第七单元-重组DNA技术的基本工具(教师版)高二生物单元复习知识清单.docx

第三章 基因工程
第1节 重组DNA技术的基本工具
一、基因工程及其诞生与发展
1．基因工程的概念:基因工程是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物制品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫重组DNA技术。（P67）
（1）原理：重组DNA技术。
（2）操作对象：基因。
（3）操作场所：生物体外。
（4）操作水平：分子水平。
（5）操作结果：赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。
2.为什么不同生物的DNA分子能拼接起来？
（1）DNA的基本组成单位都是四种脱氧核苷酸。
（2）双链DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构。
3.为什么一种生物的基因可在另一种生物细胞内表达出相应性状？
（1）基因是控制生物性状的独立遗传单位。
（2）传信息的传递都遵循中心法则。
（3）生物界共同一套遗传密码。
2．基因工程的诞生和发展
(1)基因工程的诞生
①1944年，艾弗里等人通过肺炎链球菌转化实验证明了遗传物质是DNA，还证明了DNA可以在同种生物的不同个体之间转移。（P68）
②1953年，沃森和克里克建立了DNA双螺旋结构模型并提出了遗传物质自我复制的假说。（P68）
③1961年，尼伦伯格和马太破译了第一个编码氨基酸的密码子。（P68）
④20世纪70年代初，多种限制酶、DNA连接酶和逆转录酶被相继发现，为DNA的切割、连接以及功能基因的获得创造了条件。（P68）
⑤1973年，科学家证明质粒可以作为基因工程的载体，构建重组DNA，使外源基因在原核细胞中成功表达，并实现物种间的基因交流。（P69）
(2)基因工程的发展
①1982年，第一个基因工程药物——重组人胰岛素被批准上市。（P69）
②1984年，我国科学家朱作言领导的团队培育出世界上第一条转基因鱼。（P69）
③1985年，穆里斯等人发明PCR，为获取目的基因提供了有效手段。（P69）
④1990年，人类基因组计划启动。2003年，该计划的测序任务顺利完成。（P69）
⑤21世纪以来，科学家发明了多种高通量测序技术，可以实现低成本测定大量核酸序列，加速了人们对基因序列的了解。（P69）
⑥2013年，华人科学家张锋及其团队首次报道利用最新的基因组编辑技术编辑了哺乳动物基因组。（P69）
二、DNA重组技术的基本工具
1．限制性内切核酸酶(又称限制酶)—“分子手术刀”（P71）
（1）来源：主要来自原核生物。（P71）
（2）功能：能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开（确切来说应该是催化磷酸二酯键断开；功能中两个“特定”体现了酶的专一性。）。（P71）
（3）限制酶识别序列：大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成，也有少数限制酶的识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。（P71）
（4）结果：产生黏性末端或平末端。（P71）
（5）说出产生下列末端的条件：（P71）
①黏性末端：限制酶在它识别序列的中轴线两侧将DNA分子的两条链分别切开。
②平末端：限制酶在它识别序列的中轴线处切开。
（6）限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么？（P71思考）
切割外源DNA、使之失效，以保证自身安全。
（7）限制酶为什么不会切割自身的DNA？
原核生物中不存在该酶的识别序列或识别序列已被修饰。
（8）应用：已知限制酶EcoR Ⅰ和Sma Ⅰ识别的碱基序列和酶切位点分别为G↓AATTC和CCC↓GGG，在图中写出两种限制酶切割DNA后产生的末端并写出末端的种类。

EcoR Ⅰ限制酶和Sma Ⅰ限制酶识别的碱基序列不同，切割位点不同(填“相同”或“不同”)，说明限制酶具有专一性。
（9）不同的限制酶切割可能产生相同的黏性末端，这在基因工程操作中有什么意义？使构建载体时，切割位点的选择范围扩大。
资料卡——限制酶名字的由来（P72）
用生物属名的头一个字母与种加词的头两个字母，组成了3个字母的略语，以此来表示这个酶是从哪种生物中分离出来的。
例如一种限制酶是从大肠杆菌（Escherichia coli）的R型菌株分离来的，就用字母EcoR表示；如果它是从大肠杆菌R型菌株中分离出来的第一种限制酶，则进一步表示成EcoRⅠ。
2．DNA连接酶—“分子缝合针”
(1)DNA连接酶的功能：将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。（P72）
(2)种类[填表]
种类
比较
E.coli DNA连接酶
T4 DNA连接酶
来源
大肠杆菌
T4噬菌体
特点
只能连接黏性末端
既可以连接黏性末端，又可以连接平末端
（3）T4 DNA连接酶连接黏性末端和平末端的效率一样吗？（P72）
不一样，连接平末端的效率相对较低。
（4）两种DNA连接酶的相同点：都可以连接黏性末端，恢复的都是磷酸二酯键。
（5）比较DNA连接酶与DNA聚合酶
种类
比较
DNA连接酶
DNA聚合酶
作用实质
催化两个DNA片段之间形成磷酸二酯键。
催化单个核苷酸加到已有核苷酸片段的3’末端的羟基上，形成磷酸二酯键。
作用结果
催化具有互补黏性末端或平末端的DNA片段连接起来，形成重组DNA分子。
催化形成与模板链互补的DNA链，形成新的双链DNA分子。
模板
不需要模板
需要模板

3.基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”（P72）
（1）载体的作用：将外源基因送入受体细胞。（P72）
（2）最常用的载体类型：质粒。除此之外，还有噬菌体、动植物病毒。（P73）
①质粒的本质：是一种裸露的、结构简单，独立于真核细胞（如酵母菌）的细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。（P72）
②质粒适于作基因运载体的特点：（P72）
Ⅰ.质粒分子上有一个至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段插入其中。
Ⅱ.携带外源DNA片段的质粒进入受体细胞后，能在细胞中进行自我复制，或整合到受体DNA上，随受体细胞DNA同步复制。
Ⅲ.在基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是天然质粒的基础上进行过人工改造的，这些质粒上常有特殊的标记基因，如四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因等，便于重组DNA分子的筛选。
（3）作为载体需要具备的条件：
①有一个至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段（基因）插入其中。
②能在细胞中进行自我复制或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制。
③常有特殊的标记基因，便于重组DNA分子的筛选。
④对受体细胞无害。
三、重组DNA分子的模拟操作（P73）
1．材料用具：剪刀代表EcoR_Ⅰ，透明胶条代表DNA连接酶。
2．切割位点
(1)分别从两块硬纸板上的一条DNA链上找出G—A—A—T—T—C序列，并选G—A之间作切口进行“切割”。
(2)再从另一条链上互补的碱基之间寻找EcoR Ⅰ相应的切口剪开。
3．操作结果：若操作正确，不同颜色的黏性末端应能互补配对；否则，说明操作有误。
四、DNA的粗提取与鉴定
1.DNA的提取思路：利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在的差异，选用适当的物理或化学方法对它们进行提取。（P74）
2.DNA的提取原理：
（1）DNA不溶于酒精，蛋白质溶于酒精，利用这一原理，可以初步分离DNA与蛋白质。（P74）
（2）DNA在不同浓度的NaCl溶液中的溶解度不同，它能溶于2_mol/L的NaCl溶液。（P74）
3.DNA的鉴定原理：在一定温度下（沸水浴），DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色，因此二苯胺试剂可以作为鉴定DNA的试剂。（P74）
4.选材应选择DNA含量相对较高的生物组织。
5.选材不能选择哺乳动物成熟的红细胞。
原因：哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核和线粒体，几乎不含DNA。
6．实验步骤
（1）称取30 g洋葱，切碎，加入10 mL研磨液，充分研磨。（P74）
研磨时应加研磨液。
研磨的目的：破碎细胞，使核物质容易溶解在研磨液中。
研磨注意事项：研磨时间不易太长、注意充分研磨、研磨不宜太用力。
研磨植物组织可加入果胶酶、纤维素酶帮助研磨。
（2）漏斗中垫纱布，将研磨液过滤到烧杯中，在4℃冰箱中放置几分钟后，再取上清液。也可直接将研磨液倒入塑料离心管中，1500r/min的转速下离心5min，再取上清液放入烧杯中。（P74）
①上清液中除DNA之外，可能含有哪些杂质？可能含有核蛋白、多糖等杂质。
②低温放置几分钟(酒精预冷）的作用
可抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA降解；
抑制DNA分子运动，使DNA易形成沉淀析出；
低温有利于增加DNA的柔韧性，减少其断裂。
（3）在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液(体积分数为95%)，静置2～3 min，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿同一方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分。或将溶液倒入塑料离心管中，在10000r/min的转速下离心 5min，弃上清液，将管底的沉淀物(粗提取的DNA)晾干。（P74）
①搅拌时应轻缓并沿一个方向搅拌的原因：减少DNA断裂，以便获得较完整的DNA分子。
②研磨后留上清液，离心速度较低；加酒精后留沉淀，离心速度较高。
（4）取两支20 ml的试管编号A、B，各加入2 mol/L的NaCl溶液5 mL，将丝状物溶于B试管的NaCl溶液中。然后向两支试管中各加入4 mL的二苯胺试剂。混匀后，将试管置于沸水中加热5 min。（P74）
（5）结果观察：A试管不变蓝，B试管变蓝色。
（6）溶液蓝色的深浅与溶液中DNA的含量的多少有关。
（7）二苯胺试剂能测定提取液中DNA的纯度差别吗？不能。
7.思考：如果选用鸡血细胞进行实验，如何快速破碎细胞？
将鸡血细胞置于蒸馏水中，待细胞涨破后，收集滤液。
8.思考：有时会在DNA滤液中添加嫩肉粉（木瓜蛋白酶），这样有什么好处？
利用蛋白酶分解杂质蛋白，不分解DNA，有利于DNA与蛋白质分开。
9.思考：有时还会反复利用不同浓度的NaCl溶液来溶解、析出DNA，试猜想该操作的目的？（P75）进一步纯化DNA——用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高盐溶液中不能溶解的杂质；用低盐溶液使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质。
10.思考：如何描述该变化曲线？

在NaCl溶液浓度低于0.14 mol/L时，DNA的溶解度随NaCl溶液浓度的增加而逐渐降低；在0.14 mol/L时，DNA溶解度最小；当NaCl溶液浓度高于0.14 mol/L时，DNA的溶解度随NaCl溶液浓度的增加而逐渐升高。
11.思考：若DNA在2mol/L的NaCl溶液中溶解度最高，如何通过控制NaCl溶液的浓度使DNA在盐溶液中溶解或析出？先用2mol/L 的NaCl溶液溶解DNA，再加入蒸馏水，使其溶液浓度从2mol/L下降到0.14 mol/L，使DNA在盐溶液中析出。