产气荚膜梭菌主要毒素生物学活性研究进展.pdf

综述产气英膜梭菌主要毒素生物学活性研究进展上海畜牧兽医通讯2 0 2 3年第4期王建东，王景松1.2*，王健霖，李继东，郭亚男1*（1宁夏农林科学院动物科学研究所，宁夏银川7 50 0 0 2；2宁夏大学动物科技学院，宁夏银川7 50 0 2 1)摘要：梳理和总结了产气荚膜梭菌的主要毒素种类、生物学活性、致病机制等，为后续的毒素分型、快速检测方法建立以及相关致病机制研究提供参考。关键词：产气荚膜梭菌；毒素；生物学活性；研究进展产气荚膜梭菌（Clostridiumperfringens）又称为产气荚膜芽孢杆菌、魏氏芽孢杆菌和魏氏梭菌，是一种革兰阳性专性厌氧杆菌，可形成芽孢，不能运动1-2 ；该菌在环境(包括污染的水、食物和土壤)中分布广泛，也是人类和其他动物正常胃肠道微生物群的组成部分，属于条件致病菌。在临床上，人类和动物的气性坏疽、食物中毒、非食源性腹泻、肠炎和肠毒血症等全身或肠道疾病都与产气荚膜梭菌有一定的关系 3-41。因此，笔者对目前产气荚膜梭菌主要毒素的生物学活性、致病机制等研究进行综述，为后续的毒素分型、快速诊断方法建立以及相关致病机制研究提供参考。1产气荚膜梭菌生物学特性产气荚膜梭菌虽为厌氧菌，但可在有氧环境中存活，甚至在有氧环境和其他氧暴露组织中传播和诱发疾病 5。产气荚膜梭菌是目前已知的繁殖速度最快的微生物之一，在最佳培养基中43培养8 12 min或37 培养12 17 min即可繁殖一代，比大肠杆菌等肠道共生菌繁殖速度快2 倍。产气荚膜梭菌强大的生存能力和快速的繁殖速度使其能够更加有效定植，从而造成人和动物的组织毒性感染（气性坏疽、成人胃肠炎和新生儿坏死性小肠结肠炎、畜禽坏死性肠炎、家畜气性坏疽和肠毒血症等）。2产气荚膜梭菌毒素分型产气荚膜梭菌致病性与其能产生2 0 余种毒素和酶，即、e、肠毒素（clostridiumperfringensenterotoxin，CPE）、坏死性肠炎B样毒素（necrotic enteritisB-like toxin，Ne t B)、K、0 和2等 1.6-7 是分不开的。由于不同菌株所产生的毒素有很大差异性，因此可根据所产毒素差异对产气荚膜梭菌进行分型，这种分型方式称为毒素分型。1933年，学者WILSDON首次提出产气荚膜梭菌毒素分型方案，即将产生、和毒素的菌株分为A、B、C和D型L8；后来该分型方案经过3次修改，改为被广泛认可的A、B、C、D 和E型。2 0 18 年ROOD等 9 再次对毒素分型方案进行了修改和补充，根据、肠毒素和NetB 6种主要毒素产生情况,产气荚膜梭菌被分为A、B、C、D、E、F和G型7 种毒素类型,如表1所示。基金项目：宁夏回族自治区重点研发项目“规模羊场地方高发疫病快速诊断技术研究与示范”（2 0 2 1BEF02026)作者简介：王建东（19 8 0 一），男，硕士，副研究员，主要从事动物疾病防治研究。*通信作者,E-mail:;E-mail:18综述类型ABCDEFG注：“十”表示产生，“一”表示不产生。3产气荚膜梭菌主要毒素生物学活性3.1毒素基因的调控产气荚膜梭菌基因组的GC含量相对较低（2 7%2 8%），全基因组大小为3.0 4.1Mb。全基因组分析表明,产气荚膜梭菌缺乏氨基酸生物合成所需的许多基因 10 。为了在感染条件下获得所需的营养物质，产气荚膜梭菌通过分泌毒素和酶，降解宿主体内的大分子。这就需要一个毒素基因表达调节系统来控制感染过程，并快速有效地从宿主组织中获得营养物质。产气荚膜梭菌的毒素基因表达系统是由经典的双组分调节系统VirS/VirR，即VirS膜传感器组氨酸激酶和VirR转录调节器组成。当VirS感受到信号后，其自身的1个组氨酸残基发生自我磷酸化，先转移至天冬氨酸残基上，然后转移至另1个组氨酸残基上，最终使调控因子VirR发生磷酸化。磷酸化的VirR是毒素基因编码产物的转录激活物 11。3.2 毒素毒素，又称为cpa或plc或磷脂酶C。编码毒素的基因位于所有产气荚膜梭菌染色体最稳定的区域，并且所有菌株均可产生毒素 12 。产气荚膜梭菌A型产生的毒素含量通常比其他型菌株高 13。毒素是一种相对分子质量为430 0 0 的蛋白质，由37 0 个氨基酸组成，包含2 个结构域，1个是含有磷脂酶C活性位点的螺旋状N端结构域,另1个是参与膜结合的三明治结构域。毒素在氨基酸水平上与双酶梭菌、诺维氏梭菌、巴拉特梭菌及不同梭菌的磷脂酶C有抗原性交叉反应及50%以上的同源性 14。毒素是一种通过酶活性修饰细胞膜的毒素，可水解宿主细胞膜的2 种固有成分一一卵磷脂和鞘磷脂,对许多动物种属的红细胞及其他细胞的膜结构造成损伤 15。毒素在厌氧性蜂窝组织炎和气性坏疽中发挥着重要作用：毒素能够影响中性粒细胞等免疫细胞向感染的组织转移，以此减少对感染部位病原体的清除 16 ；毒素损害白细胞的迁移，使病变周围的白细胞淤滞 17 ,这些游离的血管内聚集体负责阻断小血管中的血流，随后导致组织缺氧和坏死 18 ，同时为产气荚膜梭菌的增殖创造无氧条件。A型产气荚膜梭菌感染引起的肠毒血症可表现为反台动物暴发性胃炎、肠毒血性黄疽和黄羔病，牛、马和幼驼出血性肠炎，禽坏死性肠炎（necrotic enteritis,NE），人食物中毒。其中黄羔病的临床症状表现为精神萎靡、贫血、黄疽和血红蛋白尿,尸检表现为肝脏和脾脏苍白质脆、脾脏充血、肺脏充血和肾脏伴有血红蛋白沉淀 19 。有研究表明：在健康犊牛的瘤胃内接种产气荚膜梭菌A型菌株可引起特牛厌食、精神萎靡、腹胀、腹泻，甚至死亡；在犊牛的小肠中接种大量产气荚膜梭菌A型菌株不能引起肠道疾病 2 0 1。毒素是参与人类气性上海畜牧兽医通讯2表1产气英膜梭菌毒素分型及相关疾病主要毒素引发的疾病人和动物气性坏疽；动物坏死性肠炎+羔羊痫疾；牛和马的坏死性肠炎和肠毒血症+人急性出血性坏死性肠炎；新生动物坏死性肠炎和肠毒血症+人肠毒血症；绵羊、山羊、牛的肠毒血症+绵羊和牛的肠毒血症；牛和兔的肠炎+人食物中毒、散发性腹泻、抗生素相关性腹泻+禽类坏死性肠炎+192023年第4期CPENetB一一+一一+一一一一一一一+一一一一+/一+/一+/一+一一一一一+综述坏疽的主要产气英膜梭菌毒素 2 1,其致病特征为广泛的局部组织破坏和坏死，进展为休克和死亡 2 3.3毒素毒素由产气荚膜梭菌B型和C型产生，编码毒素的基因位于质粒上，由336 个氨基酸组成，相对分子量约为350 0 0。纯化后的毒素不耐热，在50 下孵育1h或10 0 下孵育10 min，即可灭活9 0%以上。毒素是一种穿孔毒素，通过影响钙离子在神经细胞膜内的分布，进而影响神经组织的功能，破坏正常的神经传导。此外,该毒素与金黄色葡萄球菌产生的毒素、毒素和杀白细胞素具有序列相似性 2 3。毒素是引起动物小肠出血性肠炎的主要因子，患病动物临床症状表现为精神沉郁、厌食、腹痛和腹泻，病程短,死亡率接近10 0%2 4。特征性的肠道病变为出血性肠炎,肠外病变包括充血、水肿、浆膜渗出和多器官出血 2 5。3.4毒素毒素由产气荚膜梭菌B型和D型菌株产生，编码毒素的基因位于质粒上，相对分子量约为34 000L261。该毒素主要作用于真核细胞膜上的胆固醇和鞘脂，是一种通透酶，通过影响细胞骨架功能发挥作用，造成上皮细胞和内皮细胞的通透性增加，特别是作用于脑的微血管系统，使毒素渗人脑组织 2 7。毒素是产气荚膜梭菌所产生的毒素中毒性最强的一种，半数致死量为7 0 ng/kg,其毒性仅次于肉毒杆菌毒素和破伤风神经毒素，按危害性被列为第三大毒素 2 8-2 9 。该毒素可造成多种动物的血压升高、平滑肌收缩力增加、血管通透性增加以及脑水肿和肺水肿。该毒素被蛋白酶激活后,转化为强活性的毒素，毒性约为前毒素的10 0 0 倍 30 。有实验表明，绵羊、山羊、牛、小鼠和大鼠静脉注射毒素后，许多组织的血管通透性增加，表现急性肺水肿和脑水肿，并伴有白蛋白外渗 31-32 。由于毒素有作为生物武器的潜在用途，产e毒素的产气英膜梭菌毒株已被美国和英国等一些国家列出口管制名单 3。产气荚膜梭菌D型菌株感染可引起羔羊肠毒血症（“过食症”和“软肾病”），山羊和小牛偶有发生。D型菌株分泌的。毒素能增加肠的通透性，从而容易被吸收人血，进而损害脉管的内皮细胞，造成循环液的丢失，引起动物水肿 31。当体内毒素含量较高时，可损害脑内毛细血管内皮细胞，引发的水肿可使颅内压大大增加。当体内毒素水平较低时（或动物已免疫或肠道内毒素产量较低时），毒素对脑内毛细血管内皮细胞的损害引起脑组织内毒素水平升高，从而造成动物的局灶性对称性脑软化。毒素还可触发儿茶酚胺的分泌，从而激活腺苷酸环化酶,出现cAMP相关性的高血糖和糖尿。在发生肠毒血症的动物中，这些指标的变化通常可检测到。产气荚膜梭菌D型菌株感染可引起绵羊急性、亚急性或慢性神经病症，特征为猝死或神经系统和呼吸系统体征，包括失明、角弓反张、惊厥、口吐白沫和临死前横卧划动等症状，偶尔出现腹泻症状 34。在山羊亚急性病例中,无论是否接种疫苗，其特征都为出血性腹泻、腹部不适、严重休克、肠痉挛和惊厥，发病2 4 d后死亡 35。接种疫苗的成年动物也会表现出慢性疾病，其特征是大量水样腹泻、腹部不适、虚弱、厌食症和无乳症，这种症状持续数天或数周。3.5 毒素毒素主要由产气荚膜梭菌E型产生。毒素是一种二元毒素，由1个能将毒素结合于上皮细胞的结合部分Ib（相对分子质量为10 0 0 0 0)和1个酶激活部分Ia（相对分子质量为450 0 0)组成。Ia和Ib作为原蛋白产生，当二者的N端序列被宿主蛋白酶或者产气荚膜梭菌入毒素去除时其活性被激活。Ib与炭疽杆菌保护性抗原PA表现出一定的相似性，但在受体结合区域中没有表现出相似性，这与Ib和PA识别不同受体是一致的 36-37 。Ib 含有4个结构域，分别具有为Ia 提供结合位点、参与孔通道的形成、参与寡聚反应以及为宿主细胞受体提供结合位点的功能 37 。Ib和Ia具有协同作用：Ib毒素结合于细胞表面的特异性受体后，通过形成七聚体结构在细胞膜上形成上海畜牧兽医通讯2 0 2 3年第4期20综述一个孔道，使Ia 部分通过内吞作用进人细胞质 38 。在细胞质内，Ia 是一个ADP-核糖基化毒素，可以引起宿主细胞内肌动蛋白Arg-177的ADP核糖基化，从而造成细胞骨架破坏和感染细胞死亡。毒素可以在宿主细胞内持续存在至少2 4 h,这导致了细胞凋亡的延迟 39 。3.6 CPECPE主要由产气荚膜梭菌F型产生，部分C型、D型和E型也可以产生。CPE是一种含有319 个氨基酸的蛋白质，相对分子量为350 0 0,其一级氨基酸序列与其他蛋白质缺乏显著的序列同源性，二级结构为80%的-折叠和2 0%的无规卷曲。由N端结构域和C端结构域组成，前者对孔形成和细胞毒性很重要，后者介导受体结合。全长CPE(1319 位氨基酸)具有细胞毒性，通过缺失诱变去除CPE前45个氨基酸，可使CPE细胞毒性增加2 3倍；然而，删除第45位残基以外的氨基酸可使 CPE无细胞毒性 40 1。编码产气荚膜梭菌CPE的基因位于染色体或质粒上,其中来自人的食物相关性胃肠疾病病例的分离株位于染色体上，而来自动物腹泻病例和人的非食物相关性胃肠疾病病例的分离株位于质粒上。无论是位于染色体还是质粒上，cpeORF在C型、D型和F型中都高度保守。产气荚膜梭菌在形成芽孢的过程中，产肠毒素型菌株可产生肠毒素，菌体在释放芽孢时，肠毒素也随之释放到周围环境中。F型菌株可引起食物中毒，被列为第二大常见细菌性食源性疾病的病原体 41。美国每年发生10 0 万例细菌性食源性疾病，涉及约4亿美元的经济损失 42 ，其中每年约2 6 人因产气荚膜梭菌F型食物中毒死亡 41.43。2 0 11年在欧盟成员国中，与产气莱膜梭菌有关的食物中毒病例预计每年约为50 0 万例 4。F型产气荚膜梭菌致人食物中毒的高发生率可归因于几个因素：首先，F型菌株在食物中很常见 45，如果食物在食用前未完全煮熟或未及时食用且放在有污染的环境中，则为菌株感染提供充足的机会；其次，该菌株的繁殖速度快，10 min即可达到引发胃肠道疾病所需的细菌量；最后,大多数产气荚膜梭菌F型菌株在未完全煮熟或保存不当的食物中存活能力突出，是因为其孢子的耐热性、耐寒性和耐食物防腐剂性强。只有孢子化的产气荚膜梭菌F型菌株才可以产生CPE，该毒素产生后不会立即被释放出来，而是在孢子发育成熟后，母细胞裂解释放出成熟的子孢子时才被释放到肠腔中，然后与肠上皮细胞结合，发挥毒性作用，导致绒毛缩短和肠道上皮细胞脱落。CPE首先破坏小肠绒毛的尖端，最终破坏整个绒毛，其中回肠最为敏感。产气荚膜梭菌F型食物中毒通常包括腹泻和腹部痉挛，在摄人受污染的食物8 16 h内发生。这个潜伏期很大程度上反映了产气荚膜梭菌完成产孢并将CPE释放到肠腔内所需要的时间。产气荚膜梭菌还与非食源性腹泻(与食物中毒不同的一种疾病，主要特征是症状更严重和持续时间更长)有关，包括抗生素相关性腹泻和散发性腹泻。5%2 5%的患者在使用广谱抗生素后，会发生抗生素相关性腹泻。食源性腹泻通常影响6 0 岁以上的老年人（尽管散发性腹泻也与较年轻的人群有关），临床症状为腹痛、长时间腹泻（3d至数周)和排血性便。患有非食源性腹泻病例,特别是抗生素相关性腹泻患者,病情可因腹泻引起脱水而严重，并可能发展为结肠炎。3.7 NetBNetB是一种孔形成毒素（由基因netB编码），相对分子质量为330 0 0，主要由产气荚膜梭菌G型产生。NetB是-孔形成毒素家族的成员，与毒素序列具有38%的同源性，与金黄色葡萄球菌的毒素序列具有31%的同源性，与产气荚膜梭菌的毒素具有40%的同源性 46 。NetB毒素以水溶性单体形式分泌，与宿主细胞膜结合，以低聚物的形式组装形成七聚孔，随后形成跨膜孔。在与受体结合后，单体分子一般利用细胞膜的流动性来缩短单体之间的分子距离，并进行寡聚，在宿主细胞膜上形成孔洞，最终导致细胞死亡 417 。G型产气荚膜梭菌作为禽NE的主要致病菌,其分泌的NetB是引发NE的关键因素，严重危害家禽的健康。对广东省鸡场产气荚膜梭菌流行情况的调查结果显示，6 0 0 份粪便样品中共分离出A型产气荚膜梭菌158 株、G型1株 48 。LIU等 49 对泰安某大型零售市场鸭产品产气荚膜梭菌污染情况进行调查，共采集上海畜牧兽医通讯2 0 2 3年第4期21综述鸭产品17 3份、环境样品10 份、健康店主新鲜粪便7 份，产气荚膜梭菌阳性样品分别为58 份（31.6 9%）、10份（10 0%）和7 份（10 0%），经鉴定均为A型。禽NE的主要临床症状是精神抑郁、腹泻、生长缓慢、采食量低,因此严重影响了禽的生产性能以及养殖户的生产效益。3.80毒素毒素由基因pfoA或PFO编码，也是一种穿孔毒素，作用于含胆固醇的细胞膜。已证明该毒素参与了小牛气性坏疽和出血性肠炎的发病机制 2 0。0 毒素与在链球菌、芽孢杆菌、李斯特菌和许多其他菌属中鉴定出的相似穿孔毒素具有结构同源性。毒素在宿主中还具有诱导肿瘤坏死因子和白细胞介素6 表达的能力，体外模型显示，它可以通过p38MAPK(丝裂原激活蛋白激酶)途径诱导细胞凋亡 50 1。4结语产气荚膜梭菌是一种条件致病菌，广泛存在于环境中，可大量繁殖并产生毒素，引起人类和动物的多种疾病，严重危害人类和动物的健康，给公共安全造成威胁。由于产气荚膜梭菌可产生2 0 余种毒素和酶，不同的毒素所引发的疾病又略有区别,临床疾病往往由多种毒素共同引起。产气荚膜梭菌相关致病机制尚需进一步深入研究，并建立快速、有效诊断方法，以有效防控相关疾病的发生。上海畜牧兽医通讯2 0 2 3年第4期参考文献1J KIU R,HALLL J.An update on the human 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