超高压辅助酶解豌豆蛋白工艺优化研究.pdf

90摘要：采用超高压辅助酶解豌豆蛋白制备豌豆多肽。以水解度为指标，在单因素试验的基础上通过响应面法优化制备工艺条件，并分析其抗氧化活性。结果表明：最佳工艺条件为以豌豆蛋白水溶液（豌豆蛋白与水质量比1：8）的质量为基准，底物添加量12.5%、加酶量0.2%、反应温度45、反应时间4.0 h、p H 8.0,在此条件下,豌豆蛋白水解度为9 7.41%。制得的豌豆多肽对DP-PH自由基、羟基自由基、超氧阴离子自由基的清除率分别为35.1%、2 0.8%、13.3%，表明豌豆多肽具有较好的抗氧化活性。关键词：豌豆蛋白；多肽；水解度；抗氧化活性Optimization of enzymatic hydrolysis ofpea protein assisted by ultra-high pressureWU Yu-juan,CHEN Yi-liu,ZHANG Jing-songLIU Ding-kun,SI Hang-jun,GAO Yun(College of Chemical Engineering,University of Science and Technology Liaoning,Anshan 114051,Liaoning,China)Abstract:Pea polypeptides were prepared by ultra-high pressure assisted enzymatic hydrolysis of peaprotein.Using hydrolysis degree as an indicator,the preparation process conditions were optimized by u-sing response surface methodology based on single factor experiments,and its antioxidant activity was an-alyzed.The results showed that the optimal process conditions were based on the mass of pea protein a-queous solution(pea protein to water mass ratio 1:8),substrate addition 12.5%,enzyme addition0.2%,reaction temperature 45 C,reaction time 4.0 h,and pH 8.0.Under these conditions,the hy-drolysis degree of pea protein was 97.41%.The clearance rates of DPPH free radicals,hydroxyl freeradicals,and superoxide anion free radicals of pea peptides were 35.1%,20.8%,and 13.3%,re-spectively,which indicated that the pea polypeptide had good antioxidant activity.Key words:pea protein;polypeptide;hydrolysis degree;antioxidant activity中图分类号：TS201.2*1豌豆属豆科植物),原产于中亚细亚和地中海地区,目前在世界范围内广泛种植。豌豆蛋白营养丰富,且其氨基酸组成均衡,其中赖氨酸含量最多2 。但豌豆蛋白的持水性和起泡性差，导致资源利用不够充分3。因此，需要改善豌豆蛋白的性质，提高豌豆蛋白的利用率。收稿日期：2 0 2 2-0 8-2 5基金项目：国家自然科学基金项目（U1910215）；国家级大学生创新创业训练计划项目（2 0 2 310 146 0 36）；辽宁省科技厅项目（2 0 2 3年辽宁省农村科技特派专项）；辽宁省大学生创新创业训练计划项目（S202310146066、S2 0 2 310 146 0 36、S202310146003X）；辽宁科技大学实验室开放基金大学生创新创业训练计划项目（X202310146220）作者简介：吴玉娟（19 9 9 一），女，硕士，研究方向为食品生物技术。通信作者：高云（19 6 9 一），女，硕士，教授，研究方向为食品生物技术。粮食与油脂超高压辅助酶解豌豆蛋白工艺优化研究吴玉娟，陈壹刘，张靖松，刘定坤，斯杭珺，高云（辽宁科技大学化学工程学院，辽宁鞍山1140 5 1）文献标志码：A2023年第36 卷第11期文章编号：10 0 8-9 5 7 8(2 0 2 3)11-0 0 9 0-0 5植物性蛋白质可以通过物理、化学和酶法进行改性。LIU等4 发现,豌豆蛋白经9 5 热处理后，乳化活性和稳定性均有所提高。吴晓娟等5 发现，在碱性条件下对米糠蛋白进行加热处理，可以使米糠蛋白的持水性、起泡性得到改善。超高压均质处理是近几年新兴的技术，可提高乳状液的氧化稳定2023年第36 卷第11期性。经过超高压均质处理后的豌豆蛋白乳状液粒径明显减小,蛋白质含量增多，氧化稳定性提高。目前关于植物性蛋白质酶解的研究很多。徐忠等7 利用超声波对豌豆蛋白进行预处理，优化豌豆蛋白的酶解工艺。但目前采用超高压辅助豌豆蛋白酶解的研究却不多见。本试验在碱性蛋白酶酶解豌豆蛋白的基础上,采用超高压均质技术辅助酶解,对豌豆蛋白的理化性质和内在结构进行改良，以期提高豌豆蛋白的资源利用率，为其在食品行业中的应用提供参考。1材料与方法1.1材料与试剂豌豆蛋白，安康食品商贸有限公司；碱性蛋白酶,河南万邦化工科技有限公司;DPPH、邻苯三酚，南京都莱生物技术有限公司；水杨酸、硫酸亚铁、双氧水、甲醛等,分析纯。1.2仪器与设备PHS-3C型pH计，上海仪天科学仪器有限公司;CN61M-752紫外可见分光光度计，北京海富达科技有限公司；SCIENTZ-207A超高压均质机，宁波新芝生物科技股份有限公司;R-324离心机，山东恒川环保机械有限公司;HH-WO恒温油水浴锅,郑州杜甫仪器厂;DF-101磁力搅拌器，常州亚旺仪器有限公司;DFA-C电子分析天平，陕西德祥实验设备有限公司；JP-240ST超声波清洗机，深圳市洁盟清洗设备有限公司。1.3试验方法1.3.1豌豆多肽制备将配制好的豌豆蛋白溶液置于超高压均质机中，在2 0 0 MPa压力条件下预处理2 h,结束后加人适量碱性蛋白酶,置于5 0 水浴锅中反应4h,再置于沸水浴中灭酶 15 min,冷却至室温后,以4 0 0 0 r/min 离心15 min,取上清液即为豌豆多肽,待用。1.3.2单因素试验以豌豆蛋白水溶液（豌豆蛋白与水质量比1：8）的质量为基准，在底物添加量12.5%、加酶量0.3%、反应温度45、反应时间4.0 h、p H 8.0的基础上进行单因素试验，研究底物添加量、加酶量、反应温度、反应时间、pH对豌豆蛋白水解度的影响。1.3.3响应面试验在单因素试验结果的基础上,选取pH(A)、加酶量(B）、底物添加量（C)为自变量,以水解度为响粮食与油脂应值进行响应面试验设计，因素水平见表1。表1响应面试验因素水平表因素水平A pH-17.808.018.21.3.4豌豆蛋白水解度测定取豌豆多肽2 mL于锥形瓶中,加入2 0 mL去离子水及甲基红指示剂3滴,用0.0 5 mol/L NaOH 溶液调pH至7.0,加入中性甲醛溶液5 mL、酚酞指示剂3滴，然后用0.0 5 mol/LNaOH溶液调pH至9.2,pH从7.0 调至9.2 所用NaOH溶液体积记为V8;然后再加人5 mL6mol/LHCl溶液，置于100水浴锅中水解2 h,水解后再用0.0 5 mol/LNaOH溶液调pH,记录pH从7.0 调至9.2 所用NaOH溶液体积V2。豌豆蛋白水解度计算见式(1)。水解度=100%1.3.5豌豆多肽的抗氧化活性测定1.3.5.1DPPH 自由基清除率测定取豌豆多肽0.5 mL于5 mLDPPH无水乙醇溶液中(DPPH与无水乙醇体积比1：10），在室温下避光反应2 0 min后,测定在波长5 17 nm处的吸光度Aj;取豌豆多肽0.5 mL于5 mL无水乙醇中,测定波长5 17 nm处的吸光度A9;对照组为5 mL DPPH无水乙醇溶液,测得吸光度为A。D PPH 自由基清除率计算见式(2）。DPPH 自由基清除率=(1-1.3.5.2超氧阴离子自由基清除率测定采用邻苯三酚法测定10-11,将4.5 mLTris-HCl溶液和3.3mL去离子水混匀后,得到Tris-HCl缓冲溶液,加人0.2 mL豌豆多肽和0.3mL邻苯三酚溶液(先2 5 水浴预热处理）,混匀,以8 mmol/L HCl为参比，测定5 min内波长32 0 nm处的吸光度，每隔30 s读数1次,5 min内吸光度的平均值记为A3，并测定不加豌豆多肽的对照组吸光度A2。超氧阴离子自由基清除率计算见式（3）。A2-A3超氧阴离子自由基清除率=100%A291B加酶量/%C底物添加量/%0.111.50.212.50.313.5V_ A1-A。100%A(1)(2)(3)921.3.5.3羟基自由基清除率测定取豌豆多肽0.2 mL加入5 mL硫酸亚铁饱和溶液和5 mL体积分数30%双氧水溶液,混合均匀后加入2 mL3mmol/L水杨酸-乙醇溶液，于37 反应30 min后,以10 0 0 0 r/min 离心10 min,测定波长510nm处的吸光度A4;用去离子水代替豌豆多肽作空白对照,测得吸光度As。羟基自由基清除率计算见式(4)。羟基自由基清除率=A4 100%1.4数据处理采用Origin9.0软件和DesignExpert8.0.7软件进行数据统计分析和作图；采用TukeyHSD程序进行差异显著性分析,P0.05为显著性差异。2结果与分析2.1单因素试验结果2.1.1底物添加量对豌豆蛋白水解度的影响由图1可知：豌豆蛋白水解度随底物添加量的增加呈现先增大后减小的趋势，当底物添加量为12.5%时，豌豆蛋白水解度最大。当底物添加量小于12.5%时,底物含量过少,影响酶解效率；而底物添加量过高,溶液黏度增加,产生底物抑制作用,从而导致水解度降低。因此,选择底物添加量11.5%、12.5%、13.5%进行响应面试验。7570656055504540354图1底物添加量对豌豆蛋白水解度的影响2.1.2加酶量对豌豆蛋白水解度的影响由图2 可知：随着加酶量的不断增加,豌豆蛋白水解度也随之增大，当加酶量增加到0.2%后,水解度增大趋势减缓。当加酶量小于0.2%时,豌豆蛋白未被碱性蛋白酶饱和,增大加酶量，水解度逐渐增大；当加酶量大于0.2%时,碱性蛋白酶已使豌豆蛋白饱和,可供碱性蛋白酶切割位点有限12 ,继续粮食与油脂增大加酶量，对肽段的切割作用不大。因此,选择加酶量0.1%、0.2%、0.3%进行响应面试验6463F6261605958A4-As(4)162023年第36 卷第11期5756图2 加酶量对豌豆蛋白水解度的影响2.1.3反应时间对豌豆蛋白水解度的影响由图3可知：随着反应时间的延长,豌豆蛋白水解度先快速增大,当反应时间为4.0 h时,豌豆蛋白水解度较大，继续延长反应时间，水解度变化不明显。当反应时间小于4.0 h时,酶解反应并未结束,随着时间的延长，水解度逐渐增大；当反应时间大于4.0 h时，碱性蛋白酶的催化位点逐渐减少13,底物抑制作用增大,酶解反应结束,使得豌豆蛋白水解度变化不大。因此,确定最佳反应时间为4.0 h。80r75F706560553.0810底物添加量/%0.112140.23.516反应时间/h图3反应时间对豌豆蛋白水解度的影响2.1.4反应温度对豌豆蛋白水解度的影响由图4可知：豌豆蛋白水解度随反应温度的升高而呈现先增大后减小的趋势，当反应温度为45 时,豌豆蛋白水解度达到最大值。碱性蛋白酶的最适温度为40 5 5，反应温度过低或过高，碱性蛋白酶的活性均降低，甚至造成碱性蛋白酶失活，从而导致豌豆蛋白水解度降低。因此，确定最佳反应温度为45。0.3加酶量/%4.04.50.40.55.02023年第36 卷第11期8078%/7674727035图4反应温度对豌豆蛋白水解度的影响2.1.5pH对豌豆蛋白水解度的影响由图5 可知：豌豆蛋白水解度随pH的增加呈现先增大后减小的趋势，当pH为8.0 时,豌豆蛋白水解度达到最大值。pH过低或过高,碱性蛋白酶的活性均降低,甚至造成碱性蛋白酶失活的现象,从而导致豌豆蛋白水解度降低。因此,选择pH 7.8、8.0、8.2 进行响应面试验。75706560557.5图5 pH对豌豆蛋白水解度的影响2.2响应面试验结果响应面试验设计及结果见表2，方差分析结果见表3。通过软件进行回归拟合，得二次多项回归方程:Y=93.96+6.99A+7.39B+5.78C-0.125AB+1.0AC-0.6BC 13.97A?-6.87B-13.89C。由表3可知：回归模型达到极显著水平（P0.05），表明回归模型是准确可用的，调整系数RAa=0.9340,可解释9 3.40%的响应值变化，决定系数R=0.9711,说明该模型与试验的拟合度较好，可利用此回归方程模型进行豌豆蛋白酶解工艺参数优化。方程中一次项A、B、C及二次项A、B、C均对豌豆蛋白酶粮食与油脂解反应的影响极显著(PAC,即加酶量 pH底物添加量。表2响应面试验设计及结果试验号A1-1213-14045反应温度/8.08.5pH93BC-10-10105055909.5水解度/%56.669.776.8415-1617-18190100110120130140150160170表3响应面试验方差分析方差来源平方和自由度均方F值P值显著性回归模型3124.30A390.60B436.60C266.81AB0.062.5AC4.00BC1.44A2821.44B2198.58C812.64残差92.83失拟项74.70纯误差18.13总和3.217.12R=0.971 1 R%s=0.934 0注：*表示差异极显著(P0.01)。2.3验证实验根据DesignExpert8.0.7软件分析得出豌豆蛋白酶解反应最佳工艺参数为加酶量0.2 5 3%、pH8.051、底物添加量12.7 0 6%，此时预测豌豆蛋白水解度为9 7.39%。考虑到实际操作的可行性，10000-11-11000009347.1426.180.000 11390.6029.450.001 01436.6032.920.000 71266.8120.120.002 810.062.50.004.70.947 214.000.301 60.599 911.440.108 60.751 41821.4461.940.000 11198.5814.970.006 11812.6461.280.000 1713.26324.9044.53160-1-111-1-111000005.490.066 789.455.368.461.878.960.571.376.384.795.193.794.890.495.8*94将最佳工艺参数修正为加酶量0.2%、pH8.0、底物添加量12.5%，在此条件下进行3次平行验证实验,得到豌豆蛋白水解度平均为9 7.41%,与预测值误差小，说明该模型可靠。2.4豌豆多肽的抗氧化活性豌豆多肽的DPPH自由基清除率为35.1%、羟基自由基清除率为2 0.8%、超氧阴离子自由基清除率为13.3%，说明豌豆多肽具有较好的抗氧化活性。3结论采用超高压辅助酶解豌豆蛋白制备豌豆多肽。以水解度为指标,在单因素试验的基础上通过响应面法优化制备工艺条件,并分析其抗氧化活性。结果表明：最佳工艺条件为以豌豆蛋白水溶液（豌豆蛋白与水质量比1：8）的质量为基准，底物添加量12.5%、加酶量0.2%、反应温度45、反应时间4.0h、p H 8.0,在此条件下,豌豆蛋白水解度为97.41%。制得的豌豆多肽对DPPH 自由基、羟基自由基、超氧阴离子自由基的清除率分别为35.1%、2 0.8%、13.3%，表明豌豆多肽具有较好的抗氧化活性。本研究为豌豆蛋白在食品行业中的应用提供参考。参考文献1张秋萍，田亚平双酶法酶解豌豆蛋白制备高抗氧化多肽的研究J天然产物研究与开发，2 0 13，2 5(4)：519-524.【2 夏轩泽，李言，钱海峰，等改性处理对豌豆蛋白结构和功能特性的影响J：食品科学技术学报，2 0 2 1，39(5):32-38,48.粮食与油脂【3】李宝艳，万端极超滤膜法制备豌豆蛋白的工艺J.食品研究与开发，2 0 10，31(10)：7 5-7 7.4 LIU Y H,WANG D Z,WANG J H,et al.Functionalproperties and structural characteristics of phosphorylatedpea protein isolate J.International Journal of Food Sci-ence and Technology,2020,55(5):2002-2010.【5 吴晓娟，王晓婵，张佳妮，等pH值碱性偏移结合热处理对米糠蛋白结构和功能性质的影响J食品科学,2 0 2 1,42(4):2 3-30.【6 李贞，张开屏，刘海英，等超高压均质提高豌豆蛋白稳定的乳状液的物理和氧化稳定性J粮食与油脂,2021,34(8):53-56.【7】徐忠，王友健，陈晓明，等响应面试验优化超声波辅助酶解豌豆蛋白工艺研究J粮食与油脂，2 0 2 1，34(10):121 125.【8】马诗文复合酶法制备绿豆抗氧化活性多肽及其应用研究D鞍山：辽宁科技大学，2 0 2 0.【9 吴晖，任尧，李晓凤.鸭蛋清蛋白多肽体外抗氧化活性的研究J食品工业科技，2 0 11，32(7)：9 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