茶树菇多糖通过ROS-线粒体功能障碍通路诱导结直肠癌细胞凋亡.pdf

收稿日期:.基金项目:国家自然科学基金杰出青年项目().作者简介:汪紫薇(),女,硕士生.通信作者:周兴涛(),男,副教授,博士.汪紫薇,陈坤英,张 珂,等茶树菇多糖通过R O S 线粒体功能障碍通路诱导结直肠癌细胞凋亡J南昌大学学报(理科版),():WANGZW,CHE NK Y,Z HANG K,e ta l A g r o c y b ec y l i n d r a c e ap o l y s a c c h a r i d ei n d u c e da p o p t o s i so fc o l o r e c t a lc a n c e rc e l l st h r o u g hR O S m i t o c h o n d r i a l d y s f u n c t i o np a t h w a yJJ o u r n a l o fN a n c h a n gU n i v e r s i t y(N a t u r a lS c i e n c e),():茶树菇多糖通过RO S 线粒体功能障碍通路诱导结直肠癌细胞凋亡汪紫薇,陈坤英,张珂,胡婕伦,聂少平,周兴涛(南昌大学食品科学资源挖掘全国重点实验室,江西 南昌 )摘要:结直肠癌(C o l o r e c t a l c a n c e r,C R C)是一种全球性的消化道癌症,其致死率和发病率位居全球前三,给全人类的身体健康带来巨大威胁.常见的结直肠癌化疗药物具有一定副作用,因此人们正在积极寻求低副作用的天然产物对抗C R C.本研究通过体外细胞实验探究茶树菇多糖(A g r o c y b e c y l i n d r a c e ap o l y s a c c h a r i d e,A C P)抑制结直肠癌细胞增殖的作用机制.结果显示,茶树菇多糖明显抑制了结直肠癌细胞(HC T 、C T )增殖且呈浓度和时间依赖性,而对正常肠上皮细胞I E C 无明显毒性.此外,R NA s e q结果指出茶树菇多糖下调了氧化磷酸化通路.进一步的实验表明茶树菇多糖导致了活性氧(R e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s,R O S)积累、线粒体膜电位丧失和功能障碍,进而促进HC T 细胞凋亡.值得关注的是,NA C(N a c e t y l L c y s t e i n e)能通过清除R O S抑制茶树菇多糖诱导的细胞凋亡.综上实验结果表明,茶树菇多糖能够通过R O S 线粒体功能障碍通路诱导HC T 细胞凋亡,最终达到抑制其增殖的目的,为开发治疗结直肠癌的低敏感性药物提供新线索,同时为茶树菇多糖的利用提供理论依据.关键词:茶树菇多糖;结直肠癌;活性氧;线粒体功能;凋亡中图分类号:R 文献标志码:A文章编号:()A g r o c y b ec y l i n d r a c e ap o l y s a c c h a r i d e i n d u c e da p o p t o s i so f c o l o r e c t a lc a n c e rc e l l s t h r o u g hR O S m i t o c h o n d r i a l d y s f u n c t i o np a t h w a yWANGZ i w e i,CHE NK u n y i n g,Z HANGK e,HUJ i e l u n,N I ES h a o p i n g,Z HOUX i n g t a o(S t a t eK e yL a b o r a t o r yo fF o o dS c i e n c ea n dR e s o u r c e s,N a n c h a n gU n i v e r s i t y,N a n c h a n g ,C h i n a)A b s t r a c t:C o l o r e c t a l c a n c e r(C R C)i sag l o b a l d i g e s t i v e t r a c t c a n c e rw h i c hr a n k sa m o n gt h e t o pt h r e e i nt e r m so fm o r t a l i t ya n d i n c i d e n c ew o r l d w i d ea n dp o s e sas i g n i f i c a n t t h r e a tt oh u m a nh e a l t h C o mm o nc o l o r e c t a lc a n c e rc h e m o t h e r a p yd r u g sh a v ec e r t a i ns i d ee f f e c t s,s op e o p l e a r e a c t i v e l y s e e k i n g l o ws i d e e f f e c t so f n a t u r a l p r o d u c t s t o c o m b a tC R C I n t h i s s t u d y,t h e i n h i b i t o r ym e c h a n i s mo fA g r o c y b ec y l i n d r a c e ap o l y s a c c h a r i d e(A C P)o nc o l o r e c t a lc a n c e rc e l lp r o l i f e r a t i o nw a se x p l o r e dt h r o u g hi nv i t r oc e l l e x p e r i m e n t s T h er e s u l t ss h o w e dt h a tA C Pi n h i b i t e dt h ep r o l i f e r a t i o no f c o l o r e c t a l c a n c e r c e l l s(HC T ,C T )i na c o n c e n t r a t i o n a n d t i m e d e p e n d e n tm a n n e r,b u t e x h i b i t i n gn oo b v i o u s t o x i c i t y t on o r m a l i n t e s t i n a l e p i t h e l i a l c e l l s I E C I na d d i t i o n,R NA s e qr e s u l t si n d i c a t e dt h a t A C Pd o w n r e g u l a t e dt h eo x i d a t i v ep h o s p h o r y l a t i o np a t h w a y F u r t h e re x p e r i m e n t ss h o w e dt h a tA C Pl e dt oR O Sa c c u m u l a t i o n,m i t o c h o n d r i a lm e m b r a n ep o t e n t i a l l o s sa n dd y s f u n c t i o n,t h e r e b yp r o m o t i n gHC T c e l l sa p o p t o s i s I n t e r e s t i n g l y,NA C(N a c e t y l L c y s t e i n e)c o u l d i n h i b i tA C P i n d u c e da p o p t o s i sb ys c a v e n g i n gR O S O v e r a l l,t h ee x p e r i m e n t a l r e s u l t sd e m o n s t r a t e dt h a tA C Pc o u l d i n d u c ea p o p t o s i so fHC T c e l l st h r o u g ht h eR O S m i t o c h o n d r i a ld y s f u n c t i o np a t h w a y,u l t i m a t e l ya c h i e v i n g t h eg o a l o f i n h i b i t i n g t h e i rp r o l i f e r a t i o n I t p r o v i d e dn e wc l u e s f o r t h ed e v e l o p m e n t o fl o ws e n s i t i v i t yd r u g s f o r t h e t r e a t m e n to f c o l o r e c t a l c a n c e r,a n dp r o v i d e dt h e o r e t i c a l b a s i s f o r t h eu t i l i z a t i o no fA C P第 卷第期 年月南昌大学学报(理科版)J o u r n a l o fN a n c h a n gU n i v e r s i t y(N a t u r a lS c i e n c e)V o l N o A u g K e yW o r d s:A g r o c y b e c y l i n d r a c e ap o l y s a c c h a r i d e;c o l o r e c t a l c a n c e r;r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s;m i t o c h o n d r i a l f u n c t i o n;a p o p t o s i s结直肠癌是一种全球性消化道恶性肿瘤,同时也是医学史上巨大的挑战之一.年,WHO国际癌症研究机构公布的数据表明,全球人口中有 多万人被诊断为结直肠癌,占全球所有新诊断癌症的.中国人口总数中被新确诊为结直肠癌的患者超过 万,占中国新确诊癌症人数的,另外,在中国女性群体中,因为结直肠癌而死的人数仅次于肺癌致死人数.结直肠癌已成为中国女性癌症死亡的第二大杀手.由于结直肠癌的症状多出现在中晚期,因此大多数患者在中晚期才被确诊,错过最佳治疗时机,这导致结直肠癌的死亡率居高不下.研究表明,结直肠癌的致死率和发生率在癌症中排名前三.结直肠癌的常见治疗方法是手术切除和化疗,但是手术切除无法彻底清除肿瘤,而且化疗伴有肠功能障碍和神经病变等副作用,严重损害患者的身体.因此,开发低副作用的天然来源活性成分是对抗结直肠癌症的当务之急,.茶树菇(A g r o c y b e c y l i n d r a c e a)隶属真菌界,又名柱状田头菇、茶菇、杨树菇、茶薪菇、柱状环锈伞等,广泛分布在亚热带和北温带地区.我国设有多个茶树菇生产地,比如主要生产干菇的福建古田县和江西、生产鲜菇的昆明和成都等地.茶树菇是一种兼 具口感、香 味、营养和药 用价值的食 用菌,富含多种人体必需氨基酸、大量的蛋白质、丰富的B族维生素和多种矿质元素钾、钠、镁、锌,号称“中华神菇”.大量研究发现,茶树菇在抗肿瘤、抗氧化、抑菌和免疫调节等方面具有非常好的潜在研究价值 .茶树菇多糖是从茶树菇中提取出的主要活性成分之一.研究证明茶树菇多糖对人类疾病的研究表现出重要的生理研究价值.例如,茶树菇多糖显著地抑制了小鼠体内的腹水瘤和植入的肉瘤,升高了环磷酰胺作用的小鼠体内白细胞数.茶树菇多糖通过腹腔注射进入小鼠,显著增加了小鼠免疫器官脾脏的重量,同时显著增强了小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能,提高了小鼠免疫功能.在体外,热水法提取的茶树菇多糖对多种癌细胞具有明显的抗增殖的活性作用.线粒体是参与能量供应、生存信号传递、铁和钙缓冲、活性氧信号传递以及类固醇激素合成的多任务细胞器.为了确保所有这些任务都能有效地完成,线粒体在任何时候都需要保持稳态.R O S是细胞内超氧阴离子、羟自由基和过氧化氢的统称,主要来源于线粒体呼吸链.研究发现,正常水平的R O S是维持细胞稳态的一个必要条件,而过量的R O S产生则会引发细胞凋亡、损伤及死亡.其中R O S积累诱导的凋亡是通过触发线粒体通透性过渡孔的开放,影响线粒体功能,释放促凋亡因子造成的.本课题组前期的研究中,对茶树菇多糖的组成成分和多糖结构进行了研究.已有研究表明茶树菇多糖具有抗肿瘤活性,但其对结直肠癌细胞的功能活性作用机制尚不清楚.本研究通过体外细胞实验探究了茶树菇多糖抑制结直肠癌细胞增殖的分子机制.材料与设备材料与试剂小鼠结直肠癌细胞C T 和大鼠正常肠上皮细胞I E C ,中国上海科学院细胞库;人结直肠癌细胞HC T 和HC T 细胞专用培养基,中国武汉普诺赛生物公司;茶树菇多糖(糖含量、蛋白含量,提取方法和检测方法已报道),南昌大学食品科学与技术国家重点实验室;C C K 试剂盒,上 海D o j i n d o M o l e c u l a r T e c h n o l o g i e s公 司;DMEM培养基、R PM I培养基、胰蛋白酶 E D T A消化液()、多 聚 甲 醛、吖 啶 橙溴 化 乙 锭(AO E B)、结 晶 紫 染 液、H o c h e s t、T r i z o l试 剂 和P B S缓冲液片 剂,北京索莱 宝 公 司;牛 血 清 蛋 白(F B S),以色列B i o i n d公司;双氧水,中国西陇公司;线粒体压力测定试剂盒,美国A g i l e n tT e c h n o l o g i e s公司;M i t o T r a c k e rR e d荧 光 探 针,美 国T h e r m oF i s h e rS c i e n t i f i c公司;D i h y d r o e t h i d i u m(DHE)荧光 染 料,英 国A b c a m公 司;N a c e t y l L c y s t e i n e(NA C),上海碧云天公司.仪器与设备生化培养箱(S H P ),上海森信实验仪器公司;C O培养箱(HE R A C E L L 、B B )和酶标仪(V a r i o u s k a nF l a s h),美国T h e r m oF i s h e rS c i e n t i f i c公司;低温高速离心机(K ),德国S i g m a公司;倒置荧光显微镜(C K X ),日本奥林巴斯公司;超纯水净化系统(M i l l i Q),美国M i l i p o r e公司;超净工作 台,苏 州A I R T E CH公 司;凝 胶 成 像 系 统第期汪紫薇等:茶树菇多糖通过R O S 线粒体功能障碍通路诱导结直肠癌细胞凋亡(C h e m iX R S),美国B i o r a d公司;海马能量分析仪(S e a h o r s eX F),美国A g i l e n tT e c h n o l o g i e s公司.实验方法细胞培养I E C 、C T 和HC T 细 胞 分 别 使 用DMEM培养基(含 F B S)、R PM I培养基(含 F B S)和HC T 细胞专用培养基培养.传代步骤:待细胞汇合率达到 左右,倒掉旧培养基,无菌P B S清洗两遍,胰蛋白酶消化(不同细胞消化时间不一样,细胞开始缓慢脱落时终止消化),再离心收集细胞,按一定比例进行传代.细胞在、C O和饱和湿度的培养箱中培养.细胞增殖活性检测C C K 实验细胞接种于 孔板中(I E C :个细胞/孔/多糖培养 h,个细胞/孔/多糖培养 h;HC T :个细胞/孔/多糖培养 h,个细胞/孔/多糖培养 h;C T :个细胞/孔/多糖培养 h,个细胞/孔/多糖培养 h)培养过夜使其贴壁,每组设置个平行,然后将旧培养基更换成茶树菇多糖浓度分别为、和 gm L的培养基继续培养 h或 h.吸走旧培养基,加入含 C C K 的培养基混合液,继续孵育 m i n.使用酶标仪在 n m波长下测定各孔吸光度值(O D).细胞克隆形成实验C T 细胞(个/孔)接种于六孔板中,每组设置个平行.细胞在培养箱中培养d后,将培养基更换成茶树菇多糖浓度分别为、和 gm L的培养基继续培养 h.吸走旧培养基,加入多聚甲醛作用 m i n.用P B S洗两遍细胞,加入结晶紫染液作用m i n.用P B S再次洗两遍细胞后,使用凝胶成像系统拍照.转录组分析(R N A s e q)HC T 细胞接种于细胞培养皿中(个细胞)培养过夜使其贴壁,每组设置个平行,然后将旧培养基更换成茶树菇多糖浓度分别为和 gm L的培养基继续培养 h.吸走旧培养基,细胞用P B S洗一遍,加入T r i z o l试剂.通过吹打细胞使其破裂,释放R NA.最后所有样本通过干冰运送至天津诺禾生物信息科技有限公司完成后续测序步骤.通过HT S e q 软件计算测序数据,根据|l o g(f o l dc h a n g e)|和P v a l u e 筛选得到差异表达基因.在KO B A S(h t t p:/k o b a s c b i p k u e d u c n/i n d e x p h p)网站上分析信号通路变化.利用T B t o o l sv 软件绘制热图.R O S检测HC T 细胞接种于十二孔板中(个细胞/孔)培养过夜使其贴壁,每组设置个平行,然后将旧培养基更换成茶树菇多糖浓度分别为、和 gm L的 培 养 基 继 续 培 养 h.HO(m o lL,预处理h)作为阳性对照.吸走旧培养基,加入含m o lLDHE荧光染料的培养基混合液,避光孵育 m i n.使用倒置荧光显微镜观察R O S生成情况.若R O S增加,红色荧光将增强;若R O S减少,红色荧光将减弱.使用I m a g eJ软件进行半定量分析.线粒体膜电位检测HC T 细胞接种于十二孔板中(个细胞/孔)培养过夜使其贴壁,每组设置个平行,然后将旧培养基更换成茶树菇多糖浓度分别为、和 gm L的 培 养 基 继 续 培 养 h.HO(m o lL,预处理h)作为阳性对照.吸走旧培养基,加入预热 m i n后的含 n m o lLM i t o T r a c k e rR e d的培养基混合液,继续孵育 m i n.吸走培养基,加入H o e c h s t孵育 m i n.在倒置荧光显微镜下观察线粒体膜电位变化.若线粒体膜电位上升,红色荧光将增强;若线粒体膜电位下降,红色荧光将减弱.使用I m a g eJ软件进行半定量分析.线粒体压力测试通过海马能量分析仪测量氧消耗率(O C R),基于O C R分析线粒体各项指标(AT P产生量、基础呼吸值、质子漏、最大呼吸值、非线粒体呼吸值和线粒体备用呼吸能).HC T 细胞接种在海马能量分析仪配套的细胞培养小孔板中(个细胞/孔)培养过夜使其贴壁,每组设置个平行,然后将旧培养基更换成茶树菇多糖浓度分别为和 gm L的培养基继续培养 h.按照线粒体压力测定试剂盒说明书操作,在测量前一天晚上活化探针板.测量当天,细胞使用含 mm o lL葡萄糖、mm o lL丙酮酸、mm o lL谷氨酰胺的R PM I(p H为,预热)清洗,随后放入探针板,将寡霉素、F C C P、抗霉素A和鱼藤酮以终浓度为、和m o lL注射到相应的细胞培养孔中,细胞放入海马能量分析仪中测量各项南昌大学学报(理科版)年指标.最后采用软件W a v e对O C R数据进行分析.吖啶橙溴化乙锭(A O E B)染色实验HC T 细胞接种于十二孔板中(个细胞/孔)培养过夜使其贴壁,每组设置个平行,然后将旧培养基更换成茶树菇多糖浓度分别为、和 gm L的培养基继续培养 h.每孔加入 LAO E B染料(AO与E B等体积混合)染色m i n.使用倒置荧光显微镜拍照.凋亡细胞的荧光明显更亮.共有四种细胞:活细胞(染色质呈绿色、结构正常)、早期凋亡细胞(染色质呈绿色、结构收缩)、晚期凋亡细胞(染色质呈橙红色、结构收缩)和非凋亡的死亡细胞(染色质橙红色、结构正常).茶树菇多糖联合N A C作用于H C T 细胞采用AO E B染 色 法 检 测 茶 树 菇 多 糖 联 合NA C(R O S抑制剂)对HC T 细胞凋亡的影响,方法同.共设立个组别:正常组(N C);茶树菇多糖处理组(、gm L);抑制剂组(NA C):m o lL的NA C预处理 m i n;茶树菇多 糖 联 合NA C处 理 组(、gm LNA C):m o lL的NA C预处理 m i n后,然后加入茶树菇多糖浓度分别为、和 gm L的培养基.数据处理采用G r a p h P a dP r i s m软件对各组进行方差分析(双或单因素),显著性采用D u n n e t t或T u k e y多重比较检验确定.P:均值差异有统计学意义.统计差异显著性为:,P,显著;,P,极显著;,P ,超显著.结果以至少次独立实验的均数标准差(M e a n S D)表示.结果与分析茶树菇多糖抑制结直肠癌细胞增殖活性大量研究表明,多糖具有抗肿瘤活性.本研究中C C K 检测结果表明,茶树菇多糖显著抑制结直肠癌细胞HC T 和C T 增殖活力,并呈浓度和时间依赖关系.与正常组相比,HC T 细胞在 gm L茶树菇多糖处理 和 h后,细胞活力分别降低至 和(图 A),C T 细胞在 gm L茶树菇多糖处理 h和 h后,细胞活力分别降低至 和(图 B).此外,细胞克隆形成实验结果表明,C T 细胞增殖能力在 和 gm L茶树菇多糖组受到明显抑制(图 C和D).有趣的是,茶树菇多糖对正常肠上皮细胞I E C 增殖无抑制作用(图 E).上述结果表明,茶树菇多糖具有抑制结直肠癌细胞增殖的活性,且对正常肠上皮细胞无副作用.茶树菇多糖下调H C T 细胞氧化磷酸化通路为了探究茶树菇多糖抑制HC T 细胞增殖的机制,本研究进行了R NA s e q实验.结果表明茶树菇多糖显著下调了氧化磷酸化和呼吸电子传递等通路(图 A).此外,如图 B所示,MT N D、MT N D 等氧化磷酸化相关基因的转录水平显著下降(离散色阶:红色表示基因高表达,蓝色表示基因低表达).研究表明,氧化磷酸化通路的下调会导致肿瘤细胞增殖能力下降.例如,S a r a等研究发现白藜芦醇通过损害氧化磷酸化途径阻止转移性H e L a癌细胞生长.综上分析,茶树菇多糖抑制HC T NC200 gmL-1300 gmL-1400 gmL-1100500Cell viability(%of control)2448CT26(B)100500Cell viability(%of control)2448NC200 gmL-1300 gmL-1400 gmL-1HCT-116(A)t/ht/hC400 gmL-1300 gmL-1200 gmL-1NC第期汪紫薇等:茶树菇多糖通过R O S 线粒体功能障碍通路诱导结直肠癌细胞凋亡5004003002001000Number of cell cloneCT26(D)400300200NC300 gmL-1400 gmL-1150100500Cell viability(%of control)IEC-6(E)4824NC200 gmL-1gmL-1t/h将茶树菇多糖(、gm L)作用于HC T 细胞(A)、C T 细胞(B)和I E C (E)细胞、h,采用C C K 法检测细胞活力;(C)C T 细胞克隆形成实验的代表性图像;(D)细胞克隆数定量.图茶树菇多糖抑制结直肠癌细胞增殖F i g A C Pi n h i b i t e dc o l o r e c t a l c a n c e rc e l l sp r o l i f e r a t i o n(A)茶树菇多糖抑制HC T 细胞增殖的相关下调通路;(B)茶树菇多糖影响HC T 细胞中氧化磷酸化通路的热图.图茶树菇多糖下调H C T 细胞氧化磷酸化通路F i g A C Pd o w n r e g u l a t e do x i d a t i v ep h o s p h o r y l a t i o np a t h w a y i nH C T c e l l s细胞增殖的机制可能涉及氧化磷酸化通路的下调.茶树菇多糖诱导H C T 细胞R O S积累研究表明,氧化磷酸化受损通常会引起R O S过度产生,而R O S积累又会破坏线粒体电子传递链,进而抑制氧化磷酸化,形成一个“恶性循环”.因此,为了探究R NA s e q分析结果中茶树菇多糖下调的氧化磷酸化通路是否与R O S积累之间存在关系,本研究采用DHE荧光染料检测HC T 细胞中R O S的变化.结果如图 A所示,随着茶树菇多糖浓度增加,荧光明显增强.经定量统计分析发现,和 gm L茶树菇多糖在HC T 细胞中分别诱导了、倍以上的R O S(图 B).综上分析,茶树菇多糖显著诱导了R O S的积累.(A)H2O2300gmL-1400gmL-1NC200gmL-1(A)DHE荧光染料染色后的代表性图像南昌大学学报(理科版)年(B)2.01.51.00.50Average fluorescenceintensity(ROS)H2O2300200NC400#*#gm L(B)R O S平均荧光强度的定量图茶树菇多糖诱导H C T 细胞R O S积累F i g A C Pi n d u c e dR O Sa c c u m u l a t i o n i nH C T c e l l s 茶树菇多糖诱导H C T 细胞线粒体膜电位丧失在癌细胞中,高水平的R O S表明线粒体功能可能已经受损.此前,Z h a n g等人发现芦荟凝胶葡甘露聚糖诱导结直肠癌细胞C T 中R O S积累和线粒体膜电位下降进而导致线粒体功能障碍.线粒体膜电位是评估线粒体功能的常用参数.因此,本研究采用M i t o T r a c k e rR e d荧光探针检测线粒体膜电位变化.结果如图 A所示,随着茶树菇多糖浓度增加,红色荧光明显减弱.经定量统计分析发现,茶树菇多糖显著降低了HC T 细胞线粒体膜电位,尤其是 和 gm L茶树菇多糖组线粒体膜电位分别为正常组的倍和倍左右(图 B).综上分析,茶树菇多糖显著诱导了HC T 细胞线粒体膜电位丧失.(A)(B)1.00.50Average fluorescenceintensity(Mito-Tracker Red)H2O2300200NC400#400 gmL-1300 gmL-1200 gmL-1NCH2O2HochestMito-TrackerRedMergegmL-1(A)M i t o T r a c k e rR e d和H o e c h s t染色后的代表性图像;(B)线粒体膜电位定量分析.图茶树菇多糖诱导H C T 细胞线粒体膜电位丧失F i g A C Pi n d u c e dm i t o c h o n d r i a lm e m b r a n ep o t e n t i a l l o s s i nH C T c e l l s 茶树菇多糖诱导了H C T 细胞线粒体功能障碍线粒体是细胞内产能细胞器.线粒体氧化磷酸化是细胞获取能量的主要途径之一.R O S增加以及氧化磷酸 化抑制可 能导致 细 胞 能 量 供 应 不足.因此,本 研 究 采 用 海 马 能 量 分 析 仪 检 测O C R完成线粒体压力测试.O C R检测原理如图 A.结果如图 B H所示,gm L茶树菇多糖明显降低了HC T 细胞中AT P产生量、基础呼吸值、最大呼吸值、非线粒体呼吸能和线粒体备用呼吸能.上述结果表明,茶树菇多糖导致HC T 细胞线粒体的产能能力、能量储备等功能下降,即功能发生障碍.10080604020060402080OCR(pmol/min/10 k cells)10080604020060402080OCR(pmol/min/10 k cells)NCACPt/m i n(A)O C R原理图t/m i n(B)gm L茶树菇多糖处理HC T 细胞后O C R的变化第期汪紫薇等:茶树菇多糖通过R O S 线粒体功能障碍通路诱导结直肠癌细胞凋亡Basal respiration comparedwith control150100500NCACP*Non-mitochondrial oxygen consumptioncompared with control150100500NCACP*(C)非线粒体呼吸能定量分析(D)基础呼吸值定量分析Spare respiratory capacitycompared with control150100500NCACP*Maximal respiration comparedwith control150100500NCACP*(E)线粒体备用呼吸能定量分析(F)最大呼吸值定量分析ATP Proton compared with control150100500NCACP*Proton leak compared with control150100500NCACPns(G)质子漏定量分析(H)A T P产生量定量分析图茶树菇多糖诱导了H C T 细胞线粒体功能障碍F i g M i t o c h o n d r i a l d y s f u n c t i o ni nH C T c e l l sw a s i n d u c e db yA C P茶树菇多糖通过R O S 线粒体功能障碍通路诱导H C T 细胞凋亡线粒体功能障碍会导致促凋亡因子(细胞色素c等)释放从而引起凋亡的发生,.因此,本研究采用AO E B染色法检测细胞凋亡的发生.如图 A所示,随着茶树菇多糖浓度的增加,HC T 细胞的形态发生明显皱缩并且橙色荧光明显增强.统计分析(图 B)结果表明,茶树菇多糖诱导了HC T 细胞凋亡.为了进一步验证茶树菇多糖诱导的R O S在HC T 细胞凋亡中的作用,使用NA C预处理来抑制R O S的产生.结果如图 A和B所示,gm L茶树菇多糖组中细胞凋亡比例为,经NA C预处理的 gm L茶树菇多糖组中的细胞凋亡比例为,两组之间的差异具有统计学意义.以上结果表明,茶树菇多糖通过促进R O S过量积累导致线粒体功能障碍,进而诱导HC T 细胞凋亡.南昌大学学报(理科版)年Apoptic cell/%200NACNCNAC+200#3020100400300NAC+300NAC+400*gmL-1NC300 gmL-1200 gmL-1400 gmL-1NACNAC+300 gmL-1NAC+200 gmL-1NAC+400 gmL-1(A)AO E B染色检测细胞凋亡(B)AO E B染色定量图茶树菇多糖通过R O S 线粒体功能障碍通路诱导H C T 细胞凋亡F i g A C Pi n d u c e da p o p t o s i so fH C T c e l l s t h r o u g ht h eR O S m i t o c h o n d r i a l d y s f u n c t i o np a t h w a y结论由于结直肠癌的高发率和不断上升的死亡率,开发治疗结直肠癌的新药物迫在眉睫.相对于化疗药物的高毒副作用,高效、安全的天然活性物质逐渐进入研究者的视野.本研究发现天然来源的茶树菇多糖 具 有 显 著 抑 制 结 直 肠 癌 细 胞HC T 和C T 增殖的功能活性作用,并且抑制效果随多糖浓度和处理时间增加而增强.值得注意的是,茶树菇多糖对正常肠上皮细胞I E C 无毒害作用.此外,茶树菇多糖显著下调了HC T 细胞氧化磷酸化通路以及诱导了R O S的生成.R O S过量积累导致线粒体膜电位丧失以及线粒体功能障碍,从而诱导HC T 细胞凋亡,并最终抑制其增殖.重要的是,抗氧化剂NA C通过清除R O S验证了茶树菇多糖通过R O S 线粒体功能障碍通路诱导HC T 细胞凋亡这一结果.本研究为进一步开发和应用茶树菇多糖提供了理论基础.参考文献:D E KK E R E,TAN I SPJ,V L E UG E L SJL A,e ta l C o l o r e c t a l c a n c e rJ T h eL a n c e t,():苏文雨,房静远 年结直肠癌的研究新进展J中华医学信息导报,:M I L L E R K D,NOGU E I R A L,MA R I O T T O AB,e ta l C a n c e r t r e a t m e n t a n ds u r v i v o r s h i ps t a t i s t i c sJC A:AC a n c e rJ o u r n a l f o rC l i n i c i a n s,():KA S P E RSH,MO R E L L P E R E ZC,WY CHETP,e ta l C o l o r e c t a lc a n c e r a s s o c i a t e da n a e r o b i cb a c t e r i ap r o l i f e r a t e i nt u m o r s p h e r o i d sa n da l t e r t h em i c r o e n v i r o n m e n tJS c i e n t i f i cR e p o r t s,():D E N GS,Z HAN G G,KUA IJ,e ta l L e n t i n a ni n h i b i t st u m o ra n g i o g e n e s i sv i ai n t e r f e r o ng a mm aa n di naTc e l l i n d e p e n d e n tm a n n e rJ J o u r n a lo fE x p e r i m e n t a l&C l i n i c a lC a n c e rR e s e a r c h,():Q IW,Z HOU X,WAN GJ,e ta l C o r d y c e p ss i n e n s i sp o l y s a c c h a r i d e i n h i b i t s c o l o nc a n c e r c e l l sg r o w t hb y i n d u c i n g a p o p t o s i s a n d a u t o p h a g y f l u x b l o c k a g e v i amT ORs i g n a l i n gJ C a r b o h y d r a t eP o l y m e r s,:王贺祥食用菌学M北京:中国农业大学出版社,张松食用菌学M广州:华南理工大学出版社,王恒生,陈克龙,李怡,等茶树菇的经济价值及开发应用J中国园艺文摘,:YANG N,T ON G X,X I ANG Y,e ta l C r y s t a l l i z a t i o na n dp r e l i m i n a r yc r y s t a l l o g r a p h i cs t u d i