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代谢控制工程提高大肠杆菌番茄红素产量的研究
William R. Farmer and James C. Liao*
化学工程系，加利福尼亚大学，洛杉矶，CA 90034.*作者([e-mail]).
收稿日期：1999.08.08，接受日期：2000.02.22
摘要 代谢工程在复杂多样的宿主内产生外源代谢物方面取得了可喜的成果。但是代谢工程途径主要集中在扩大所需要的酶和解除细胞控制，因此没有被控制的代谢途径代谢失衡和不理想的产物出现。我们已经阐述了代谢工程的另一种进程，通过设计调控回路使调控子根据细胞内代谢的状态来调节基因表达。尤其在大肠杆菌中恢复和改变调整回路体系中的一个Ntr调控子来控制番茄红素的生物合成途径。被过量的糖分解刺激的人造的调控子，ACP控制番茄红素中的两个关键酶的表达，这正响应了流体动力学。这样当减少因代谢失衡引起的消极影响时，细胞内操控系统就会明显提高番茄红素的产量。虽然我们论证这种可以提高代谢产量的方法，但是它也可被延伸到其他领域，而在这些领域中基因表达必须受细胞生理学严格的约束，如基因治疗。
关键词：类胡萝卜素，类异戊二烯，代谢工程，代谢控制，氮调控子

代谢工程在上个世纪就被认为得益于对生物合成能力的充分理解，把向分析复杂生物资料和功能基因的学科进军作为进步的结果。这种知识的直接优势是允许合理的新颖的路径设计和排除先天反应，而为了达到所需结果这种先天反应是不必要的或有害的。但是，随着代谢途径越来越有效，代谢工程将面临着一个新的挑战：即在这些路径中控制基因表达的调整层次流程的再设计。除了要构造代谢途径的遗传组成成分外，我们还要计划使他变得像基因表达路径动力学那样重要。
很多学者认为重组蛋白质或细胞路径的高水平感应现象将导致生长延迟和代谢活力的降低。这些表面特征有以下事实产生：不断的产品需求高于改变细胞生长需求。我们希望这种普便情形能通过设计一个动力控制器有所减轻，当然这个动力控制器能够感受到细胞的代谢状态和控制重组细胞路径的表达。
被命名为代谢控制工程的这种方法包括重新设计原来的路径和将它们应用于重组细胞路径。这样努力的目标是控制重组细胞路径的流量以适应细胞新陈代谢的状态。动力控制重组细胞路径可以潜在地导致产量提高、将生长阻碍减小到最小、减少有毒副产品形成。适应生理状态的基因表达规则对于基因治疗的成功也是十分必要的。这里我们举一个这种方法应用的例子——在大肠杆菌中提高番茄红素的产量。
我们选择番茄红素作为典型例子是因为番茄红素对人类的健康有益。番茄红素作为一种有效的抗氧化剂，它已经被提议治疗一些癌症和其他退行性疾病等，因此，具有活性的番茄红素的合成物和其它相关的类胡萝卜素已经越来越受人们的关注，并且有大量的报道在描述其产品。
结果和讨论
重组细胞路径构建动力学控制器。
动力控制器的目的是用来控制路径的流量以利于C和能量的利用。如图1所示：设计这样的一个细胞内操作系统需要识别器: ( 1 )发信号分子反射相关代谢状态 （2）传感器监视信号 （3）控制器处理感觉的输入 （4）控制阀（例如: 促进器）调节基因表达（5）被控制路径的速度限制装置。 鉴别正确的信号分子和速度限制需要对代谢系统有一个彻底地了解。剩下的成分则由两种成分组成的调整体系衍生而来，其中这个体系包括大量的遗传调整分子。

图1. 动力控制学描绘控制工程的结构图
被控制的过程是从葡萄糖到产物（番茄红素）和一些废品（例如：醋酸盐）的代谢途径。标准变量（或信号）是ACP，ACP提供信号让剩余的流量变成废品。感受分子是NRI蛋白,它可以结合在DNA上调节转录。控制阀是启动子glnAp2，它可以在代谢控制系统中控制受限的进程（Ldi and Pps）。图中虚线盒中指出代谢系统被控制。
我们最初的任务是鉴别一种可以放映细胞内代谢状态的信号分子和一种能够监控它的传感器。ACP可做为该代谢状态的信号分子，因为他已经被用来作为葡萄糖上的指示剂。另外，它也已经作为识别两种混合成分调节子的标准，如Che13, Pho14, and Ntr15。提高ACP水平可以作为一种好的指示剂。因此，如图1所示我们的方法是使用ACP作为信号分子来控制酶在想得到的路径中的表达，同时也充分地利用过多的C流量和改变流量的方向以远离有毒产物醋酸盐。
为了理解ACP和控制基因表达，我们利用大肠杆菌的Ntr调节子（图2）。Ntr调节子可以让细胞适应氮不足的状态但是在大多数生物反应器下它的作用可以忽落，因为此时处于氮充足的环境下。Ntr调节子自身的传感器叫NRII,它是基因glnL的产物，可以磷酸化的形式将磷酸转移给NRI蛋白，NRI–P进而与AP2结合位点结合，启动AP2的转译。在NRII缺失时，NRI才能响应ACP水平。设计NRII缺失的回路控制，使NRI对ACP水平及目标基因表达做出响应（图2A）。
为了重建这种控制单位，我们限定在包含NRI粘合位点的区域和核glnAp2启动子区域，并且插入DNA片段到克隆载体。NRI粘合位点重叠另一个被cAMP-CRP调控的启动子glnAP1。因此DNA片段也包含glnAP1，但是没有cAMP-CRP粘合位点(图2A)。没有cAMP-CRP活性，glnAp2的活性相当低，并且包含启动子的信息构造一个野生型菌株（JCL1595）来支持这个判断（图2B）。
单一基因表达的动力控制

图2. 动力学控制器的描述
（A）glnAp2启动子 在缺乏NRII时，ACP可诱导glnAp2。 NRI, NRI-粘合位点; glnAp2核, glnAp2 核序列; RBS, glnA 核糖体粘合位点; ATG转化开始。标注“-35” 和“-10”区指出两条RNA聚合酶的位置，其中RNA聚合酶和上游的glnAp2启动子相接触。来自单一复制glnAp2-lacZ的(B, C) b-Gal活性构造（B）细胞密度（在550nm的光学密度下）和（C）在JCL1595（glnL+）以及JCL 1596glnL)中的醋酸盐分泌物。来自野生型 (D) b-Gal activity活性在葡萄糖有氧生长期间单一复制Plac-lacZ和菌株VJS632的生长动力学。用符号（●）代表细胞生长，（■）代表b-gal的活性，（▽）代表细胞外的醋酸盐。
为了测试作为产物表达动力控制器的glnAp2的电位，我们引入glnAp2-lacZ信使核糖核酸的融合技术即通过l-噬菌体进入到glnL宿主菌株(JCL1596),同时测量b-gal活性的时间进程。这种菌株包含glnL2001等位基因。如图2 C所示：当glnL宿主分泌醋酸盐集中时glnAp2-b-gal活性增加，然而没有启动子活性的感应现象被发现，当然也没有适应于同基因的野生型（JCL1595）如（图2B）示。因而在NRII缺失时，glnAp2能够对过量的碳流量做出响应，而过量的碳流量可以被醋酸盐的排泄物反映出来。当细胞进入最后阶段时，生物合成需求减少，细胞开始层现出过量的碳流量。在这时，glnAp2-b-gal活性开始上升。相反在野生型菌株（JCL1595）中glnAp2-b-gal活性相对降低，暗示出glnAp2-lacZ表达被在glnL菌株(JCL1596)中的ACP调控，而不是被glnAp1中的cAMP激活。
如（图2 D）所示，菌株VJS632 (lac+)中染色体Plac的活性在IPTG感应现象后迅速地增加，同时再细胞中完成了恒量水平的表达，这种表达不依赖于生长期。因此，这种静态的感应现象不适应细胞生长改变的需求，高水平的基因表达导致代谢失衡和生长延迟。
多种复制基因表达的动力控制
为了测定由glnAp2提供的动力控制是否能减轻因高水平的蛋白质表达导致的代谢失衡和生长延迟，而代谢失衡和生长延迟通常在代谢工程中它是不可避免的。我们常使用两种不同的代谢的酶，即：Pps和DAHP合成酶，他们都处于glnAp2启动子的控制下。以前曾报道过，蛋白质无理由的过分表达导致生长延迟。尽管如此，当处于glnAp2启动子的动力控制下表达蛋白质时，细胞生长没有停止，如（图3 A）所示。生长压抑的缺乏起初归因于glnAp2启动子侧面感应现象的动力学。如（图3 C）所示Pps表达直到稳定期才开始增长。因此，glnAp2启动子避免过多的由蛋白质过度表达所引起的代谢负担。

图3. 蛋白质的过度表达
动态的glnAp2启动子完成高水平的表达和减少生长延迟（A）来自于质粒ps706(○)的Pps和p2AROG3 (glnAp2-aroG) (●)的过度表达。宿主菌株是BW18302，它被单独转化为pAROG、p2AROG3或者没有质粒（▽）。接种后的15小时，来自于每一个菌株的蛋白质被分析，通过使用10%的凝胶（合适的面板）SDS–PAGE。M凝胶跑道---标记蛋白质的分子量显示在凝胶上。贴标签的凝胶跑道’none’包含不带质粒BW18302，贴标签的凝胶跑道’Ptac’包含BW18302/pAROG细胞汁，贴标签的凝胶跑道’ glnAp2’包含BW18302/p2AROG3细胞汁（B）来自BW18302的Ptac-pps（○）和glnAp2-pps(●)的过度复制与没有质粒控制（▽）的比较。接种后的15小时，蛋白质被分析，通过使用8%的凝胶（合适的面板）SDS–PAGE。M凝胶跑道包含分子质量标志，贴标签的凝胶跑道’none’包含不带质粒的BW18302，贴标签的凝胶跑道’Ptac’ BW18302/pPs706细胞汁，贴标签的凝胶跑道’ glnAp2’包含BW18302/pPs706细胞汁 （C）来自BW18302/pPs706 (glnAp2-pps)的Pps表达的时间进程。
番茄红素路径的动力学控制
当避免生长延迟时，由glnAp2提供的动力控制可以被用来提高特殊基因的表达水平。因此我们利用调节分子来重组细胞路径以达到提高番茄红素的生物合成，这样可以扩大在大肠杆菌中来自类异戊二烯路径的范围。大肠杆菌中的类异戊二烯利用丙酮酸盐和G3P作为先驱，如图4 A所示。我们在大肠杆菌中改造一个重组体番茄红素路径，通过表达基因等。这些基因dxs 、gps 、crtBI 插入低拷贝质粒 pCL1920 构建质粒pCW9，同时过量表达。在这个路径里，gps和idi已经被识别用来控制流量到最终产品。另外，我们已经表明磷酸烯醇丙酮酸合成酶（PPS基因产物）控制丙酮酸盐和G3P的平衡，从而也控制了到类异戊二烯路径的流量。为了有力的控制碳流量，我们使用glnAp2启动子来控制gps和idi的表达。这些质粒被单独引入到包含pCW9的gln菌株(BW18302)。
如（图5A）所示，p2IDI菌株(glnAp2-idi)在含有葡萄糖的培养基中26小时后生产出100 mg/l的番茄红素。另一方面包含Ptac-idi (pTacIDI)的菌株，在相同的条

图4. 番茄红素产品的代谢控制工程
（A）用基因dxs 、gps 、idi和crtBI、G3P、丙酮酸盐、3-磷酸盐、IPP、Pyr、DMAPP、二甲基二磷酸、FPP、GPP、GGPP等重建番茄红素路径 （B）利用IDI 和PPS的动力学控制来改变代谢流量到番茄红素路径策略。两种类型的带点线代表应用到IDI 和PPS（------）和碳流量到番茄红素路径的变更（……）的控制电路。Glc，葡萄糖；PEP，磷酸烯醇丙酮酸盐；ACP，乙酰磷酸盐；Ace，醋酸盐；Lyc、番茄红素。
件下仅生产出少量的番茄红素。加之，p2IDI菌株生产的醋酸盐比pTacIDI生产的少3倍，这表明到醋酸盐的碳流量被改道到番茄红素，如（图5A）所示。pTacIDI菌株本身生产类似的发酵样品作为BW18302宿主控制，它暗示在这个菌株中番茄红素的表达没有改变代谢流量（图5 D）。这些结果被概括于表1。
来自p2IDI菌株的丙酮酸盐排泄物仍然很高，即使在大多数时间进程中它少于pTacIDI生产的量（图5 C）。自从丙酮酸盐成为类异戊二烯路径的先驱之一来自细胞内代谢物的排泄指出碳仍然不能有效地转移到番茄红素。尽管如此，PPS过量表达在糖分解的条件下也可以引起生长抑制（图2B）。这样为了避免代谢失衡PPS过量表达，最终的番茄红素生产的菌株包含一个可以控制idi和pps(glnAp2-idi + glnAp2-pps)的人造调节子，番茄红素路径的剩余物(dxs, gps, crtBI)在Ptac的控制下。番茄红素的浓度增加50%引起生产量增加三倍，从0.05(mg/ml.h)到0.16(mg/ml.h)如图5A所示。这和他的包含pTacIDI 和 pPS184 (Ptac-idi + Ptac-pps)的菌株相对照，这种菌株没有出现生长延迟现象如图5D示。明显的，在glnAp2调节子中的PPS再表达通过增加丙酮酸盐的利用为番茄红素增产创造了条件（如图5C和表1所示）

图5 通过ACP和glnAp2的动力学控制从大肠杆菌中提高番茄红素的产量。
（A） 含有1.5%的葡萄糖YE培养基中番茄红素的产量。（B）乙酸的分泌物。（C）丙酮酸盐的分泌物。（D）生长活力
这些结果表明由glnAp2人造调节子提供的的动力学控制允许速率控制酶的表达，这些酶用来帮助番茄红素的生物合成。此外，这些结果为代谢工程提出一个有效的策略。而不是向过去那样试图删除调整的回路，或者试图通过过量表达关键酶来压制他们。我们认为，再某些情况下，代谢失衡可以通过合理的方式调整控制来处理。这种方法不仅可以最优化代谢路径，也可以修改对生物工艺学重要的细胞的活力。例如，细胞循环规则、蛋白质置换和高水平蛋白质产品。另外，他可能成为基因治疗的重要手段，但是合理的控制电路设计扩大路径的双重应用将变成为一有效的设计工业应用微生物的方法。
实验方案
材料 所有的化学药品来自Sigma(St. Louis, MO).修饰和限制酶来自生命工艺。所有的PCR相关材料来自Promega (Madison, WI),寡核苷酸来自Genosys (The Woodlands, TX)。
细菌菌株和质粒 大肠杆菌菌株BW13711 (lacX74) and BW18302 (lacX74glnL20
01)由密歇根大学Alex Ninfa友好提供。菌株VJS632 (K-12 prototroph)由加利福尼亚大学Davis提供。菌株JCL1595和JCL1596通过把溶解的glnAP2-lacZ合在一起而构建出来，用来构建菌株JCL1595和JCL1596的质粒PSR551和λRS45抗菌素由洛杉矶加利福尼亚大学Bob Simon慷慨赠送。质粒pRW5tkt33和 pJF118EH23分别由Palo Alt和密芝根州立大学Michael Bagdasarian 慷慨赠送。质粒PAROG通过克隆包含来自pRW5tkt的aroGfbr的PCR片段插入到pJF118EH的位点 EcoRI-BamHI而构建， 质粒pTacIDI通过克隆包含来自大肠杆菌染色体的idi的PCR片段到pJF118EH的位点 EcoRI-PstI而构建.质粒PPS706已经被描述。包含启动子和两个NRI粘合位点的glnAP2启动子区域是来自利用前导引物5¢-CAGCTGCAAAGGTCATTGCAC
CAAC 和逆转引物5¢-GGTACCAGTACGTGTTCAGCGGACATAC大肠杆菌染色体的PCR扩增，这两条引物放大了产生DNA序列在93和343之间位置的区域。包含glnAP2启动子的PCR片段被克隆到质粒pAROG、pPS706和pTacIDI的EcoRV
-EcoRI位点以分别产生质粒p2AROG3、pPSG706和p2IDI。质粒pPS184和pPSG184通过切断分别来自pPS706、pPSG706的Ptac-pps、glnAp2-pps片段、使用EcoRV and BamHI以及插入到pACYC184相应的位点而构建。glnAp2 PCR片段被克隆到pRS5
51的位点EcoRI，这样就生产出含有glnAp2的p2GFPuv。glnAp2-lacZ区域通过相同的重组被转移到lRS45 以产生lp2GFPuv抗菌体。
生长条件 所有大肠杆菌菌株生长在固定培养基的摇动长颈瓶中，培养液置于含有0.5%葡萄糖的M9固定盐或者含有1.5%葡萄糖的YE固定盐组成的中等培养基中生长。YE固定盐由14 g/l K2HPO4,、16 g/l KH2PO4、 5g /l (NH4)2SO4、1 g MgSO4和1 mg/l 硫胺组成。细胞混合物在550nm的波长下被检测。
代谢物的检测 乙酸、丙酮酸盐和其他有机酸通过在65℃有机酸柱中使用HPLC而检测出来。由0.01 N H2SO4 组成的可变抗菌素，它的流速保持在0.6ml/min，在210nm时有机柱出现峰值。葡萄糖被检测出使用了Sigma kitno. 315-100。为了确定番茄红素的量，用乙酸提取1ml的细菌培养液，经过离心后，吸收波被测为474nm.番茄红素的浓度通过对比标准吸收波的值被计算出来。
SDS-PAGE和酶的分析 Laemmli描述出SDS-PAGE的草案，β-牛乳糖活力的测定由Miller来完成。

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