查耳酮衍生物的合成及联合氟康唑抗耐药白色念珠菌活性.pdf

Journal of China Pharmaceutical University 2023，54（5）：564-568学 报查耳酮衍生物的合成及联合氟康唑抗耐药白色念珠菌活性沈云虹，陈红洁，毛泽伟，黄正晓，虎春艳*（云南中医药大学中药学院，昆明 650500）摘 要 查耳酮是活性天然产物中常见的化学骨架，具有多种生物活性。设计合成了8个未见文献报道的含香豆素片段的查耳酮衍生物5a 5h，其结构经1H NMR和13C NMR确证。采用微量稀释法进行了体外联合氟康唑（fluconazole,FLC），抗耐药白色念珠菌作用评价。结果发现，该类化合物均具有协同FLC抗耐药白色念珠菌活性，特别是化合物5g与FLC联合用药的抗耐药白色念珠菌活性（MIC50=5.60 g/mL）远优于FLC单独用药的活性（MIC50=200 g/mL），可作为抗真菌药物增效剂。关键词 查耳酮衍生物；合成；抗菌活性；耐药白色念珠菌中图分类号 R914.5；R965 文献标志码 A 文章编号 1000-5048（2023）05-0564-05 doi：10.11665/j.issn.1000-5048.2023041002引用本文 沈云虹，陈红洁，毛泽伟，等.查耳酮衍生物的合成及联合氟康唑抗耐药白色念珠菌活性 J.中国药科大学学报，2023，54（5）：564568.Cite this article as：SHEN Yunhong，CHEN Hongjie，MAO Zewei，et al.Synthesis and antifungal evaluation of chalcone derivatives combined with fluconazole against drug-resistant Candida albicans J.J China Pharm Univ，2023，54（5）：564568.Synthesis and antifungal evaluation of chalcone derivatives combined with fluconazole against drug-resistant Candida albicansSHEN Yunhong,CHEN Hongjie,MAO Zewei,HUANG Zhengxiao,HU Chunyan*School of Chinese Materia Medica,Yunnan University of Chinese Medicine,Kunming 650500,ChinaAbstract Chalcone is a common scaffold in natural products with optimal properties and biological activities.In this study,we designed and prepared eight new coumarin-chalcone derivatives(5a-5h),and confirmed their structures by 1H NMR and 13C NMR.Their in vitro antifungal activity combined with fluconazole(FLC)against drug-resistant Candida albicans was tested by microdilution method.The results indicated that most chalcone derivatives showed good antifungal activity against drug resistant Candida albicans with FLC,particularly with compound 5g displaying better antifungal activity(MIC50=5.60 g/mL)than FLC(MIC50=200 g/mL)when combined with FLC,so,these derivatives could be used as synergists of antifungal drugs.Key words chalcone derivatives;synthesis;antifungal activity;drug-resistant Candida albicansThis study was supported by the Yunnan Provincial Science and Technology Department-Applied Basic Research Joint Special Funds of Yunnan University of Chinese Medicine No.202001AZ070001-007,No.202101AZ070001-055,No.2019FF002(029)白色念珠菌是一种在大多数人的胃肠黏膜、生殖道、口腔和皮肤上无症状定植的真菌。氟康唑（fluconazole,FLC）是临床上治疗白色念珠菌感染的首选药物，但随着FLC的广泛使用，其耐药情况越来越严重。目前在克服真菌耐药的研究中，联合用药已成为一种新的用药模式1-2。查耳酮是一类广泛存在于多种中草药中的活性成分，具有多种生物活性，如抗菌、抗炎、抗肿瘤收稿日期 2023-04-10 *通信作者 Tel：[phone] E-mail：基金项目 云南省科学技术厅-云南中医药大学应用基础研究联合专项资助项目 No.202001AZ070001-007，No.202101AZ070001-055，No.2019FF002（029）论文564第 54 卷第 5 期沈云虹，等：查耳酮衍生物的合成及联合氟康唑抗耐药白色念珠菌活性和抗氧化等3-5。本研究小组在前期对查耳酮类化合物开展了大量的构效关系研究6-10，以及协同抗真菌药物发挥抗耐药真菌活性的研究11-12。本文在前期研究基础上，从乙酰乙酸乙酯与水杨醛为原料出发，合成得到8个新的香豆素-查耳酮类衍生物5a 5h，采用微量稀释法对其体外联合FLC抗耐药白色念珠菌作用进行评价，衍生物合成路线见图1。1 合成路线 香豆素-查耳酮类衍生物合成路线见图1。对氟苯乙酮与哌嗪反应后生成化合物1，化合物1与不同结构的芳香醛通过Claisen-Schmidt缩合反应生成8个查耳酮类化合物2a 2h。由乙酰乙酸乙酯和水杨醛发生Knoevenagel反应后，再与单质溴反应合成溴代香豆素，最后将8个查耳酮类化合物2a 2h与溴代香豆素结合，合成了8个新化合物5a 5h。2 实验部分 2.1仪器与试剂AM-400 核磁共振波谱仪（德国 Bruker 公司，TMS 为 内 标）；Plus384 酶 标 仪（美 国 Molecular Devices公司）。白色念珠菌FLC敏感株SC5314（云南登楼科技有限公司）；白色念珠菌氟康唑耐药株SC5314-FR（用FLC诱导敏感菌SC5314使其对FLC耐药）。氟康唑分散片（南昌弘益药业有限公司）；硅胶薄层预制板（GF254）、柱色谱硅胶（青岛海洋化工有限公司）；其余试剂和溶剂均为市售分析纯。2.2合成部分2.2.1中间体化合物1的合成称取4-氟苯乙酮（2.76 g，20 mmol）、哌嗪（5.17 g，60 mmol）和无水碳酸钾（5.52 g，40 mmol）于100 mL圆底烧瓶中，加入无水乙腈50 mL，95 回流反应12 h。TLC检测反应完成后，加入二氯甲烷200 mL中，以水洗涤萃取后（200 mL 3），二氯甲烷层经无水硫酸钠干燥、过滤、真空浓缩后柱色谱，以二氯甲烷-甲醇（100 150 1）溶液为洗脱剂，分离得到3.31 g化合物1，重量收率81%。2.2.2中间体化合物2a 2h的合成称取制备的化合物 1（0.20 g，1 mmol）和不同取代基的醛（1.1 mmol）于 25 mL 圆底烧瓶中，加入甲醇 5 mL溶解后，再加入20%氢氧化钾水溶液，室温下反应12 h。TLC 检测反应完全后，将反应物倒入冷水10 mL中，搅拌5 min，用二氯甲烷萃取3次（10 mL 3）。合并二氯甲烷层，无水硫酸钠干燥、过滤、真空抽滤浓缩后，以二氯甲烷-甲醇（100 1）溶液为洗脱剂进行柱色谱，分离得到化合物2a 2h，重量收率70%80%。2.2.3中间体化合物3的合成称取乙酰乙酸乙酯（2.60 g，20 mmol）和水杨醛（2.44 g，20 mmol）于Figure 1Synthesis of coumarin-chalcone derivatives565学 报 Journal of China Pharmaceutical University 2023，54（5）：564-568第54 卷100 mL圆底烧瓶中，加入无水乙醇 25 mL和哌啶5滴，室温反应3 h。TLC检测反应完成后，真空抽滤，以 95%乙醇 50 mL 重结晶，得到 3.3 g化合物3，重量收率88%。2.2.4中间体化合物 4的合成称取制备的化合物3（1.88 g，10 mmol）于50 mL圆底烧瓶中，加入冰醋酸 20 mL，搅拌下缓慢滴加 Br2（0.5 mL，10 mmol）的冰醋酸（5 mL）溶液，室温反应 5 h。TLC 检测反应完全后，加热到 55 继续反应30 min，固体溶解并排除 HBr 气体，冷却析晶，抽滤，滤饼用无水乙醚洗两次后干燥，再以冰醋酸20 mL重结晶，抽滤，无水乙醚洗涤滤饼2次，得到化合物4白色针状晶体1.98 g，重量收率75%。2.2.5目标化合物5a 5h的合成称取化合物2a 2h（0.3 mmol）和化合物 4（80 mg，0.3 mmol）于10 mL圆底烧瓶中，加入二氯甲烷（5 mL）和二异丙基乙胺（DIPEA，0.7 mL，0.6 mmol），室温下反应3 h，TLC检测反应完成后，加水5 mL继续搅拌5 min，萃取，二氯甲烷层真空抽滤浓缩后，柱色谱分离纯化，以二氯甲烷-甲醇（200 1）溶液为洗脱剂，得到目标化合物5a 5h，见表1（表1中收率为重量收率）。化合物 5a 黄色固体。1H NMR(400 MHz,CDCl3):8.54(1H,s,CH),7.99(2H,d,J=8.0 Hz,Ar-H),7.74(1H,s,Ar-H),7.55 7.65(2H,m,Ar-H,CHCH),7.26 7.37(4H,m,Ar-H,CHCH),6.70(2H,d,J=8.0 Hz,Ar-H),6.67(3H,d,J=8.0 Hz,Ar-H),4.03(2H,s,COCH2),3.43(4H,t,J=8.0 Hz,NCH2),3.02(6H,s,NCH3),2.79(4H,t,J=4.0 Hz,NCH2);13C NMR(101 MHz,CDCl3):194.5,188.4,159.4,155.5,152.1,147.9,144.3,134.7,130.0,123.4,117.3,116.7,113.6,112.1,67.2,53.3,47.4,40.2。化合物5b 黄褐色固体。1H NMR(400 MHz,CDCl3):8.55(1H,s,CH),7.98(2H,d,J=8.0 Hz,Ar-H),7.89(1H,s,Het-H),7.67(2H,s,Het-H),7.37(4H,s,Ar-H),7.31 7.34(3H,m,Ar-H,CHCH),7.07(1H,d,J=4.0 Hz,Ar-H),6.92(2H,d,J=8.0 Hz,Ar-H),4.04(2H,s,COCH2),3.45(4H,t,J=4.0 Hz,NCH2),2.80(4H t,J=8.0 Hz,NCH2);13C NMR(101 MHz,CDCl3):194.5,187.5,159.1,155.5,154.3,147.8,141.0,135.9,134.7,130.7,130.1,128.4,124.3,121.1,117.1,113.7,67.2,53.1,47.4。化合物5c 淡黄色固体。1H NMR(400 MHz,CDCl3):8.55(1,H s,CH),8.00(2H,d,J=8.0 Hz,Ar-H),7.74(1H,s,Ar-H),7.65 7.69(2H,m,Ar-H,CHCH),7.49 7.55(3H,m,Ar-H,CHCH),7.34 7.40(2H,m,Ar-H,),7.22(2H,d,J=8.0 Hz,Ar-H),6.86(d,2H,J=8.4 Hz,Ar-H),4.04(2H,s,COCH2),3.45(4H,t,J=8.0 Hz,NCH2),2.80(4H,t,J=8.0 Hz,NCH2),2.39(3H,s,CH3);13C NMR(101 MHz,CDCl3):194.5,188.2,159.5,155.3,154.2,148.1,140.8,134.7,130.2,129.5,128.6,124.4,121.2,116.8,113.5,67.4,53.1,47.5,21.4。化合物5d 浅黄色固体。1H NMR(400 MHz,CDCl3):8.57(1H,s,CH),8.00(2H,d,J=12.0 Hz,Table 1Structure and yield of derivatives 5a-5hCompd.5a5b5c5dRYield/%77827481Compd.5e5f5g5hRYield/%84857075566第 54 卷第 5 期沈云虹，等：查耳酮衍生物的合成及联合氟康唑抗耐药白色念珠菌活性CHCH),7.66 7.72(3H,m,Ar-H),7.33 7.44(6H,m,Ar-H),6.91 7.00(3H,m,Ar-H),4.05(2H,s,COCH2),3.94(3H,s,OCH3),3.46(4H,t,J=4.0 Hz,NCH2),2.80(4H,t,J=4.0 Hz,NCH2);13C NMR(101 MHz,CDCl3):196.1,189.9,164.3,159.1,156.7,154.1,149.6,143.1,134.7,130.8,130.3,128.8,128.2,125.2,123.0,120.7,117.7,116.9,114.5,113.8,61.4,55.1,53.1,48.0。化合物5e 浅黄色固体。1H NMR(400 MHz,CDCl3):8.62(1H,s,CH)8.00(2H,d,J=8.0 Hz,Ar-H),7.66 7.71(3H,m,Ar-H,CHCH),7.26 7.45(3H,m,Ar-H),6.93(2H,d,J=8.0 Hz,Ar-H),6.86(2H,s,Ar-H),4,04(2H,s,COCH2),3.92(6H,s,OCH3),3.89(3H,s,OCH3),3.45(4H,t,J=4.0 Hz,NCH2),2.80(4H,t,J=8.0 Hz,NCH2);13C NMR(101 MHz,CDCl3):194.5,188.2,159.2,155.4,154.2,153.6,148.1,143.5,140.2,134.8,140.2,134.8,131.0,130.8,130.4,128.5,125.3,124.2,121.6,118.3,117.0,113.7,105.6,67.2,61.2,56.4,53.1,47.4。化合物 5f 浅黄色固体。1H NMR(400 MHz,CDCl3):8.62(1H,s,CH)8.01(2H,d,J=12.0 Hz,CHCH),7.67 7.76(3H,m,Ar-H),7.33 7.44(3H,m,Ar-H),7.16 7.25(4H,m,Ar-H),6.94(2H,t,J=12.0 Hz,Ar-H),4.05(2H,s,COCH2),3.96(6H,d,J=8.0 Hz,OCH3),3.45(4H,t,J=4.0 Hz,NCH2),2.80(4H,t,J=4.0 Hz,NCH2);13C NMR(101 MHz,CDCl3):194.2,189.6,149.3,148.1,143.5,134.8,130.7,130.4,128.7,128.5,125.3,122.9,120.2,116.9,113.8,111.3,110.2,56.1,56.1,53.2,47.5。化合物5g 浅黄色固体。1H NMR(400 MHz,CDCl3):8.60(1H,s,CH)8.00(2H,d,J=8.0 Hz,Ar-H),7.66 7.71(3H,m,Ar-H,CHCH),7.52(1H,d,J=16.0 Hz,Ar-H),7.35 7.41(2H,m,Ar-H),6.93(2H,d,J=8.0 Hz,Ar-H),6.78(2H,s,Ar-H),6.52(1H,t,J=4.0 Hz,Ar-H),4,05(2H,s,COCH2),3.84(6H,d,J=8.0 Hz,OCH3),3.46(4H,t,J=4.0 Hz,NCH2),2.80(4H,t,J=4.0 Hz,NCH2);13C NMR(101 MHz,CDCl3):199.3,188.2,161.2,154.3,148.1,143.3,137.4,134.8,130.9,130.4,128.4,125.3,124.3,122.7,118.4,116.9,113.7,106.3,102.5,67.2,55.6,53.1,47.4。化合物 5h 黄色固体。1H NMR(400 MHz,CDCl3):8.50(1H,s,CH),7.93(2H,d,J=8.0 Hz,Ar-H),7.59 7.68(3H,m,Ar-H,CHCH),7.44 7.51(3H,m,Ar-H),7.19 7.34(4H,m,Ar-H),6.86(2H,d,J=8.0 Hz,Ar-H),3.98(2H,s,COCH2),3.39(4H,t,J=4.0 Hz,NCH2),2.73(4H,t,J=4.0 Hz,NCH2);13C NMR(101 MHz,CDCl3):188.7,182.0,155.4,154.3,148.1,141.8,136.1,134.8,130.9,130.4,129.6,129.3,125.3,122.6,118.4,116.9,113.7,67.2,53.1,47.3。2.3目标化合物体外抗白色念珠菌活性采用微量稀释法测试目标化合物的体外抗白色念珠菌活性。阳性对照药物FLC和目标化合物分别溶于 DMSO，超声 10 min，离心取上清液，储存浓度为 50 mg/mL，4 冰箱密封保存。取 96孔培养板，目标化合物及FLC均稀释成初始浓度为200 g/mL，6个浓度梯度，每个浓度梯度3个重复孔，每孔 100 L，进行 5 倍倍比稀释。菌株活化2次后制备菌悬液，每孔加入真菌菌悬液100 L，使白色念珠菌的终浓度为1 105 CFU/mL，按照对照组、FLC组、化合物组、化合物+FLC组，微量稀释法加入对应药物进行梯度稀释，分别加入真菌悬液，SC5314 于 30 恒 温 培 养 箱 内 孵 育 24 h，SC5314FR于 37 恒温培养箱内孵育 24 h。酶标仪测定625 nm下的吸收度，计算联合指数（FICI）。FICI=MICA/A+MICB/B（式中A和B分别为两药单用时的 MIC，MICA 和 MICB 分别为两药联合时的MIC）。当MIC高于检测最高限时，以最高限浓度的两倍用以计算FICI。实验同时设置培养基空白对照、菌液对照以及FLC阳性药物对照。本实验中 MIC50的计算以 FLC 的最小真菌生长 50%时的抑制百分数来计算。当FICI 0.5时，两药的作用方式为协同；当0.5 4时，两药的作用方式为拮抗。3 结果与讨论 3.1目标化合物的合成中间体2和4参照文献合成9-10。目标化合物5a 5h的合成路线如图1所示，前期研究和文献报道11-12，N-杂环化合物和-卤代酮的反应常用的催化剂有K2CO3和DIPEA，但在合成目标化合物5567学 报 Journal of China Pharmaceutical University 2023，54（5）：564-568第54 卷时，用碳酸钾催化反应，反应速度较慢、转化率低且副产物相对较多，DIPEA催化反应时，反应速度更快，副产物相对少，转化率也较高，因而采用DIPEA催化合成目标化合物5a 5h。3.2抗白色念珠菌活性从表2中可以看出，化合物5a 5h单用时对白色念珠菌氟康唑敏感株SC5314和白色念珠菌氟康唑耐药株SC5314-FR都没有抑制活性。但当其与FLC联用时对白色念珠菌耐药株SC5314-FR表现出了很好的协同抑制活性，特别是化合物5e和5g的MIC50分别为15.82和5.60 g/mL。从衍生物结构上来看，查耳酮 A 环上含有供电子基团（Me2N,CH3,CH3O）时活性较优，并以甲氧基取代时活性最强，且取代基数量越多协同抗菌作用越强，而含有卤素（Cl）取代时活性会降低。分级抑菌浓度指数（FICI）为抗菌药药效学参数之一，是用来评判两种抗菌药物相互作用方式的标准。从表2可以看出，在合成的8个衍生物中，有7个化合物（5a 5g）与FLC联用时对白色念珠菌耐药株 SC5314-FR 的 FICI 为 0.03 0.35 g/mL，表明香豆素-查耳酮衍生物与FLC通过协同作用发挥抗菌活性。由此看出，该类衍生物可作为抗真菌药物的增效剂。4 结 论 本研究设计合成了 8 个香豆素-查耳酮衍生物，体外活性实验研究表明，该类衍生物能协同FLC发挥抗耐药真菌活性，可作为抗真菌药物增效剂，更多抗菌机制和体内活性研究正在进行中。References1Hao XK,Wang YH.Research progress on the effects of drug combinations on drug-resistant Candida albicansJ.J Med Theory Pract(医学理论与实践),2021,34(24):4256-4258.2Zhao J,Li R,Dai L,et al.Design,synthesis and evaluation of the compounds combined with fluconazole against drug resistant Candida albicansJ.J Pharm Pract(药 学 实 践 杂 志),2016,34(2):129-134.3Lee JS,Bukhari SN,Fauzi NM.Effects of chalcone derivatives on players of the immune systemJ.Drug Des Devel 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