成年斑马鱼体肾的微细结构及其外泌体的分布鉴定.pdf

DOI:10.12300/j.issn.1674-5817.2023.070实验动物与比较医学 Laboratory Animal and Comparative MedicineOct.2023,43(5)林金杏，浙江大学动物遗传育种与繁殖学博士，现为上海实验动物研究中心研究员，长期从事实验动物质量检测及相关科研工作。目前主要聚焦斑马鱼等新型实验动物生理功能及标准化研究，内容涉及水生实验动物标准化、水生实验动物资源开发与应用、组织和细胞形态学、器官三维重建、生理功能挖掘、疾病模型建立、饲养管理规范、病原体和遗传质量控制等方面。共主持上海市科委项目7项，并多次参加国家级项目的申报和研究工作，获计算机软件著作权3项，出版专著斑马鱼组织细胞学彩色图谱和Color Atlas of Zebrafish Histology and Cytology，以第一作者或通信作者身份在学术期刊上发表实验动物相关论文30余篇，参与起草国家标准和上海市地方标准各1项，获上海市科学技术进步三等奖（第一完成人）1项。陈秋生，南京农业大学教授，博士生导师。中国畜牧兽医学会动物解剖学与组织胚胎学分会常务理事，中国动物学会动物生理生态学分会常务理事，法国科学院博士后，英国皇家兽医学院高级研究员。主要从事动物细胞生物学、实验动物形态生理学和中医经络与针灸机制的研究工作，先后发现并报道了禽类血-脾屏障、洋葱样线粒体与中华鳖精子长期储存机制、中医经络实质的潜在细胞及针灸治疗机制。主持完成国家自然科学基金项目8项，发表SCI论文110篇，部分研究成果以封面论文形式发表并受到国际主流期刊专评，部分成果内容被编入本科教材，出版专著兽医比较组织学等，主编国家规划教材动物组织学与胚胎学，培养博士26名（包括8名留学生）、硕士35名。成年斑马鱼体肾的微细结构及其外泌体的分布鉴定林金杏1,王新栋2,3,白雪兵2,冯丽萍1,谢淑武1,陈秋生2(1.上海实验动物研究中心,上海 201203;2.南京农业大学动物医学院,南京 210095;3.枝江市畜牧兽医服务中心,宜昌 443200)摘要 目的观察和分析斑马鱼体肾的微细结构，并对其分泌的外泌体进行分离鉴定。方法应用光学显微镜和电子显微镜技术系统观察斑马鱼体肾的显微结构和超微结构，用纳米颗粒跟踪分析（nanoparticle tracking analysis，NTA）技术检测外泌体粒径大小。结果斑马鱼体肾紧贴并平行于脊椎，肾单位由肾小管和肾小体组成，其中肾小管可细分为近曲小管、远曲小管及颈段 3 种类型，肾小体由肾小球和肾小囊构成；经高碘酸-希夫（periodic acid-Schiff，PAS）染色后，可见近曲小管富含糖原颗粒，其游离面有明显的刷状缘结构。透射电子显微镜下，在肾小管的管腔观察到外泌体分布，上皮细胞游离面的胞质有少量多囊泡体和大量的晚期内涵体分布，肾小管的顶端和肾小球足细胞中亦观察到少量多囊泡体分布。通过CD9、CD63和TSG101免疫组织化学和免疫荧光检测显示，多囊泡体及其外泌体在肾小管管腔的游离面高表达，在肾小体和管腔内表达较弱。NTA和透射电子显微镜观察结果显示，分离获得的斑马鱼体肾外泌体呈茶托状，粒径众数为144.4 nm，符合外泌体形态和直径大小特征。结论斑马鱼体肾具有哺乳动物肾脏的典型结构，为体内的泌尿器官。肾小管具有分泌外泌体的能力，其形成是多囊泡体向细胞游离面释放到胞外的过程。本研究结果为水生实验动物泌尿器官的功能研究及相关模型的开发应用奠定了形态学基础。关键词 斑马鱼；体肾；外泌体；多囊泡体中图分类号 Q95-33；Q174 文献标志码 A 文章编号 1674-5817（2023）05-0531-10 研究报告 Research Reports基金项目 上海市科技计划项目“上海市水生实验动物专业技术服务平台”（22DZ2291200）；上海市科研计划项目“斑马鱼器官形态参数完善与立体重构整合”（16140904300）第一作者 林金杏（1983），女，博士，研究员，研究方向：水生实验动物生理功能及标准化研究。E-mail：。ORCID：0000-0002-7649-9552；通信作者 陈秋生（1963），男，博士，教授，研究方向：动物组织细胞形态及功能研究。E-mail:。ORCID:0000-0002-6087-7029531实验动物与比较医学 Laboratory Animal and Comparative MedicineOct.2023,43(5)Fine Structure of the Trunk Kidney and Distribution of Its Secreted Exosomes in the Adult ZebrafishLIN Jinxing1,WANG Xindong2,3,BAI Xuebing2,FENG Liping1,XIE Shuwu1,CHEN Qiusheng2(1.Shanghai Laboratory Animal Research Center,Shanghai 201203,China;2.College of Veterinary Medicine,Nanjing Agricultural University,Nanjing 210095,China;3.Zhijiang Animal Husbandry and Veterinary Service Center,Yichang 443200,China)Correspondence to:LIN Jinxing(ORCID:0000-0002-7649-9552),E-mail:;CHEN Qiusheng（ORCID：0000-0002-6087-7029），E-mail：ABSTRACT Objective To observe the fine structure of the trunk kidney in zebrafish,and to identify its secreted exosomes.Methods The microstructure and ultrastructure of the trunk kidney in zebrafish were observed by light microscopy and electron microscopy,and the particle size of exosomes was detected by nanoparticle tracking analysis(NTA).Results The trunk kidney was close and parallel to the spine in adult zebrafish.The nephron consisted of renal tubules and renal corpuscles.The renal tubules could be further divided into three types:proximal convoluted tubules,distal convoluted tubules,and cervical segments.The renal corpuscles were composed of glomerulus and renal capsules.The periodic acid-Schiff(PAS)staining results revealed that there were abundant glycogen granules in the proximal convoluted tubules,with brush-like outline in the apical surface of epithelial cells.Under transmission electron microscopy(TEM),there were exosomes distributed in the lumen of renal tubules,with numerous late endosomes and few number of multivesicular bodies(MVBs)in the cytoplasm of the epithelial cells concentrating on the apical side.Meanwhile,MVBs were also distributed in the apical regions of the renal tubules and the podocytes of the renal glomeruli.Immunohistochemical staining results showed that CD9,CD63 and TSG101 were strongly expressed in the lumen surface of the renal tubules,but weakly expressed in the corpuscles and lumen.NTA and TEM results showed that the exosomes isolated from zebrafish trunk kidney were saucer-like outline,and the particle size mode was 144.4 nm,which was consistent with the characteristics of morphological futures of exosome.Conclusion The zebrafish somatic kidney has the typical structure of the mammalian kidney and is the urinary organ in the body.The renal tubules have the ability to secrete exosomes,and their formation is a process of releasing poly-vesicles to the free surface of epithelial cells into the extracellular space.This study laid a morphological foundation for further study of exosomes in urinary function in aquatic experimental animals as well as the development and application of related models.Key words Zebrafish;Trunk kidney;Exosome;Multivesicular body21 世纪初期，斑马鱼被美国国立卫生研究院（National Institutes of Health，NIH）列为继小鼠和大鼠之后第三大常用的实验动物，并倡导斑马鱼作为研究脊椎动物发育、生理学和疾病的模式生物1。斑马鱼素有“水中小白鼠”之称，具有快速发育、胚胎透明、适用于高通量筛选、易于显微操作等优势和特点，被广泛用于发育生物学和新药开发的研究2-3。近30年来，国内外斑马鱼的研究得到了飞速发展，截至2023年 9 月，在国际斑马鱼模式生物数据库（zebrafish information network，ZFIN）中注册的实验室已逾1 600个。我国已成为继美国之后的第二大斑马鱼研究大国，在发育调控、疾病模型、药物筛选、环境监测等方面开展了卓有成效的研究工作4。2020年发布实施的国家标准 实验动物 实验鱼质量控制（GB/T 396492020）规定了适用于斑马鱼、剑尾鱼和诸氏鲻虾虎鱼的种质、遗传、微生物和寄生虫、饲料、环境设施的质量控制及其监测方法5，进一步推进了以斑马鱼为代表的水生实验动物的标准化发展和应用开发进程。作为一种新兴的实验动物资源，与常用的啮齿类实验动物相比，斑马鱼体内组织器官微细结构的系统性资料尚不完整。肾脏是脊椎动物体内重要的器官，它不仅能排泄体内产生的代谢废物，还能调节血液中532实验动物与比较医学 Laboratory Animal and Comparative MedicineOct.2023,43(5)钠、钾、钙、氯等离子及物质的浓度，维持机体正常酸碱平衡和渗透压稳定6。与大多数脊椎动物一样，斑马鱼的肾脏起源于中胚层，其发育经历前肾（又称头肾）和中肾两个阶段。在斑马鱼的胚胎和幼鱼阶段，头肾是具有排泄功能的功能性泌尿器官；斑马鱼成年后，头肾转变为具有造血和免疫功能的免疫器官，与肾脏的中后段界限分明。肾脏的中段和后段合称为体肾，为具有排泄功能的泌尿器官7。目前对成年斑马鱼体肾的微细结构还鲜有报道。外泌体（exosome）具有脂质双分子层结构，直径约30150 nm，呈杯形或双凹碟形，广泛存在于乳汁、精液、汗液、尿液等体液中，可携带众多的生物信号分子，在机体生理和病理过程中均发挥重要作用8-9。本课题组前期研究结果表明，斑马鱼的肠道吸收细胞、杯状细胞、淋巴细胞和高内皮细胞中均有外泌体分布，提示斑马鱼是开展肠道外泌体研究的理想模型10-11。近年来，外泌体研究领域正在迅速扩大，其内容和功能取决于起源细胞以及它们产生的条件12。近期研究显示，外泌体参与急性肾损伤、肾间质纤维化、多囊肾病、糖尿病肾病、肾脏细胞癌等多种肾脏相关疾病的发生发展进程，既是关键的信号介质，也是潜在的生物标志物，在疾病诊断与治疗方面显示出独特优势13-14。但关于外泌体在肾脏中的生物发生、释放机制及生物学功能尚处于初步研究阶段，亟需一种典型的动物模型来揭秘其中的科学内涵。本研究选用斑马鱼为实验动物，首先通过光镜和透射电子显微镜解析体肾的微细结构，免疫组织化学（immunohistochemistry）和免疫荧光（immunofluorescence）法观察体肾外泌体的分泌情况，并通过纳米颗粒跟踪分析技术（nanoparticle tracking analysis，NTA）和透射电子显微镜鉴定体肾外泌体，为推进以斑马鱼为代表的水生实验动物替代高等哺乳动物进行相关生命科学研究提供科学依据，也为其他动物泌尿系统的科学研究提供组织细胞学参照。1材料与方法1.1实验动物选用612月龄成年AB系野生型斑马鱼（Danio rerio），雌、雄各半。实验用斑马鱼来源于上海实验动物研究中心，饲养于独立水生动物养殖系统 SYXK（沪）2019-0004，饲养温度（280.5），室内光照明暗周期为 14 h10 h，NaHCO3调节水体 pH 7.07.5，电导率500550 S/cm，每日上、下午各喂食一次。取材前12 h禁食，使用160 mg/L MS-222（美国Sigma公司）浸浴麻醉斑马鱼，鳃动完全停止约1 min即确认麻醉后取样。所有实验方案均经上海实验动物研究中心实验动物管理和伦理委员会（IACUC）审查批准（批准号：160812002）。1.2主要试剂和仪器主要试剂包括CD9、CD63和TSG101兔多克隆抗体购自南京华安生物有限公司，即用型羊抗兔二抗、BSA封闭液和DAB显色试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司，荧光羊抗兔二抗购自英国Abcam公司，外泌体提取纯化试剂盒（UR52141）购自上海宇玫博生物科技有限公司，DAPI染液购自上海碧云天生物技术有限公司。此外，苏木精-伊红（hematoxylin-eosin staining，HE）试剂、多聚甲醛、乙醇、二甲苯、丙酮、过碘酸-雪夫（periodic acid-Schiff，PAS）试剂、PBS、枸橼酸、H2O2、戊二醛、锇酸、柠檬酸铅、醋酸铀和草酸双氧铀等化学试剂购自国药集团。主要仪器包括体视显微镜（Stemi 508，德国Zeiss公司）、切片机（RM2015，德国Leica公司）、光学显微镜（BH-2，日 本 Olympus 公 司）、病 理 切 片 扫 描 成 像 系 统（ScanScope，美国Aperio公司）、透射电子显微镜（H-7650，日本 Hitachi 公司）、纳米颗粒跟踪分析仪（NanoSight NS300，英国Malvern Panalytical公司）。1.3光镜样品制备与观察将斑马鱼用MS-222麻醉后，迅速取出肾脏并分离体肾。体肾经生理盐水（即0.65%NaCl溶液）漂洗后，放入质量分数4%的多聚甲醛溶液固定48 h，梯度乙醇脱水，石蜡包埋，用切片机进行5 m切片，然后进行常规HE染色或PAS糖原染色，中性树脂封片后观察并拍照。1.4电子显微镜样品制备与观察将剥离的斑马鱼体肾置于4 预冷的2.5%戊二醛溶液中固定24 h，PBS清洗后，1%锇酸后固定1 h，梯度乙醇脱水，丙酮置换乙醇后环氧树脂包埋，超薄切片机切片，醋酸铀及柠檬酸铅双重染色，透射电子显微镜观察体肾超微结构并拍照。1.5免疫组织化学和免疫荧光染色将斑马鱼体肾石蜡切片经二甲苯脱蜡后，梯度乙醇脱水，0.01 mol/L柠檬酸缓冲液（pH 6.0）97 水浴修复，5%BSA封闭，一抗（PBS稀释为1501100）孵育（4 过夜），阴性对照以PBS代替一抗，PBS清533实验动物与比较医学 Laboratory Animal and Comparative MedicineOct.2023,43(5)洗。进行免疫组织化学染色的切片用二抗孵育后PBS清洗，DAB显色，苏木精对比染色细胞核后常规水洗、脱水、透明、封片。进行免疫荧光的切片则用荧光素标记的二抗避光孵育后PBS 清洗，DAPI 染色后避光拍照。1.6外泌体提取纯化剥离20尾斑马鱼的体肾至预冷的PBS中，研磨后将样品转移至离心管中，4 下，3 000g离心10 min去除样品中的细胞碎片，取上清液转移到新的离心管中，按照外泌体提取纯化试剂盒的说明提取和纯化外泌体。1.7NTA分析外泌体粒径用去离子水清洗纳米颗粒跟踪分析仪的样本池后，将提取的斑马鱼体肾外泌体用PBS适当稀释后注入样本池，温度保持在2030，用相应的软件NTA 3.4 Build 3.4.4开始检测记录并分析外泌体颗粒大小和浓度。实验独立重复3次，所得数据用平均值标准差表示。1.8外泌体的电镜检测将提取的斑马鱼体肾外泌体重悬到2%多聚甲醛溶液中制成悬液，加到载样铜网上，PBS清洗后，1%戊二醛液固定5 min，草酸双氧铀染色，透射电子显微镜观察并拍照。2结果2.1斑马鱼肾脏的解剖结构斑马鱼的肾脏位于体内的胸腹段，紧贴背部脊椎生长发育，呈半透明状，有一大血管平行穿行于其中（图1A）。斑马鱼肾脏可分为前段、中段和后段三部分，其中前段颜色呈淡红色，称为前肾（PN）或头肾（HK）；中后段的中肾（MsN）和后肾（MtN）均呈土黄色（图1），合称为体肾（TK）。体视显微镜下，成年斑马鱼雌雄个体间体肾的解剖结构无明显差异，肾脏外表面均有发达的被膜覆盖，其中背侧的被膜上有大量黑色素细胞分布（图1B），而腹侧的被膜上黑色素细胞相对较少（图1C）。2.2斑马鱼体肾的显微结构斑马鱼体肾（TK）紧贴并平行于脊椎（SC）（图2A），上有一条大静脉（V）和大动脉（Ar）平行穿过（图2B）。斑马鱼体肾中与泌尿功能相关的肾组织包括肾单位、集合小管和集合管。其中，肾单位由肾小管和肾小体组成。肾小管可进一步细分为近曲小管（PCT）、远曲小管（DC）和颈段（CS）三类（图2CD），管腔1020 m。近曲小管的管腔狭窄且形状不规则，但管壁较厚，由上皮细胞组成，细胞界限不清，细胞游离端有由大量微绒毛组成的刷状缘（BE）。远曲小管与近曲小管相邻，较短，但管腔较大，形状规则，管壁相对较薄，由立方形上皮细胞构成，微绒毛不发达。颈段较短，由单层立方上皮细胞构成，上皮细胞的游离端可见有纤毛（Ci）结构（图2CD）。斑马鱼的肾小体由肾小球和肾小囊组成。肾小球为一球形小体，又称血管球，直径4060 m，是一团蟠曲的球形毛细血管（图 2E）。肾小球上皮细胞（GEC）包括脏层上皮细胞（VEC）和壁层上皮细胞（PEC），其中VEC又称足细胞（podocyte）。肾小球的管壁较薄，管内富含红细胞（Ec）和足细胞（Pc），与注：A，斑马鱼肾脏在体内的位置；B，斑马鱼体肾的背侧面；C，斑马鱼体肾的腹侧面。标尺大小为1 mm。PN，头肾；MsN，中肾；MtN，后肾；V，静脉。Note：A，The position of kidney in zebrafish；B，Dorsal view of the trunk kidney in zebrafish；C，Ventral view of the trunk kidney in zebrafish.The scale is 1 mm.PN，Pronephros；MsN，Mesonephros；MtN，Metanephros；V，Vein.图1 体视显微镜下观察到的成年斑马鱼肾脏解剖形态Figure 1 Anatomical structure of the kidney in adult zebrafish by stereomicroscope534实验动物与比较医学 Laboratory Animal and Comparative MedicineOct.2023,43(5)肾小囊壁层间形成一肾小囊腔，囊腔外侧可见扁平的上皮细胞（图2E）。斑马鱼体肾的PAS反应显示，肾小管的刷状缘和基底膜结构清晰明了，近曲小管内可见大量的糖原颗粒（Gl），但肾小体（RC）内未检测到明显的糖原阳性信号（图2FG）。2.3斑马鱼体肾的超微结构透射电子显微镜下，可观察到斑马鱼体肾的近曲小管上皮细胞内含有丰富的线粒体（图3AC），这些细胞的顶端质膜与管腔相连，有外泌体和小管分布。上皮细胞游离端有丰富的刷状缘，由微绒毛组成，朝向管腔，呈栅栏状排列。足细胞呈多突状，足突末端呈膨大状，紧紧附着于肾小球基底膜（GBM）的外侧（图3D）。在斑马鱼肾小管的管腔内，可清晰观察到呈茶托状的外泌体分布（图3A），且在肾小管上皮细胞的游离面（图 3AB）胞质内观察到大量的晚期内涵体（LE）和少量的多囊泡体（MVB）（图3B），在肾小管上皮细胞的顶端（图3C）和肾小球足细胞的胞质（图3D）内观察到结构典型的多囊泡体（图3CD）分布。另外，多囊泡体有电子密度高低两种类型，其中电子密度较低的多囊泡体离管腔的距离较近。2.4多囊泡体及其外泌体在斑马鱼体肾中的分布通过免疫组织化学和免疫荧光检测，观察多囊泡体及外泌体相关特异性蛋白CD9、CD63和TSG101在斑马鱼体肾中的分布情况，以研究多囊泡体及其外泌注：A，斑马鱼体肾纵切面形态结构，标尺大小为500 m；B，斑马鱼体肾横切面形态结构，标尺大小为100 m；C，斑马鱼肾小管形态结构，标尺大小为20 m；D，斑马鱼肾小管分为近曲小管、远曲小管和颈段，标尺大小为20 m；E，斑马鱼肾小体的形态结构，标尺大小为20 m；F，近曲小管PAS反应呈阳性，肾小体PAS反应呈阴性，标尺大小为50 m；G，近曲小管上皮细胞内富含糖原颗粒，游离端刷状缘清晰可见，标尺大小为20 m。Ar，动脉；BE，刷状缘；TK，体肾；Ca，被膜；Ci，纤毛；CS，颈段；CSp，肾小囊腔；DC，远曲小管；Ec，红细胞；Gl：糖原颗粒；Mc，黑色素细胞；Pc，足细胞；PCT，近曲小管；PEC，壁层上皮细胞；RC，肾小体；S，脊柱；SB，鳔；SC，脊髓；V，静脉。Note：A,Morphological structure of zebrafish kidney in longitudinal section,the scale is 500 m;B,Morphological structure of zebrafish kidney in cross section,the scale is 100 m;C,Morphological structure of renal tubules of zebrafish,the scale is 20 m;D,The renal tubules of zebrafish were divided into proximal convoluted tubules,distal convoluted tubules and cervical segments,the scale is 20 m;E,Morphological structure of renal corpuscle,the scale is 20 m;F,PAS reaction was positive in proximal convoluted tubules while negative in renal corpuscles,the scale is 50 m;G,The epithelial cells of the proximal convoluted tubule were rich in glycogen particles,which were showed brush-like outline on the apical surface of the epithelial cells,the scale is 20 m.Ar,Artery;BE,Brush-like edge;TK,Trunk kidney;Ca,Capsule;Ci,Cilia;CS,Cervical segment;CSp,Capsular space;DC,Distal convoluted tubule;Ec,Erythrocyte;Gl,Glycogen;Mc,Melanocyte;Pc,Podocyte;PCT,Proximal convoluted tubule;PEC,Parietal epithelial cell;RC,Renal corpuscle;S,Spine;SB,Swim bladder;SC,Spinal cord;V,Vein.图2 HE染色（AE）和PAS染色（FG）后观察到的斑马鱼体肾的显微结构 Figure 2 Microstructure of trunk kidney in the zebrafish detected by HE staining(A-E)and periodic acid-Schiff staining（F-G)535实验动物与比较医学 Laboratory Animal and Comparative MedicineOct.2023,43(5)体在斑马鱼体肾中的分泌情况。结果显示，这3种蛋白在斑马鱼体肾中的分布位置基本一致（图4）。其中，CD9表达较弱（图4B），主要在近曲小管上皮细胞的胞质中表达；CD63和TSG101在肾小管管腔的游离面上呈强阳性表达（图4CE），在肾小管管腔内和肾小球亦呈阳性表达，但阳性信号较弱（图4CD）。结果提示，斑马鱼体肾具有分泌多囊泡体及其外泌体的功能，其中肾小管分泌功能较强。2.5斑马鱼体肾外泌体的检测鉴定NTA检测结果显示，分离获得的斑马鱼体肾的外泌体粒径众数为144.4 nm，粒径集中在（181.659.3）nm（图5AB），粒径大小均符合外泌体直径大小。透射电子显微镜检测结果显示，分离提取的斑马鱼体肾外泌体呈茶托状（图5C），直径约140 nm，与NTA测得的粒径大小基本一致。3讨论脊椎动物的器官形成是一个错综复杂的发育及生长过程，器官的形态结构决定其生理功能。哺乳动物的前肾在胚胎期短暂存在，无生理功能。而鱼类的头注：A，近曲小管的上皮细胞富含线粒体和糖原，游离端可见大量的晚期内涵体分布，标尺大小为1 m；B，近曲小管游离端的刷状缘结构明显，呈栅栏状紧密排列，标尺大小为1 m；C，肾小管的顶端有多囊泡体分布，标尺大小为1 m；D，肾小球的足细胞足突结构明显，有多囊泡体分布，标尺大小为500 nm。A、B、C和D分别为A、B、C和D中方框处的放大图。BE，刷状缘；GBM，肾小球基底膜；DS，细胞桥粒；Exo，外泌体；ER，内质网；FP，足突；Gl，糖原颗粒；LE，晚期内涵体；LD，脂滴；M，线粒体；MVB，多囊泡体；N，细胞核；PB，足细胞胞体；SP，裂孔；Tb，管腔。Note：A,The epithelial cells of convoluted tubule contained mitochondria and glycogen with abundant late endosomes in the apical surface,the scale is 1 m;B,The brush-like structure at the free-end of the proximal convoluted tubule was clearly visible and arranged in a palisade shape,the scale is 1 m;C,There were multiple vesicles distributed at the top-end of epithelial cells in the renal tubule,the scale is 1 m;D,The structure of podocytes in the glomerulus was obvious,with multiple vesicles distributed,the scale is 500 nm.A,B,C and D were enlarged figures at the boxes in A,B,C and D,respectively.BE,Brush-like edge;GBM,Glomerular basement membrane;DS,Desmosome;Exo,Exosome;ER,Endoplasmic reticulum;FP,Foot process;Gl,Glycogen;LE,Late endosome;LD,Lipid droplets;M,Mitochondria;MVB,Multivesicular body;N,Nucleus;PB,Podocyte cell body;SP,Slit pore;Tb,Tube.图3 透射电子显微镜下观察到的斑马鱼体肾的超微结构Figure 3 Ultrastructure of trunk kidney in zebrafish observed by transmission electron microscope536实验动物与比较医学 Laboratory Animal and Comparative MedicineOct.2023,43(5)注：A为免疫组织化学法（DAB染色）检测的阴性对照；BD分别显示免疫组织化学检测CD9、CD63、TSG101在体肾中的分布情况（黑色短箭头示阳性反应，B 为B图中白色箭头所指处的放大图）；E，CD63和TSG101免疫荧光（IF）法（DAPI染色）进一步检测CD63和TSG101在斑马鱼体肾中广泛分布，其中肾小管游离面（白色短箭头示）分布最为明显。标尺大小均为10 m。Note：A,Negative control of immunohistochemistry(DAB stain);B-D,Distribution of CD9,CD63 and TSG101 in the trunk kidney,respectively,and black short arrows showed positive reactions.The figure B was the enlarged figure pointed by the white arrow of figure B:E,CD63 and TSG101 were widely distributed in the trunk kidney of zebrafish by immunofluorescence(IF)method(DAPI stain),particularly abundant in the apical surface of renal tubules(white short arrows).All of cale bars are 10 m.图4 免疫组织化学（AD）和免疫荧光（E）检测斑马鱼体肾中CD9、CD63和TSG101蛋白表达Figure 4 Immunohistochemistry（A-D）and immunofluorescence（E）of CD9、CD63 and TSG101 in the trunk kidney of zebrafish注：A，斑马鱼体肾外泌体强度/粒径散点图；B，斑马鱼体肾外泌体平均浓度/粒径分布图；C，分离提取的斑马鱼体肾外泌体超微结构。Note：A，Scatter diagram of exosome strength/particle size in the trunk kidney of zebrafish；B，Distribution diagram of average exosome concentration/particle size in the trunk kidney of zebrafish；C，Ultrastructure of the trunk kidney exosome in zebrafish.图5 纳米颗粒跟踪分析技术（AB）和透射电子显微镜（C）鉴定成年斑马鱼的体肾外泌体Figure 5 The trunk kidney exosomes in the adult zebrafish identified by nanoparticle tracking analysis（A-B）and transmission electron microscopy（C）537实验动物与比较医学 Laboratory Animal and Comparative MedicineOct.2023,43(5)肾在胚胎时期具有泌尿功能，成年以后转变为类淋巴组织。最终，体肾发育成为成年鱼类的泌尿器官，具有排泄功能7。绝大多数鱼类（如鲤鱼、金鱼等）在性成熟后，头肾与体肾之间会形成明显的界限；但一些鱼类（如大马哈鱼）在性成熟后，头肾和体肾会发生融合形成一体15。与哺乳动物肾小管分类相似，根据管腔的结构特点，通常也将鱼类肾小管分为近曲小管、远曲小管和颈段。有相关报道15表明绝大多数生活在海洋中的鲈形目鱼类的肾小管无远曲小管，这可能与其适应生活环境相关。本研究结果显示，斑马鱼头肾与体肾界限明显，肾小管分段清晰，通过观察刷状缘可直接区分近端小管和远端小管。通常来说，鱼类的肾小体呈弥散分布，直径因品种不同而有所差异；肾小囊是由扁平上皮细胞构成的囊状结构，层数也因鱼的种类而异。斑马鱼的肾小体与林国辉等16报道的剑尾鱼的肾小体直径相近。本研究中微细结构观察发现，斑马鱼肾小囊是由脏层和壁层构成，脏层由肾小球内的足细胞构成。足细胞基底膜较厚，为一类高度特异性的终末期分化细胞，并与血管内皮细胞和肾小球基膜一同构成了肾小球血液滤过屏障（glomerular filtration barrier，GFB），具有滤过功能。但也有一些生活在海水中的鱼类（如蟾鱼、华脐鱼和颌针鱼等）的肾脏无肾小球结构，常被称为无小球肾脏15。此外，PAS染色是观察肾脏结构的主要方法之一。本研究中，斑马鱼体肾的PAS反应结果清晰，并观察到近曲小管有糖原分布，可以推断斑马鱼的体肾是体内糖类储藏和释放的场所之一，从而为斑马鱼作为糖尿病肾病等疾病模式生物的研究奠定了病理学基础。由此可见，在组织结构上，斑马鱼体肾具有哺乳