsorption of Oxytetracycline from WastewaterJ.Journal of Materials Research,2019,34(17):30503060.2 吴雯艳,齐梦钰,张泽坤,等.磺胺类抗生素的污染现状及检测方法研究J.环境科学与管理,2022,47(12):121126.3 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835000)Abstracts:QuEChERS was used as the pretreatment method,and 5mmol/L ammonium acetate(containing 0.1%formic acid)was used as the mobile phase.UPLC-MS confirmed the detection results and determined the external standard method.To estab-lish an ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(UPLC-MS)method for the determination of 16 sulfonamide antibiotics residues in agricultural environment.The results showed that the quantitative limit of this method is 0.52.0 g/kg,recovery 61.3%92.8%,relative standard deviation 3.2%9.7%.The method has low limit of quantification and good stability,and is suitable for the detection of 16 sulfonamide antibiotics residues in the environment.Key words:Sulfamide antibiotics;UPLC-MS;Farmland environment24