中药制剂分析新技术新方法.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,中国药典中药分析方法发展趋势,1977,版药典收载显微鉴别,1985,版药典收载,TLC,鉴别,1990,版药典收载对照药材的,TLC,鉴别和色谱方法的含量测定,2000,版药典建立了以色谱法含量测定为主导的质控方法,2005,版药典大幅度增加,HPLC,方法，重视特征成分、活性成分的测定,2010,版药典增加了指纹图谱的测定,趋势：新方法新技术不断引入中药的质量控制中。,高效毛细管电泳,2,中药指纹图谱,3,中药化学指纹图谱技术、中药DNA指纹图谱技术,现代色谱技术,1,顶空气相色谱法、超高效液相色谱、超临界流体色谱,提纲,OUTLINE,1,现代色谱技术,1、顶空气相色谱法,（液上气相色谱法、顶空分析法）,对样品,基质上方,的,气体成分,进行GC分析来测定这些组分在原样品中的含量,顶空气相色谱的分类,静态顶空GC,动态顶空GC,1 现代色谱技术,2、超高效液相色谱,（UPLC，Ultra Performance Liquid Chromatography）,主要特点,固定相,双（三乙氧基硅）乙烷在硅胶中形成桥式乙基基团,颗粒粒度小，仅为1.7,m,耐压，颗粒度分布范围很窄,1 现代色谱技术,2、超高效液相色谱,（UPLC，Ultra Performance Liquid Chromatography）,主要特点,检测器,响应快,样品池10mm的光程（与普通HPLC相同）而体积只有500nL（普通HPLC的20分之一）,优点,更高的分析速度，更好分离效果和更高的灵敏度，速度、灵敏度及分离度，分别是HPLC的9倍、1.7倍及3倍,样品的前处理,分子印迹技术,制备对特定目标分子具有分子识别性能的分子印迹聚合物的技术。,分子印迹聚合物兼备了生物识别体系和化学识别体系的优点,具有抗恶劣环境、选择性高、稳定性好、机械强度高、制备简单等特点,可选择性识别富集复杂样品中的目标物。,用于固相萃取、固相微萃取、膜萃取等样品前处理技术。,1 现代色谱技术,3、超临界流体色谱,（SFC,supercritical fluid chromatography）,以超临界流体（低黏度、高密度以及较高的扩散系数）作为流动相。,对GC及HPLC的检测器均可兼容使用,适用于分析GC难以处理的高沸点、不挥发性样品,分离速度较HPLC，分离效果更好。,应用实例,超临界流体色谱法测定怀牛膝制剂中齐墩果酸的含量,2 高效毛细管电泳,电泳,:在电解质溶液中，位于电场中的带电离子在电场力的作用下，以不同的速度向其所带电荷相反的电极方向迁移的现象。,由于不同离子所带电荷及性质的不同，迁移速率不同，可实现分离。,1937年 Tiselius(瑞典)利用,自由溶液电泳,将人血清提取的蛋白质混合液分离出白蛋白和,、,、,球蛋白,1981年 Jorgenson 和 Luckas 发展了,高效毛细管电泳分离分析技术,(使用75,m内径石英毛细管和采用了高达数千伏的电压)，,2 高效毛细管电泳,各种电性离子在毛细管柱中的迁移速度为：,+,=,电渗流,+,+ef,阳离子运动方向与电渗流一致,-,=,电渗流,-,-ef,阴离子运动方向与电渗流相反,0,=,电渗流,中性粒子运动方向与电渗流一致,可一次完成阳离子、阴离子、中性粒子的分离,分离原理,电场作用下，毛细管柱中出现：,电泳现象和电渗流现象,。,2 高效毛细管电泳,仪器装置,电压：030KV。,分离柱不涂敷任何固定液，,紫外或激光诱导荧光检测器,可检测到：10,-19,10,-21,mol/L,2 高效毛细管电泳,主要特点,优点,高分辨率：理论塔板数高达数百万块，甚至数千万块。,高灵敏度：可检测出低至10,-21,mol/L浓度的物质。,高分析速度：可在3分钟内分离30种阴离子；1.7分钟分离19种阳离子;4分钟可分离10种蛋白质.,试样用量少：仅需几nL（10,-9,L）的试样,仪器简单，操作成本低：分析一个试样仅需几毫升流动液,2 高效毛细管电泳,常见的毛细管电泳模式,毛细管区带电泳(CZE),毛细管胶束电动色谱(MECC),（胶束作为假固定相的电动色谱）,毛细管凝胶电泳(CGE),（凝胶作为支持物，起分子筛的作用）,毛细管等电聚焦电泳(CIEF),（用于蛋白质、多肽等两性物质的分离）,毛细管等速电泳(CITP),2 高效毛细管电泳,应用,离子分析,药物分析,手性化合物分析,氨基酸分析,核酸分析及DNA测序,HPCE在,中药制剂分析中的应用,生物碱的测定、动物类药材的鉴别、指纹图谱,高效毛细管电泳法测定心舒口服液中腺苷、芦丁和阿魏酸的含量,对照品溶液（略）,供试品溶液的配制,取心舒口服液10 mL，加热浓缩至约1 mL，加60%甲醇定容10 mL，冰箱放置过夜，经0.45 mm滤膜滤过备用。,电泳条件,以熔融石英毛细管(50 mm 66.5 cm，有效分离长度58 cm)为分离通道，以105 mmol/L硼砂液为运行缓冲液，压力进样50 mpa，6 s，毛细管柱温度为20，运行电压为0 30 min:24 kV，30 60 min:28 kV，检测波长为210 nm，毛细管柱使用前以0.1 mol/L 氢氧化钠溶液、注射用水和运行缓冲液依次冲洗5,5,8 min，每次电泳后以运行缓冲液冲洗8 min。在此条件下，同时测定腺苷、芦丁和阿魏酸的含量。,3 中药指纹图谱,从整体上评价中药的内在质量,中药（化学）指纹图谱法,现代光谱（红外光谱，紫外光谱）,色谱（气相色谱、薄层色谱、高效液相色谱、毛细管电泳）,其它（X光衍射）,3 中药指纹图谱,中药DNA指纹图谱法DNA分子遗传标记,DNA分子：遗传信息的直接载体，物种鉴别更为准确可靠,90年代，PCR(Polymorase Chain Reaction)技术，快速而灵敏地检测。,近年来，基于PCR的RFLP、RAPD、SSR、AFLP等检测DNA多态性的分子标记技术（DNA指纹技术）。,应用：在药材鉴定方面,广义的分子标记（molecular marker）是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质。常用的是狭义的分子标记概念，即DNA分子标记。DNA分子标记主要分为以下三类,限制性片段长度多态性（RFLP）：是发展最早的分子标记技术，以分子杂交为核心技术。,DNA序列测定,基于PCR的分子标记：根据引物的选择可分为随机引物扩增和特定序列位点扩增。,随机扩增多态性,DNA,（,Random amplified polymorphic DNA,RAPD,）。随机引物扩增,PCR,（,Arbitrary Primer-PCR,AP-PCR,）,2、DNA扩增产物指纹分析（DNA amplification fingerprinting,DAF）:与RAPD技术不同的是引物浓度更高，长度更短（58个bp），只有2个温度循环（在RAPD中是3个温度循环），一般用聚丙烯酰胺凝胶电泳。,3、特征扩增区段测序（Sequence-characterized amplified regions，SCAR）：先做RAPD分析，然后克隆目标RAPD片段进行测序，根据RAPD片段两末端的序列设计特定引物（一般比RAPD引物长，24bp），再进行PCR扩增，可把与原RAPD片段相对应的单一位点鉴定出来，可重复性高。,RFLP技术及其应用,RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism，限制性内切酶切片段长度多态性)是70年代发展起来的DNA片段分析技术。该技术不仅在生物学、医学、农学的许多领域都有了成功的应用，而且在中药材品种基源及其地理品系、栽培品系的质量评价方面也有许多应用。,基本原理,生物在进化过程中，由于种种原因引起基因突变和DNA分子结构重排，造成了分子内核苷酸排列顺序的改变，当这种改变涉及到限制性酶切位点时，酶切后产生的DNA片段长度将发生变化，限制性片段的长度在不同个体间呈多态性现象，即称为限制性片段长度多态(Restriction Fragment Length Polymorphism,简称RFLP),Restriction Fragment Length Polymorphism(RFLP),Enzymes cut DNA at specific sequences,Restriction sites are often palindromes:,6-cutter GAATTC4-cutter TCGA,CTTAAGAGCT,DNA多态性根据其产生的两种基本方式,碱基对突变类型(基因点突变),即限制性内切酶识别位点上发生了单个碱基替换(转换或颠换)，使原有切点消失或产生新的切点。,结构重排型，这是由DNA内部发生较大的顺序变化所引起的。,RFLP与镰状细胞贫血,基本实验步骤,靶DNA的准备,核酸探针的标记,杂交显示,RFLP的优点及局限性,优点：,(1)普遍存在,(2)稳定性,(3)共显性,(4)探针与限制酶的组合数量无限,局限性：,（1）用RFLP仅能检测出影响到限制性内切酶识别位点的突变,（2）步骤多，工作量大，而且接触的放射性污染也多,（3）RFLP分析技术要求DNA无显著降解，因此只适用于新鲜的材料，难适用于干燥药材的鉴别,（4）限制性内切酶价格较贵,RFLP用于亲缘关系分析,“Ladder”,RFLP,在中药材鉴别中的应用,（一）近缘种的鉴别,如：海马的PCR-RFLP分析,（,二）药用植物亲缘关系的研究,如：羽扇豆属植物系统发育关系及与生,物碱分布的关系,RAPD技术及其应用,RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA，随机扩增多态性DNA)技术是1990年由杜邦公司Williams和Welsh两个研究小组同时发展起来的一项DNA多态检测技术。该技术高效、灵敏、简便、快速，一经出现就被普遍用于物种种属分类、亲缘关系分析、物种起源鉴定、目的基因筛选、农作物育种等研究领域。近年，RAPD技术又进入了中药材的鉴别研究领域，并得到广泛应用，已成为目前用于中药材鉴定报道最多的分子遗传标记技术。,RAPD技术基本原理,RAPD的核心技术是PCR反应，但又不同于经典的PCR。它是以任意序列的寡核苷酸为引物进行PCR扩增，Williams称之为RAPD，引物通常为10个碱基；Welsh称之为AP-PCR(Arbitrary Primer PCR)，引物为2030个碱基。对于任一引物，如在一定范围内模板DNA上有与之互补的反向重复序列时，就可扩增出此范围的DNA片段。,RAPD:randomly amplified polymorphic DNA,基本实验步骤,模板DNA的制备,PCR扩增，通常RAPD扩增条件为：93预变性200s，开始如下循环：94变性lmin，36退火1min，72延伸2min；经过40个循环后，72延伸5min，循环结束后反应产物置于4保存。,扩增产物20,l反应产物走凝胶电泳，经溴化乙锭染色检测扩增的情况,RAPD图谱的数据处理,RAPD分析的优越性和不足,优越性：,(1)无需预知被研究的生物基因组核苷酸顺序，也无需专门设计RAPD扩增反应的引物，引物随机合成或是任意选定的,长度一般为9-10个寡核苷酸；,(2)扩增没有特异性；,(3)退火温度较低，一般为36，这能保证短核苷酸引物与模板的稳定配对，同时也允许了适当的错误配对，以扩大引物在基因组DNA中配对的随机性。,(4)简便易行，省力省时。,（5）检测灵敏方便；,（6）所需样品DNA量极少，仅为10ng,为RFLP的1/l000l/2000。,（7）能自动化。,不足：,（1）重复性不高。RAPD在扩增反应时使用的是低温复性(通常为36),特异性不高,引物与模板间有较高的错配率,结果容易受到多种因素的影响,不同的实验室这间有时不能重复；,（2）对模板DNA质量要求高，操作要求严格，检验成本相对较高；,（3）由于存在共迁移，分子量相同的片段可能不是同源的；另外一条带中可能含有不同的扩增产物；,（4）RAPD标记难以区分开杂合子和纯合子基因型，不能有效的鉴定出杂合子。,RAPD分析在中药研究中的应用,道地药材的评价,例：当归药材道地性的RAPD分析,野生与栽培种及不同农家品种,亲缘关系分析,例：人参及山参RAPD指纹,动物药的鉴定,例：蛇类药材分子遗传标记鉴别的研究,AFLP技术及其应用,扩增酶切片段多态性(Amplified Restriction FragmentPolymorphism)是一种基于PCR的DNA指纹技术，AFLP是近几年来继RFLP、RAPD之后发展最快的DNA分子标记技术。被誉为新一代的分子标记技术，近年来已得到广泛的应用。,AFLP基本原理,AFLP的基本原理是对基因组DNA,限制性酶切片段,进行选择性扩增。,先将基因组DNA用限制性酶消化，产生粘性末端。然后使用人工合成的双链接头（artificial adapter）,与基因组DNA的酶切片段相连接形成扩增反应的模板。接头和与接头相邻的酶切片段的几个碱基序列作为引物的结合位点。AFLP反应的结果是主要扩增那些由上述两种酶,共同酶切的片段。,基本实验步骤,模板的制备：即DNA酶切及人工接头的连接（Restriction of the DNA and ligation of oligonucleotide adapters）,限制性片段的选择性扩增（Selective amplification of sets of restriction fragments）,扩增产物凝胶电泳分析（Gel analysis of the amplified fragments）,AFLP的实验过程,AFLP反应流程：,AFLP反应程序主要包括模板DNA制备，酶切片段扩增及凝胶电泳分析这3个基本步骤。各步骤具体的过程有：,首先要制备高分子量(HMW)基因组DNA，选择6个碱基识别位点的限制性内切酶(通常是EcoRI或PstI或SacI)。,酶切后的限制性片段在T4连接酶的作用下与特定的接头相连接，形成带有接头的特异性片段。,DNA片段的预扩增。,在Taq聚合酶的作用下，完成AFLP的选择性扩增。,PCR产物变性后在含尿素的聚丙烯酰胺变性胶上电泳。,多态性比较分析，特异片段回收克隆分析。,AFLPs,荧光标记全自动,AFLP,For ABI 377 DNA Sequencer and AFLP Kits,AFLP技术特点,扩增效率高，多态性比例高,AFLP标记稳定可靠，不受基因组来源和复杂度的影响，没有种属特异性,AFLP技术较简便易行，不需要Southern杂交，不需要预先知道DNA的顺序信息，对模板浓度的变化不敏感，允许一定程度的共扩增，且只需要极少量的DNA材料,AFLP是一项专利技术，受专利权保护，其分析试剂盒价格偏高,AFLP的重复性问题,Jones et al.（1997）同一实验在欧洲的8个实验室重复，172条带只有1条在一次实验中没有，重复率99.4%，与SSR的水平相当,。（,Jones,C.J.et al.1997.Reproducibility testing of RAPD,AFLP and SSR markers in plants by a network of European laboratories.Mol.Breed.3:381-390),AFLP在分子中药中的应用,AFLP技术可产生丰富而稳定的遗传标记，它可以用于药用植物遗传分析的各个方面，如分类、系统发育、品种鉴别、遗传图谱构建及目的基因的定位等,例：,AFLP法构建人参、西洋参基因组,DNA指纹图谱,