SN∕T 5191-2020 禽肾炎检疫技术规范(出入境检验检疫).pdf

以正式出版文本为准中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 51912020禽肾炎检疫技术规范Quarantine protocol for avian nephritis中华人民共和国海关总署发 布ICS 11.220CCS B 412020-12-30 发布2021-07-01 实施以正式出版文本为准以正式出版文本为准ISN/T 51912020前 言本文件按照 GB/T1.12020 的规定起草。本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位：中华人民共和国天津海关、锦州医科大学、中华人民共和国青海岛海关。本文件主要起草人：王乃福、赵微、刘洋、胡炜、陈小金、黄晨、陈本龙、董志珍、赵祥平。以正式出版文本为准以正式出版文本为准1SN/T 51912020禽肾炎检疫技术规范1范围本文件规定了禽肾炎的病毒分离及鉴定、反转录 - 聚合酶链式反应、实时荧光反转录 - 聚合酶链式反应和间接酶联免疫吸附试验的技术要求。本文件适用于禽肾炎的检疫。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析试验室用水规格和实验方法GB 19489 实验室生物安全通用要求3术语、定义和缩略语本文件没有需要界定的术语和定义。下列缩略语适用于本文件。AN ：禽肾炎（avian nephritis） ；ANV ：禽肾炎病毒（avian nephritis virus） 。4临床诊断4.1禽肾炎简介禽肾炎简介参见附录 A。4.2临床症状本病可明显抑制 1 月龄以内雏鸡生长发育和增重，其他症状不明显。一般呈一过性隐性感染，本病经人工接种无特殊病原微生物雏鸡后，血浆中尿酸盐浓度高于正常浓度的 210 倍，21 d 后恢复正常。4.3病理变化本病的病理变化主要表现于肾脏，其他脏器一般没有变化。随年龄增大，病变程度减轻，4 日龄内的雏鸡病变最为严重，甚至会出现死亡情况。剖检死亡的雏鸡，见到肾脏、脾脏和腹膜表面及腿部筋腱周围大量的尿酸盐沉积，2 月龄仅发生较轻肾炎病变。根据流行病学、临床症状和病理变化可做出禽肾炎的初步诊断，进一步的确诊有赖于实验室诊断。5实验室诊断5.1生物安全措施以正式出版文本为准2SN/T 51912020试验环境和防护要求见 GB 19489。5.2病原分离及鉴定5.2.1材料和试剂5.2.1.1器材生物安全柜、离心机、二氧化碳培养箱、冷冻高速离心机、研磨器、倒置显微镜等。5.2.1.2水符合 GB/T 6682 中一级水要求。5.2.1.3试剂胰酶消化液、细胞生长液、细胞维持液、双抗液，具体配制见附录 B.1B.4。5.2.1.4细胞鸡肾细胞（CKC） 。5.2.2病毒分离培养5.2.2.1样品采集和制备5.2.2.1.1未出现临床症状时，活禽无菌采集病鸡泄殖腔拭子（需带有可见粪便） ，雏禽采集新鲜粪便；在动物死亡后，无菌采取肾脏和直肠内容物作病料。5.2.2.1.2样品置于含抗生素的 pH7.0 等渗磷酸盐缓冲液（PBS）中。5.2.2.1.3粪便和搅碎的组织，用含抗生素的PBS制成10%20% （质量浓度） 的悬浮液，拭子浸入3 mL 含抗生素的 PBS 中，充分振荡。在 4 作用 4 h 或过夜，或室温作用 2 h。拭子在反复挤压后弃去。5.2.2.1.44 3 000 r/min 离心 10 min，取上清液经 0.22 m 滤膜过滤除菌。5.2.2.2样品运送及保存条件立即进行实验室检测的样品，保存于 4 或置于冷藏盒中快速送达，不能立即检测的样品置于 -70 冷冻保存。5.2.2.3样品接种将制备好的样品接种于 24 孔细胞培养板培养的单层 CKC 细胞中，每份样本至少接种 4 孔，设正常细胞对照至少 4 孔，每孔 0.1 mL0.2 mL，37 吸附 1 h，倾去多余液体，加入 1 mL 维持液，放入37 的 5% 二氧化碳恒温培养箱中培养 3 d5 d。5.2.2.4结果观察样品接种 24 h 后，于倒置显微镜下逐日观察细胞状态并做好相应记录，若细胞对照孔正常，而接种样品孔出现细胞变圆、聚堆成簇或由于细胞脱落形成空斑等细胞病变现象时，冻融 3 次后转入新长满单层细胞的培养板，如果观察仍出现类似细胞病变，且日渐明显，则可收获细胞培养物，放入 -70 冰箱中待鉴定。如果对照细胞与接种样品细胞均无变化，再盲传两代。盲传过程中若出现细胞病变，按上述原则，收获细胞培养物，放入 -70 冰箱中；若未出现细胞病变，则为禽肾炎病毒分离结果阴性。5.2.2.5培养物鉴定以正式出版文本为准3SN/T 51912020由于禽类肠道病毒均可引起相同的 CPE，所以收获的培养物应进行鉴定。可使用反转录 - 聚合酶链式反应（RT-PCR） 、实时荧光 RT-PCR 和酶联免疫吸附试验（ELISA）等方法来鉴定是否为禽肾炎病毒感染。5.3反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）5.3.1仪器和设备5.3.1.1PCR 扩增仪。5.3.1.2电泳仪。5.3.1.3紫外凝胶成像仪。5.3.1.4高速台式冷冻离心机。5.3.1.5生物安全柜。5.3.1.6可调移液器：1 L10 L, 20 L100 L, 100 L1 000 L。5.3.2试剂和材料5.3.2.10.01 mol/L PBS 缓冲液：pH7.2。5.3.2.2裂解液 Trizol ：4 保存。5.3.2.3三氯甲烷。5.3.2.4异丙醇。5.3.2.5DEPC 水。5.3.2.6氯化镁：25 mmol/L。5.3.2.7dNTPS ：含 dCTP、dGTP、dATP、dTTP 各 10 mmol/L。5.3.2.85 逆转录酶缓冲液和 10Taq 酶缓冲液。5.3.2.9引物（Primer）:10 mol/L。根据 ORF1 b 基因序列设计，扩增产物长度为 450 bp。上游引物 PANV-F ： 5-TAGAATCACTCTTCTTCCAACTGGA-3下游引物 PANV-R ： 5-TCAAGGTCTGGCAGCCTGCGC-35.3.2.10Taq 酶：5 U/L。5.3.2.11逆转录酶 AMV ：10 U/L。5.3.2.1275% 乙醇。5.3.2.13阳性对照：接种 ANV 病毒的细胞培养物。5.3.2.14阴性对照：正常鸡肾细胞（CKC） 。5.3.3样品采集和制备见 5.2.2.1。5.3.4样品运送及保存条件见 5.2.2.2。5.3.5试验步骤5.3.5.1样品 RNA 提取5.3.5.1.1在样品处理区，取 150 L 粪便上清液样本置处理后 1.5 mL 灭菌离心管，做好标记，同时设立阳性样品对照、阴性样品对照，加入 3 倍体积 Trizol，振荡混合 20 s，静置 5 min。5.3.5.1.2加入 200 L 三氯甲烷，振荡混合 20 s，静置 5 min ；4 12 000 r/min 离心 15 min，取上清液置另一个标记好的 1.5 mL 灭菌离心管中，加入等体积的异丙醇，-20静置 15 min。以正式出版文本为准4SN/T 519120205.3.5.1.34 12 000 r/min 离心 15 min，轻轻弃去上清液，加入 1 mL DEPC 水配制的 75% 乙醇。5.3.5.1.44 12 000 r/min 离心 15 min，轻轻弃去乙醇，倒置滤纸上，干燥 10 min，加入 20 L DEPC水溶解 RNA，提取的 RNA 须在 2 h 内反转录，若需保存须放置 -70 冰箱。5.3.5.2逆转录合成 cDNA在 PCR 管中加入 10 L 反转录模板（样品 RNA） 、1 L 下游引物 PANV-R、4 ul 5 倍逆转录酶浓缩缓冲液、2 L dNTP、0.5 ul RNA 酶抑制剂（20 U/L） 、1 L 逆转录酶 AMV（10 U/L）和 1.5 L 水，总体积为 20 L。充分混匀，瞬时离心，使液体都沉降到 PCR 管底。置于 42 反转录 45 min，立即冰浴，用作 PCR 模板。5.3.5.3PCR 扩增 DNA5.3.5.3.150 L PCR 反应体系组成配制每个样品 PCR 反应液，见表 1。表 1每个样品 PCR 反应液配制表试剂用量 / uL10Taq 酶缓冲液5dNTPs（10 mmol/L）1氯化镁（25 mmol/L）4Taq 酶（5 U/L）1上游引物 PANV-F1下游引物 PANV-R1cDNA 模板 5DEPC 水32 总体积505.3.5.3.2PCR 循环参数将以上体系瞬时离心，充分混匀后，置 PCR 仪内。95 3 min，1 个循环；95 30 s ，55 30 s，68 30 s，30 个循环；68 7 min.，1 个循环；PCR 产物 4 保存。5.3.5.4PCR 产物检测制备 1% 琼脂糖凝胶板，取 5 L PCR 产物和 0.5 L 溴酚蓝混匀，加入凝胶板加样孔，同时加Marker、阴性对照和阳性对照。电压 90 V，电泳 1 h。紫外凝胶成像仪观察有无 450 bp 的 DNA 片段扩增产物条带。5. 3.5.5结果及判定5.3.5.5.1阳性对照出现 450 bp 目的条带，阴性对照和空白对照均未出现目的条带，试验成立。以正式出版文本为准5SN/T 519120205.3.5.5.2被检样品出现 450 bp 目的条带，则为禽肾炎病毒核酸疑似阳性结果，应用测序法予以验证。5.3.5.5.3被检样品未出现 450 bp 目的条带，则为阴性结果。5.4实时荧光 RT-PCR 反应5.4.1仪器与器材5.4.1.1实时荧光 PCR 仪。5.4.1.2高速台式冷冻离心机（离心速度 12 000 r/min） 。5.4.1.3台式离心机（离心速度 3 000 r/min） 。5.4.1.4混匀器。5.4.1.5透明薄壁 PCR 管（0.2 mL） 。5.4.1.6可调移液器：1 L10 L, 20 L100 L, 100 L1 000 L。5.4.1.7离心管（1.5 mL） 。5.4.2试剂和材料5.4.2.1三氯甲烷、异丙醇、75% 乙醇。5.4.2.2引物和探针：均为 10 mol/L。上游引物：5-GTAAACCACTGGYTGGCTGACT -3下游引物：5-TACTCGCCGTGGCCTCG -3探针：FAM-CAGCAACTGACTTTC-MGB。5.4.2.3阳性对照：接种 ANV 病毒的细胞培养物。5.4.2.4阴性对照：正常鸡肾细胞（CKC） 。5.4.3样品采集和制备见 5.2.2.1。5.4.4样品运送及保存条件见 5.2.2.2。5.4.5实时荧光 RT-PCR 检测步骤5.4.5.1样品 RNA 提取见 5.3.5.1。5.4.5.2逆转录合成 cDNA见 5.3.5.2。5.4.5.3实时荧光 PCR 反应体系配制每个样品实时荧光 PCR 反应液，见表 2。表 2每个样品荧光 PCR 反应液配置表试剂用量 / L10Taq 酶缓冲液2以正式出版文本为准6SN/T 51912020试剂用量 / LdNTPs（10 mmol/L）1氯化镁（25 mmol/L）1Taq 酶（5 U/L）1上游引物2下游引物2探针1cDNA 模板 1DEPC 水9 总体积20将以上体系瞬时离心 , 充分混匀后，置实时荧光 PCR 仪内，反应程序如下：95 10 min，1 个循环；95 15 s，60 45 s，72 30 s，40 个循环。 5.4.6结果判定5.4.6.1结果分析条件设定读取检测结果。阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，不同仪器可根据仪器噪音情况进行调整。5.4.6.2质控标准阴性对照无 Ct 值并且无扩增曲线。阳性对照的 Ct 值应小于等于 30，并出现特定的扩增曲线。如阴性对照和阳性对照不同时满足以上条件，此次实验视为无效。5.4.6.3结果描述及判定阴性：若检测样品无 Ct 值并且无扩增曲线，表明样品中无禽肾炎病毒核酸。阳性：检测样品 Ct 值小于等于 30，且出现典型的扩增曲线，表明样品中存在禽肾炎病毒核酸。有效原则：若检测样品比值大于 30，小于等于 40，或虽然 Ct 值小于等于 30 但扩增曲线不显著，则应重新对样品进行检测；若重做后，Ct 值小于等于 40，则判定为禽肾炎病毒核酸阳性，Ct 值大于40 则判定为禽肾炎病毒核酸阴性。5.5间接 ELISA 检测方法5.5.1仪器与器材5.5.1.1酶标仪：具有 450 nm 波长滤光片。5.5.1.296 孔酶标板。5.5.1.3可调移液器：1 L10 L, 20 L100 L, 100 L1 000 L。5.5.1.4洗板机。5.5.1.537 恒温培养箱。5.5.1.6振荡器。表 2（续）以正式出版文本为准7SN/T 519120205.5.2试剂和材料所有化学试剂均为分析纯。5.5.2.1ANV 病毒纯化抗原（由指定单位提供）或者包被好的 ELISA 板。5.5.2.2禽肾炎标准阳性血清与禽肾炎病毒标准阴性血清：由指定单位提供。5.5.2.3被检血清：无菌操作采集动物血样，待自然凝固后无菌分离血清待检。5.5.2.4辣根过氧化物酶标记的羊抗鸡 IgG，按指定工作浓度使用。5.5.2.5各种溶液配制见附录 B.5B.13。5.5.3操作步骤5.5.3.1包被酶标板：按照提供的包被抗原所要求的稀释倍数，用包被液稀释后包被 96 孔酶标板，每孔 100 L，置 4 冰箱中过夜；或使用已经包被好的 96 孔酶标板。5.5.3.2洗涤：取出酶标板，甩掉孔中液体，用移液器于每孔加 300 L 洗涤液，静置 3 min，甩去孔中液体，重复 2 次，最后于滤纸上拍干。5.5.3.3封闭：每孔加满封闭液，置 37 温箱封闭 1 h。5.5.3.4洗涤：见 5.5.3.2。5.5.3.5加样：将标准阳性血清、标准阴性血清及待检血清分别用稀释液作 110 稀释；阳性血清、标准阴性血清及待检血清样品均应做重复样品，分别加入对应孔，每孔 100 L ；加样完毕后，轻轻振荡使其均匀分布，将板放入 37 恒温箱 1 h。5.5.3.6洗涤：见 5.5.3.2。5.5.3.7加酶标二抗：将预先稀释至工作浓度的酶标羊抗鸡 IgG 分别加入各孔，每孔 100 L。放入37恒温箱中作用 1 h。5.5.3.8洗涤：具体方法同 5.5.3.2。5.5.3.9加底物：底物溶液需现用现配，每孔加入 100 L，置室温避光作用 15 min。5.5.3.10加终止液：每孔加入 100 L 终止液，在 30 min 内测定 OD450 nm值5.5.4结果判定5.5.4.1判定条件只有当阳性血清平均 OD 值大于 0.40 ；阳性对照血清 OD 值与阴性对照血清 OD 值的比大于等于3.15 时，方可进行结果判定。5.5.4.2计算 P/N 值P/N 值计算见式（1） 。 P = 待测血清平均 OD 值 - 空白对照平均 OD 值 N 阴性血清平均 OD 值 - 空白对照平均 OD 值 （1）5.5.4.3判定标准P/N 值大于等于 2.8 时，判为待检血清禽肾炎抗体阳性。P/N 值大于等于 1.95，小于 2.8 时，判为可疑。对可疑样品应重检一次，重检后 P/N 仍大于 1.95，判为待检血清禽肾炎抗体阳性；若 P/N 值小于 1.95，判为待检血清禽肾炎抗体阴性。P/N 值小于 1.95 时，判为待检血清禽肾炎抗体阴性。以正式出版文本为准8SN/T 51912020附录A( 资料性 )禽肾炎病毒简介A.1禽肾炎病毒的发现禽病毒性肾炎是由禽肾炎病毒（avian nephritis virus, ANV）引起的，导致肾脏病变的一种传染病。1979 年，日本学者从鸡粪中分离出一种很小的 RNA 病毒。以这种病毒接种健康鸡，可导致肾炎，即传染性肾炎。此后，世界各地都从鸡血清中检测到了该病毒的抗体，并将其命名为禽肾炎病毒。A.2禽肾炎病毒传播途径及危害与相关的肠道病毒类似，ANV 也有可能蛋传感染。1 日龄雏鸡感染 ANV 情况相较于大日龄鸡更严重，症状却不明显。生长停滞可能是其唯一的症状。带有高母源抗体的母鸡，其后代可获得保护而不感染发病。受 ANV 感染的粪便被鸡食入后，病毒即扩散至全身，并且主要损害肾脏和肠道。尽管试验研究表明，1 日龄小鸡接种 ANV 可引起高死亡率，但野外感染的小鸡因免疫系统能抵抗病毒而通常可存活。肾脏及肠道的损害可导致鸡矮小或生长停滞。死后剖检最常见的是肾苍白，偶尔可见肾周围有尿酸盐沉积。ANV 病毒感染的范围广，可造成鸡群的亚临床症状到死亡，健康鸡群可携带大量的病毒粒子，并为隐性带毒群体，存在极大的隐患。ANV 的感染在多个国家都有报道。日本鸡群中存在大量的ANV 感染，造成鸡群的肾炎症状。Mandoki 等人报道匈牙利鸡群中 ANV 感染率为 69%，造成幼鸡腹泻、生长发育迟缓，其感染具有多样性。而美国学者在患有腹泻和健康的鸡群中均分离到 ANV 病毒，感染率平均在 56%，而火鸡群中也能分离到 ANV 病毒，感染率达 23%。A.3禽肾炎病毒预防禽肾炎目前没有特异的治疗方法，也没有有效的疫苗可提供免疫预防，主要依靠把好引进种蛋关。 另一方面，由于直接或间接的接触，容易造成本病的传播，所以应严格饲养管理，减少人员往来，减少水平传播的机会。以正式出版文本为准9SN/T 51912020附录B（规范性）试剂配制B.1EDTA- 胰酶分散液（10 倍贮存液）胰酶 2.5 g氯化钠（NaCl） 40.0 g氯化钾（KCl） 2.0 g葡萄糖 5.0 g碳酸氢钠（NAHCO3） 2.9 gEDTA 1.0 g上述成分依次先溶于 450 mL 三馏水中，务必使液体完全清亮，再定容至 500 mL，用 0.22 m 滤膜或 G6 玻璃滤器滤过除菌，分装后保存于 -20。使用时用三馏水 10 倍稀释，适量分装。B.2细胞生长液含双抗溶液（终浓度 100 IU/mL 青霉素和 100 g/mL 链霉素） 、10% 小牛血清、0.03% 谷氨酰胺 MEN，用 7.5% 碳酸氢钠溶液调节 pH 值至 7.07.2。B.3细胞维持液含 1% 双抗溶液（终浓度 100 IU/mL 青霉素和 100 g/mL 链霉素） 、2% 小牛血清、0.03% 谷氨酰胺 MEN，用 7.5% 碳酸氢钠溶液调节 pH 值至 7.07.2。B.4双抗液100 万单位青霉素 G 和 100 万微克链霉素溶解 100 mL 三蒸水中，使每毫升含有 1 万单位青霉素G 和 1 万微克链霉素。B.50.01 mol/L pH7.4 PBS磷酸氢二钠（Na2HPO412H2O） 2.90 g磷酸二氢钾（KH2PO4） 0.20 g氯化钠 8.0 g氯化钾 0.20 g加蒸馏水至 1000 mL，分装，121高压灭菌 20 min，4 保存。B.6磷酸甘油封片溶液甘油（分析纯） 9 mL0.01 mol/L pH7.4 PBS 1 mL以正式出版文本为准10SN/T 51912020B.7包被液（0.05 mol/L，pH9.6 的碳酸盐缓冲液）碳酸氢钠 1.46 g无水碳酸钠（Na2CO3） 0.97 g( 或 Na2CO310H2O 1.2 g)去离子水或蒸馏水 500 mLB.8洗涤液（0.01 mol/L，pH7.4 的 PBST）氯化钠 8.0 g磷酸二氢钾 0.2 g磷酸氢二钠 2.9 g氯化钾 0.2 g吐温 -20 0.5 mL去离子水或蒸馏水 1 000 mL121高压灭菌 30 min 后，可保存 1 月。B.9稀释液0.01 mol/L，pH7.4 的 PBS 中加入牛血清白蛋白（BSA） ，使其浓度终含量为 0.1%。氯化钠 8.0 g 磷酸二氢钾 0.2 g磷酸氢二钠 2.9 g氯化钠 8.0 g牛血清白蛋白 1.0 g去离子水或蒸馏水 1000 mL保存于 2 8 不超过 1 周，最好随配随用。B.10封闭液牛血清白蛋白 2.0 g明胶 0.6 gPBST 200 mL先用适量 PBST 将明胶加热融化，待冷却至 50 以下时，加入称好的牛血清白蛋白，并定容至200 mL，保存于 2 8 。B.11pH 5.0 磷酸盐 - 柠檬酸盐缓冲液B.11.10.1 mol/L 柠檬酸：柠檬酸 21.0 g 溶于 1000 mL 蒸馏水中。B.11.20.2 mol/L 磷酸氢二钠（Na2HPO4） ：磷酸氢二钠 271.6 g 溶于 1 000 mL 水中。B.11.3取 B.11.1 液 24.30 mL B.11.2 液 25.70 mL 即为 pH 5.0 磷酸盐 - 柠檬酸盐缓冲液。B.12底物溶液：3，3，4，4- 四甲基联苯胺（TMB）-H2OB.11 缓冲液 9.9 mL1%TMB 0.1 mL以正式出版文本为准11SN/T 5191202030%H2O2 1.0 L临用时新鲜配制，配后立即使用。B.13终止液（2 mol/L 硫酸）浓硫酸（分析纯） 22.2 mL蒸馏水 177.8 mL以正式出版文本为准中华人民共和国出入境检验检疫开本 8801230 1/16 印张 1 字数 27 千字2020 年月第一版 2020 年月第一次印刷印数 1500书号：155175125 定价 18.00 元禽肾炎检疫技术规范行 业 标 准SN/T 51912020*SN/T 51912020北京市朝阳区东四环南路甲 1 号（100023）编辑部：[phone]-7509中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷中国海关出版社有限公司出版发行网址