WS∕T 639-2018（代替 WS∕T 125-1999, WS∕T 248-2005） 抗菌药物敏感性试验的技术要求.pdf

ICS 11.020 C 50 WS 中 华 人 民 共 和 国 卫 生 行 业 标 准 WS/T 6392018 代替 WS/T 125-1999，WS/T 2482005 抗菌药物敏感性试验的技术要求 Technical specification on antimicrobial susceptibility tests 2018 - 12 - 11 发布 2019 - 06 - 01 实施 中华人民共和国国家卫生健康委员会 发 布 WS/T 6392018 I 目 次 前言 . II 1 范围 . 1 2 术语和定义 . 1 3 常规药敏试验的药物选择和报告 . 4 4 药敏试验方法 . 6 5 各种属细菌药敏试验 . 11 6 质量控制 . 16 7 商品化药敏试验检测系统的性能验证 . 17 附录 A 临床各种属细菌的药敏试验方法和试验条件 . 21 附录 B 不常见苛养菌和非苛养菌药敏试验折点 . 25 参考文献 . 30 WS/T 6392018 II 前 言 本标准按照 GB/T 1.12009 给出的规则起草。 本标准代替 WS/T 125-1999纸片法抗菌药物敏感试验标准和 WS/T 248-2005厌氧菌的抗微生物药敏感试验方法 。本标准整合了 WS/T 125-1999 和 WS/T 248-2005 的内容，并做了以下变化： 增加了常规药敏试验报告原则和报告格式； 增加了稀释法、梯度扩散法和自动化仪器法等其他药敏试验检测方法； 增加了少见菌药敏判定标准和商品化药敏试验检测系统的性能验证； 修改了常见菌特殊耐药表型检测和质量控制要求。 本标准起草单位： 北京大学人民医院、 安徽省立医院、 首都医科大学附属北京友谊医院、 北京医院。 本标准主要起草人：王辉、张正、马筱玲、胡云建、苏建荣、王晓娟、陈宏斌、李荷楠。 本标准实施之日起，WS/T 125-1999 和 WS/T 248-2005 废止。 WS/T 6392018 1 抗菌药物敏感性试验的技术要求 1 范围 本标准规定了临床抗菌药物敏感性试验的技术要求， 包括常规药敏试验的药物选择和报告、 药敏试验方法、各种属细菌药敏试验、常见菌特殊耐药表型检测、药敏试验的质量控制、商品化药敏试验检测系统的性能验证。 本标准适用于开展临床微生物学检验的各级临床实验室。 2 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 2.1 抗微生物药物敏感性试验 Antimicrobial susceptibility testing 检测微生物（本文件特指细菌）对抗微生物药物（本文件特指抗菌药物）的体外敏感性，以指导临床合理选用药物的微生物学试验，简称药敏试验。 2.2 最低抑菌浓度 Minimal inhibitory concentration；MIC 在琼脂或肉汤稀释法药物敏感性检测试验中能抑制肉眼可见的微生物生长的最低抗菌药物浓度。 2.3 折点 Breakpoint 能预测临床治疗效果， 用以判断敏感、 中介、 剂量依赖型敏感、 耐药、 非敏感的最低抑菌浓度 （MIC）或者抑菌圈直径（mm）的数值。 2.3.1 敏感 Susceptible；S 当抗菌药物对分离株的MIC值或抑菌圈直径处于敏感范围时，使用推荐剂量进行治疗，该药在感染部位通常达到的浓度可抑制被测菌的生长，临床治疗可能有效。 2.3.2 中介 Intermediate；I 当菌株的MIC值或抑菌圈直径处于中介时，该数值接近药物在血液和组织中达到的浓度，从而治疗反应率低于敏感菌群。 该分类意味着采用高于常规剂量治疗时或在药物生理浓集的部位， 临床治疗可能WS/T 6392018 2 有效。该分类同样可作为“缓冲域”，以防止由微小、不可控的技术因素导致的重大偏差，尤其是毒性范围较窄的药物。 2.3.3 剂量依赖型敏感 Susceptible-dose dependent；SDD 细菌菌株对抗菌药物的敏感性依赖于抗菌药物的剂量。 当某种药物对菌株的MIC或抑菌圈直径在SDD范围时，临床可通过提高剂量和（或）增加给药频率等修正给药方案以达到临床疗效。 2.3.4 耐药 Resistant；R 当抗菌药物对分离株的MIC值或抑菌圈直径处于该分类范围时，使用常规治疗方案，该药在感染部位所达到的药物浓度不能抑制细菌的生长，和（或）被测菌株获得特殊耐药机制，且治疗性研究显示该药临床疗效不确切。 2.3.5 非敏感 Nonsusceptible；NS 对于那些因未现或罕现耐药， 而仅具有敏感折点的抗菌药物， 当该药对某分离株的MIC值高于或抑菌圈直径低于敏感折点时，此分类为非敏感。 2.4 流行病学界值 Epidemiological cutoff value；ECV 将微生物群体区分为有或无获得性耐药的MIC值或抑菌圈直径，是群体敏感性的上限。根据ECV，可将菌株分为野生型和非野生型。 2.4.1 野生型 Wild-type；WT 根据ECV值，将抗菌药物（包括抗真菌药物）评估中未获得耐药机制或无敏感性下降的菌株定义为野生型。 2.4.2 非野生型 Non-wild-type；NWT 根据ECV值，将抗菌药物（包括抗真菌药物）评估中获得了耐药机制或存在敏感性下降的菌株，定义为非野生型。 2.5 效价 Potency 抗菌药物中具有抗菌活性的成分，通过同类标准物质测定得出。单位mg/g、IU/g或用百分比表示。 WS/T 6392018 3 2.6 基本一致性 Essential agreement；EA 待测MIC系统与参考方法MIC值相差不超过1个稀释倍数。 当待评估方法为纸片扩散法时， 不计算EA。 2.7 分类一致性 Categorical agreement；CA 被评估药敏方法与参考方法判断试验结果为敏感、中介、耐药的一致性。 2.8 极重大误差 Very major error；VME 将耐药误判为敏感，即假敏感。 2.9 重大误差 Major error，ME 将敏感误判为耐药，即假耐药。 2.10 小误差 Minor error 将中介判为敏感或耐药、或者将耐药或敏感判为中介。 2.11 常规药敏试验 Routine test 用于临床常规检测的纸片扩散法、肉汤或琼脂稀释法。 2.12 补充（非常规）药敏试验 Supplemental (not routing) test 通过常规纸片扩散法、 肉汤或琼脂稀释法以外的方法检测某种或某类药物的敏感性或耐药性， 且该方法无需额外试验确证药物的敏感性或耐药性。 2.13 筛选试验 Screening test 提供假定结果的试验。当筛查结果阳性时，需进行附加试验进行确认。 2.14 替代药物试验 Surrogate agent test 当目标抗菌药物的药敏无法检测或替代药物的药敏检测性能优于目标药物时， 该药物可替代目标药物进行药敏试验。 WS/T 6392018 4 2.15 等效药物试验 Equivalent agent test 某药可预测与其密切相关的同类药物的药敏结果， 测定该药的药敏试验可减少其他相关药物的检测数量以提高检测效率。 3 常规药敏试验的药物选择和报告 3.1 药敏试验测试药物的分组 A组：对特定的菌种，常规测试并报告的基本抗菌药物。 B组：常规测试，但只选择性报告的基本抗菌药物，例如当对A组同类药物耐药时。选择性报告指征还包括：特定部位分离菌（如三代头孢菌素对脑脊液中肠杆菌科菌）、混合感染、多部位感染、患者对A组药物过敏/不耐受/无反应、出于感染控制目的。 C组：包括替代性或补充性的抗菌药物。在某些医疗机构，地方或流行菌株对A组/B组多个药物耐药时，需测试该组药物；当对基本测试药物过敏、或测试少见细菌时、或流行病学和感染控制需要时，需测试的补充药物。 U组：包括那些仅仅或主要用于治疗泌尿道感染的抗菌药物。 各级实验室结合当地病原谱特征、药物代表性、临床需求和本实验室条件等，确定本室不同菌种/药物测试和报告组合。综合上述原则选择自动化药敏板，当药敏板无法满足需求时，予以补充。 3.2 结果解释分类 实验室测试和报告抗菌药物的MIC值或抑菌圈直径（mm）的结果，按折点分为:敏感（S）、剂量依赖型敏感（SDD）、中介（I）、耐药（R）或非敏感（NS）；按ECV分为野生型（WT）或非野生型（NWT）。 3.3 报告原则 3.3.1 基本原则 只有当分离株可能有临床意义而非定植或污染时， 才可报告药敏试验。 药敏试验检测获得性耐药而非天然耐药，实验室应明确各类菌属的天然耐药谱，避免将天然耐药误报为敏感。个别菌属对某些药非常敏感， 或该菌引起的感染不需使用抗菌药物时 （如大肠埃希菌O157引起的腹泻） ， 常规不需药敏试验。实验室根据药物分组、标本类型等，选择性报告药敏结果。 3.3.2 药敏方法和折点的选择 针对不同药物/菌种组合，实验室应选择适当的药敏方法，并制定相应药敏试验的操作程序（包括质控标准、结果解释等）。实验室宜采用国内、外权威机构近两年发布的折点，并每年评审本室药敏检测系统的折点范围；因药敏板条浓度范围受限，无法采用新折点时，需补充相应的耐药表型检测试验，且告知临床。 判定折点的适用性与菌种、药敏方法、检测条件、纸片含量、感染部位、药物（种类、剂量、频次、途径）有关。当上述条件符合相应要求时，折点方适用。对于国际药敏委员会未给出折点的药物，建议采用国内、外专家共识和权威文献等进行操作和判断，并告知临床。 3.3.3 药敏报告特殊注意事项 WS/T 6392018 5 a) 肠道分离的沙门菌属和志贺菌属仅需报告氨苄西林、一种氟喹诺酮类药物和甲氧苄啶/磺胺甲噁唑。肠道外分离的沙门菌属，需增加测试并报告一种三代头孢菌素，必要时测试并报告氯霉素。伤寒样沙门菌（伤寒沙门菌和甲、乙、丙型副伤寒沙门菌）应进行药敏试验，肠道分离的非伤寒样沙门菌一般不进行药敏试验。沙门菌属和志贺菌属对第一代、第二代头孢菌素、头霉素和氨基糖苷类体外可能敏感，但临床治疗无效，所以不测试和报告这些药物。 b) 苯唑西林耐药葡萄球菌对目前可用的-内酰胺类（除头孢洛林等外）均耐药。测试青霉素和苯唑西林或头孢西丁可以推测其它-内酰胺类的敏感性。 c) 肠球菌属对氨基糖苷类（除外高浓度的氨基糖苷类）、头孢菌素类、克林霉素和甲氧苄啶/磺胺甲噁唑体外可能出现敏感，但临床治疗无效，不应报告为敏感。 d) 脑脊液分离菌株，不宜常规测试和报告下列药物：仅有口服剂型的药物、第一代和第二代头孢菌素（除外头孢呋辛注射剂）和头霉菌素类、克林霉素、大环内酯类、 四环素类和氟喹诺酮类。 e) 呼吸道分离株不应测试和报告达托霉素，尿液分离株不报告氯霉素、克林霉素和红霉素，非尿液分离株不测试和报告呋喃妥因。 f) 罕见耐药表型、 广泛耐药或全耐药菌应复核后方可发出药敏报告。 一旦确认应报告医院感染控制办公室。实验室保留这些菌株，以备流行病学调查或临床追加额外的药敏试验之需。 3.3.4 报告单内容和形式 3.3.4.1 一般信息 报告单包括：患者信息（姓名、年龄、性别、病历号等）、临床信息（如科室、临床诊断、抗菌药物使用、标本类型等）、实验室信息（包括标本采集时间、送检时间、接收时间和审核报告时间、操作人和审核人双签名）等。 3.3.4.2 药敏试验 3.3.4.2.1 细菌和药物名称 细菌名称应规范化， 参见细菌命名标准。 宜标注拉丁文名称。 药物名称应使用规范的化学通用名称，不使用商品名。宜同时显示药物的中英文名称，且同一类药物不同品种集中排列。 3.3.4.2.2 结果呈现 a) 报告单应明确列出各类药物对该菌种的折点、本实验室所用标准的版本号或出版时间。 b) 若没有折点而借用其他菌种折点或采用权威文献折点，需备注说明。 c) MIC 法报告 MIC 值（单位为 mg/L 或 g/mL）和结果解释；纸片扩散法报告抑菌圈直径值（应为整数，单位为 mm）。结果解释根据折点或 ECV 判断为 S、I、R、SDD、NS、WT、NWT 等类型。 d) 不报告替代药物的药敏结果。 如用于判断金黄色葡萄球菌对苯唑西林耐药性的头孢西丁不应报告。 3.3.4.2.3 特殊耐药表型 宜在报告中明确标注特殊耐药表型，同时对特殊耐药表型进行专业解释，包括含义、机制、用药限制和建议等。对于罕见耐药现象，进行复核，并标示结果状态，如复核中、已复核等。少见和矛盾耐药表型进行确认。 3.3.4.3 报告单备注或注释 a) 形式性注释：用于符号、缩写等的详细解释。 WS/T 6392018 6 b) 专业性注释：包括概念解释（如特殊菌天然耐药）、临床意义和治疗建议等，专业性注释宜有科学依据。 c) 重要性提示：如“高致病性/高传播性”。 d) 时效性提示：如“若有疑义，请于 48 h 内与实验室联系”。 e) 管理性提示：如“需要上报传染病卡”。 f) 免责提示：如“该结果仅对该标本负责”，“该结果解释宜结合患者临床表现与治疗反应，仅供参考”等。 g) 医院地址和实验室联系方法等。 3.3.5 报告发放 药敏报告应尽快发放。 紧急情况应将部分结果先行发出， 如血培养和脑脊液等其他无菌体液培养的初步药敏试验结果。 无论提前还是延时， 报告上应显示时间， 并注明报告级别（初步报告或最终报告） 。 保存抗菌药物敏感性试验资料，至少每年向临床报告流行病学分析结果。 4 药敏试验方法 4.1 药敏试验方法的分类 药敏试验方法包括：稀释法（包括琼脂稀释法和肉汤稀释法）、纸片扩散法、梯度扩散法和自动化仪器法。稀释法是检测抗菌药物敏感性的定量试验方法，为药敏试验的参考方法。 4.2 稀释法 4.2.1 琼脂稀释法 4.2.1.1 材料 4.2.1.1.1 Mueller-Hinton 琼脂（Mueller-Hinton Agar，MHA） a) 按产品说明称量 MHA 干粉。 b) 103.4 Kpa、121.3 高压蒸汽灭菌 15 min。 c) 立即放至 40 50 水浴锅备用。 d) 培养基制备完毕后室温下（25 ）校正 pH 值为 7.27.4。 e) 某些营养要求高的苛养细菌如流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌和链球菌属等，MHA 培养基须加入相应补充物质或使用特殊培养基，详见附录 A。 4.2.1.1.2 抗菌药物梯度稀释 a) 抗菌药物梯度稀释液的整个配制过程严格无菌操作。 见光易分解的替加环素避光保存， 易降解、不稳定的药物如头孢克洛、氨苄西林、克拉维酸和亚胺培南现用现配。 b) 抗菌药物粉末可采用标准品或药厂生产的商品化粉末。 c) 采用分析天平称药，抗菌药物的有效成分按如下公式计算： 实际称取抗菌药物粉末重量（mg）=实际配制抗菌药物储液的体积（mL）储液浓度（mg/L）/抗菌药物的效价（g/mg） 或 实际配制抗菌药物储液的体积（mL）=实际称取抗菌药物粉末重量（mg）抗菌药物的效价 （g/mg）/储液浓度（mg/L） WS/T 6392018 7 d) 配制药物储液： 药物储液的浓度不低于 1000 mg/L 或高于待测抗菌药物最高检测浓度的 10 倍。对大多数稳定、且不易降解的抗菌药物，将未用完的储液分装至无菌小管，置于-70 或更低温度贮存，时限为 6 个月。每次使用取一管，避免反复冻融影响其活性。 e) 抗菌药物储液的稀释：采用倍比稀释法制备一系列所需抗菌药物检测梯度。 4.2.1.1.3 含药的 MHA 平皿 a) 将梯度对倍稀释的抗菌药物 （生长对照 MHA 平皿加无菌水） 按 1:9 比例加入 4.2.1.1.1 制备的已高压灭菌完毕且温度在 40 50 的 MHA 琼脂中。 b) 将琼脂和抗菌药物充分混匀。 c) 倾注平皿， MHA 含药琼脂平皿厚度为 3 mm4 mm。 d) 室温放置冷却至凝固，当日使用或将平皿装入密闭塑料袋中，置于 2 8 保存，贮存时限为 5 天。 e) 平皿使用前置室温平衡，可置于孵箱中 30 min 使琼脂表面干燥。 4.2.1.2 操作步骤 4.2.1.2.1 制备初始接种菌悬液 被测菌株和质控菌株配制0.5麦氏浊度单位的菌悬液，约1108 CFU/mL2108 CFU/mL，作为初始接种物，并按一定顺序放入试管架。 4.2.1.2.2 稀释接种菌悬液 用无菌肉汤或生理盐水将初始接种物1:10稀释，混匀后将稀释后的接种物按排列顺序分别吸取0.1 mL至96孔微孔板。 4.2.1.2.3 接种菌悬液 a) 标记含药 MHA 平皿接种点方向。 b) 采用多点接种仪或标准接种环等将稀释后的接种物按顺序分别接种 1 L3 L 至无抗菌药物的生长对照平皿、含梯度药 MHA 平皿表面（从低浓度到高浓度）和第二块生长对照平皿。最终菌液接种量为 104 CFU/点（点直径为 5 mm8 mm）。 c) 平皿室温放置至菌点干燥，但放置时间不超过 30 min。 4.2.1.2.4 孵育 置于35 2 空气环境中孵育16 h20 h。苛养菌的药敏试验平皿孵育条件和时间见附录A。 4.2.1.2.5 结果判读 将平皿置于黑色、无反光背景上读取结果。以抑制细菌肉眼可见生长的最低浓度为MIC。 4.2.2 肉汤稀释法 4.2.2.1 材料 4.2.2.1.1 阳离子校正的 Mueller-Hinton 肉汤 （Cation-adjusted Mueller-Hinton broth，CAMHB） a) 按产品说明称量 CAMHB 干粉。 b) 103.4 Kpa、121.3 高压蒸汽灭菌 15 min，冷却至室温备用。 WS/T 6392018 8 c) 培养基制备完毕后宜在室温环境（25 ）校正 pH 值为 7.27.4。 4.2.2.1.2 抗菌药物梯度稀释液 a) 抗菌药物储液配制、保存和稀释同琼脂稀释法。 b) 将配制好的梯度稀释抗菌药物溶液每个梯度按 0.05 mL/孔分装至 96 孔微孔板（微量肉汤稀释法）或按 1 mL/管分装至 13 mm 100 mm 带螺帽的试管中（宏量肉汤稀释法），当日使用或冻存于 -20 备用。 4.2.2.2 操作步骤 4.2.2.2.1 制备初始接种菌悬液 被测菌株和相应质控菌株如大肠埃希菌ATCC 25922配制0.5麦氏浊度单位的菌悬液，作为初始接种物菌悬液。 4.2.2.2.2 稀释接种菌悬液 用4.2.2.1.1制备的CAMHB肉汤将初始接种物1:100倍稀释（微量肉汤稀释法）或1:150倍（宏量肉汤稀释法）稀释，混匀，菌液浓度约为1106 CFU/mL。 4.2.2.2.3 接种菌悬液 a) 将稀释后的接种物按顺序依次吸取 0.05 mL 至 4.2.2.1.2 步骤制备的含等量药 96 孔微孔板或吸取 1 mL 至 4.2.2.1.2 步骤制备的含等量药试管中（最终接种物浓度为 5 105 CFU/mL）。 b) 稀释菌液在 15 min 内接种完毕。 c) 同时将稀释后的接种物接种至不含抗菌药物的非选择性琼脂平皿，以检测接种菌悬液的纯度。 d) 微量肉汤稀释法： 将稀释后的菌悬液接种至不含抗菌药物微孔作为生长对照， 同时设置不加接种菌悬液的含药孔。 e) 宏量肉汤稀释法：设置每一株菌的初始接种物的不含药的生长对照管。 4.2.2.2.4 孵育 a) 接种好的菌液和抗菌药物混合液置于 35 2 孵箱中孵育 16 h20 h。 b) 苛养菌的孵育条件和时间见附录 A。 4.2.2.2.5 接种菌悬液的菌落计数 每一批试验应同时进行接种菌悬液的菌落计数， 以保证微量肉汤稀释法和宏量肉汤稀释法的最终接种菌悬液浓度为5105 CFU/mL，具体步骤： a) 4.2.2.2.3 步骤接种完毕后，立即从质控菌株大肠埃希菌 ATCC 25922 的生长对照孔或生长对照管吸取 0.01 mL。 b) 置于 10 mL 无菌生理盐水中（1:1000 倍稀释）。 c) 混匀后，吸取 0.1 mL 均匀涂布在不含抗菌药物的琼脂平皿上（根据不同细菌生长特性选取非选择性营养琼脂平皿）。 d) 置于 35 2 孵箱中孵育 16 h20 h 后观测：若平皿生长菌落数为 50 CFU 左右，即为最终接种细菌量为 5 105 CFU/mL。 4.2.2.2.6 结果判读 WS/T 6392018 9 a) 以抑制细菌肉眼可见生长的最低浓度为 MIC。 b) 根据生长对照孔/管菌液生长量判定生长终点。革兰阳性球菌检测氯霉素、克林霉素、红霉素、利奈唑胺和四环素时，易出现拖尾现象，读取拖尾现象开始的第一个孔的 MIC 值，忽略微小菌膜。若存在多孔跳孔现象，需重新检测。 4.3 纸片扩散法 4.3.1 材料 4.3.1.1 MHA 琼脂 a) 按下列步骤制备 MHA 培养基： 1) 按产品说明书称量 MHA 干粉，103.4Kpa、121.3 高压蒸汽灭菌 15 min 后放至 40 50 水浴。 2) 将无菌空平皿（内径 9 cm 或 14 cm）置于超净台水平台面上，晃动摇匀 MHA 后倾倒平皿，每块平皿琼脂厚度为 3 mm4 mm。 3) 平皿室温冷却后，2 8 冰箱保存。 b) pH 值：纸片扩散法使用的培养基 pH 值在室温下为 7.27.4。 c) 水分：进行药敏试验时，MHA 琼脂表面应湿润，但不能有水滴，平皿盖上不应有水珠。 4.3.1.2 抗菌药物纸片 药敏纸片为直径6.35 mm、吸水量为0.02 mL的专用药敏纸片。药敏纸片使用前需室温平衡1 h2 h。纸片需密封贮存于-20 冰箱内。 开封后的纸片可置于含干燥剂的螺口塑料或玻璃管中2 8 保存，不超过1周。 4.3.1.3 标准比浊管 a) 用硫酸钡比浊管（0.5 号麦氏单位标准比浊管）标定接种菌液浓度。 b) 比浊管制备方法：取 0.048 mol/L 氯化钡（BaCl2）1.175%（W/V）BaCl2.2H2O 0.5 mL，加到99.5 mL 的 0.18 mol/L 硫酸（1%,V/V）溶液中，制成比浊管，用光径为 1 cm 的紫外分光光度计测定吸光度值来标定比浊管。0.5 号比浊管在 625 nm 波长的吸光度为 0.080.13。选取管径与制备菌液试管相同的螺口试管，每管分装 4 mL6 mL，密封，置于室温避光环境。使用前漩涡震荡混匀。 4.3.2 操作步骤 4.3.2.1 制备接种菌悬液 a) 被测菌株和标准菌株接种于非选择性培养基如血平皿，置于 35 空气培养 18 h24 h（孵育条件参照附录 A 进行）。 b) 采用直接菌落法或肉汤增菌法制备： 1) 直接菌落法：选取孵育 18 h24 h 后的菌落形态一致的且生长较好的 35 个菌落；采用接种环或无菌拭子触碰每个菌落顶部，转移至含有 4 mL5 mL 的胰大豆肉汤或无菌生理盐水中。 2) 肉汤增菌法: 将单个菌落接种至肉汤培养基，置于 35 2 孵育，至浊度接近规定的浓度（通常孵育 2 h6 h）。 WS/T 6392018 10 c) 采用生理盐水或肉汤校正菌液浓度至 0.5 麦氏比浊管（约 1 108 CFU/mL2 108 CFU/mL），也可用电子比浊仪。 4.3.2.2 接种平皿 a) 用无菌棉拭子蘸取菌液，在管内壁将多余菌液旋转挤去。 b) 在 MHA 平皿表面均匀涂布 3 次，每次旋转平皿 60，最后沿平皿内琼脂边缘涂抹一周。 c) 校正浓度后的菌液在 15 min 内接种完毕。 4.3.2.3 贴抗菌药物纸片 a) 接种菌悬液后的 MHA 平皿置室温下干燥 3 min5 min。 b) 用纸片分配器或无菌镊子将抗菌药物纸片紧密贴于平皿。各纸片中心相距24 mm。纸片贴上后不应再移动。 4.3.2.4 孵育 贴上纸片15 min内，须把平皿倒置放于35 孵箱中孵育16 h18 h。对于某些特殊抗菌药物如苯唑西林或万古霉素，孵育时间需延长至24 h。苛养菌等孵育环境和时间见附录A。 4.3.2.5 结果判读 a) 将平皿置于黑色背景下， 利用反射光从平皿背面用游标卡尺或直尺测量无明显细菌生长区域的直径（含纸片），即抑菌圈直径，取整数位，单位为 mm。 b) 培养基若加入血液，须打开平皿盖，借助反射光，从正面测量抑菌圈直径。 c) 测量万古霉素、利奈唑胺和苯唑西林等的抑菌圈时，使用透射光。 d) 测量甲氧苄啶和磺胺类药物的抑菌圈时，可忽视轻微生长（20%或较少菌苔生长）而测量较明显抑制的边缘。 4.4 梯度扩散法 梯度扩散法是一种结合稀释法和纸片扩散法原理对抗菌药物敏感性直接定量的药敏试验方法。 4.4.1 材料 4.4.1.1 梯度扩散法条 商品化梯度扩散法条是一条5 mm 50 mm的无孔试剂载体，一面固定有一系列预先制备的、浓度呈连续指数增长的抗菌药物，另一面有读数和判别刻度。梯度扩散法条抗菌药物浓度梯度可覆盖有20个MIC对倍稀释浓度的宽度范围。 4.4.1.2 培养基 同纸片扩散法。 4.4.2 操作步骤 a) 待测细菌的菌悬液配制和接种方法同纸片扩散法。 b) 待平皿干燥后，用镊子将梯度扩散法条有 MIC 刻度面朝上，贴在已接种被测菌株的平皿表面，梯度扩散法条全长与琼脂表面紧密接触，试条贴好后不应移动。 c) 置于 35 2 孵箱中孵育 16 h18 h。 WS/T 6392018 11 4.4.3 结果判读 读取椭圆形抑菌圈与梯度扩散法条交界点的读值，即为待测抗菌药物的MIC值。 4.5 自动化仪器法 0.5麦氏浊度单位菌悬液的配制方法同纸片扩散法，按照各仪器说明书对菌悬液进行稀释。不同种属细菌稀释后的菌悬液，加入对应的商品化试验板条，上机进行检测。 5 各种属细菌药敏试验 5.1 各种属细菌药敏试验方法和试验条件 临床常见快速生长非苛养菌、常见苛养菌、不常见菌、潜在生物恐怖病原菌、诺卡菌属和其他需氧放线菌、厌氧菌的药敏试验方法和试验条件见附录A。常见菌各种属细菌药敏折点参照参考文献1。 5.2 常见菌特殊耐药表型检测 5.2.1 -内酰胺酶表型检测 临床报告葡萄球菌属、 流感嗜血杆菌、 卡他莫拉菌、 淋病奈瑟菌和一些厌氧菌对青霉素的敏感性前，应进行-内酰胺酶的补充药敏试验（方法见表1）。青霉素可用于预测上述种属对青霉素酶不稳定的青霉素类的敏感性，包括青霉素、阿莫西林、氨苄西林、羧苄西林、替卡西林、阿洛西林和哌拉西林等。 表1 -内酰胺酶表型检测 检测检测 - -内内酰胺酶产生酰胺酶产生 菌种菌种 流感嗜血杆菌、卡他莫拉流感嗜血杆菌、卡他莫拉菌、淋病奈瑟菌和一些厌菌、淋病奈瑟菌和一些厌氧菌氧菌 金黄色葡萄球菌（当青霉素金黄色葡萄球菌（当青霉素 MICMIC0.12 mg/L0.12 mg/L 或纸片扩散法抑菌圈直或纸片扩散法抑菌圈直径径29 mm29 mm 时）时） 金黄色葡萄球菌和包括路登葡萄球金黄色葡萄球菌和包括路登葡萄球菌在内的凝固酶阴性葡萄球菌（当青菌在内的凝固酶阴性葡萄球菌（当青霉素霉素 MICMIC0.12 mg/L0.12 mg/L 或纸片扩散法或纸片扩散法抑菌圈直径抑菌圈直径29 mm29 mm 时）时） 检测方法检测方法 直接头孢硝噻吩纸片法 青霉素纸片扩散法 （青霉素抑菌圈-边缘试验） 可诱导 -内酰胺酶试验 培养基培养基 - MHA - 药物浓度药物浓度 头孢硝噻吩纸片 青霉素纸片（10 单位） 青霉素（10 单位）或头孢西丁（30 g）纸片 头孢硝噻吩纸片 接种接种 孵育 16 h20 h 的菌落或细菌悬液 标准纸片扩散法操作步骤 诱导生长（孵育 16 h18 h 后的 MHA平皿或血平皿上青霉素或头孢西丁纸片边缘的生长物） 孵育条件孵育条件 室温环境 35 2 空气环境 室温环境 孵育时间孵育时间 1 h 或遵照商品说明书 16 h18 h 1 h 或遵照商品说明书 结果读取结果读取b b 阳性：纸片由黄色变为红色或粉色 阴性：纸片未变色，仍为黄色 阳性：抑菌圈边缘锐利或如同“绝壁” 阴性：抑菌圈边缘模糊或如同“海滩” 阳性：纸片由黄色变为红色或粉色 阴性：纸片未变色，仍为黄色；金黄色葡萄球菌采用此法检测，结果为阴性时需增加青霉素抑菌圈-边缘试验确认是否产-内酰胺酶 质控菌株质控菌株 阳性：阳性：金黄色葡萄球菌 ATCC 29213； 阴性：阴性：金黄色葡萄球菌 ATCC 25923。 5.2.2 葡萄球菌属对苯唑西林耐药性检测 检测葡萄球菌属对苯唑西林敏感性的方法见表 2。 苯唑西林或头孢西丁的药敏结果适用于其他对青霉素酶稳定的青霉素类如氯唑西林、双氯西林、氟氯西林、甲氧西林和萘夫西林。苯唑西林或头孢西丁WS/T 6392018 12 药敏试验结果为敏感，即对 -内酰胺酶抑制剂复合物、头孢菌素类和碳青霉烯类敏感。一旦检测为苯唑西林耐药，即对所有 -内酰胺类（头孢洛林除外）药物耐药。 表2 苯唑西林耐药葡萄球菌表型检测方法 葡萄球菌分类葡萄球菌分类 苯唑西林苯唑西林 头孢西丁头孢西丁 苯唑西林盐琼脂苯唑西林盐琼脂 筛选试验筛选试验 纸片扩散法纸片扩散法 （1 g） MICMIC 法法 纸片扩散法纸片扩散法 （30 g） MICMIC 法法 金黄色金黄色葡萄球菌葡萄球菌 不可检测 可检测 可检测 可检测 可检测 路登葡萄球菌路登葡萄球菌 不可检测 可检测 可检测 可检测 不可检测 假中间葡萄球菌假中间葡萄球菌 可检测 可检测 不可检测 不可检测 不可检测 5.2.3 万古霉素中介的金黄色葡萄球菌（Vancomycin intermediate S. aureus，VISA）、万古霉素耐药的金黄色葡萄球菌（Vancomycin resistant S. aureus，VRSA）和万古霉素耐药肠球菌（Vancomycin resistant Enterococcus, VRE）表型检测，见表 3。 表3 金黄色葡萄球菌和肠球菌属对万古霉素的耐药性检测 检测检测 万古霉素的耐药性万古霉素的耐药性 菌种菌种 金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌a a 肠球菌属肠球菌属 检测方法检测方法 MICMIC 法法 纸片扩散法纸片扩散法b b MICMIC 法法 孵育时间孵育时间 24 h 24 h 24 h 结果判读结果判读 VSSA：2 mg/L VISAc c：4 mg/L8 mg/L VRSAc c：16 mg/L 敏感：17 mm 中介：15 mm16 mm，需进一步测定 MIC 值。若MIC 值仍为中介，即 8 mg/L16 mg/L，需进一步确认菌株是否为鹑鸡肠球菌和铅黄肠球菌， 因该两种细菌对万古霉素通常中介或耐药。 VRE：14 mm 或（和）抑菌圈内发现任何生长 敏感：4 mg/L 中介c c： 8 mg/L16 mg/L VREc c：32 mg/L 质控菌株质控菌株 阳性：阳性：粪肠球菌 ATCC 51299；阴性：阴性：粪肠球菌 ATCC 29212。 a 不应采用纸片扩散法检测金黄色葡萄球菌对万古霉素耐药性。 b 在测量万古霉素抑菌圈直径时，用透射光仔细检查抑菌圈内纸片周围是否有微小菌落或片状轻微生长。 c 当纸片扩散法或自动化仪器法检测出万古霉素中介或耐药时，需用 MIC 法（肉汤稀释法或琼脂稀释法）进一步确认。 5.2.4 诱导克林霉素耐药性检测 当葡萄球菌属、肺炎链球菌和-溶血链球菌对大环内酯类如红霉素耐药，而对克林霉素中介或敏感时，宜进行诱导克林霉素耐药性检测，包括纸片扩散法（D试验，表4）、微量肉汤稀释法和自动化仪器法。微量肉汤稀释法是将4 mg/L的红霉素和0.5 mg/L的克林霉素置于同一孔里，35 2 空气环境孵育18 h24 h检测后，检测菌株是否生长。生长即为阳性，不生长为阴性。 表4 葡萄球菌属、肺炎链球菌和 -溶血链球菌的诱导克林霉素耐药性检测方法 检测检测 诱导克林霉素耐药性诱导克林霉素耐药性 菌种菌种 葡萄球菌属葡萄球菌属 肺炎链球菌和肺炎链球菌和 - -溶血链球菌溶血链球菌 检测方法检测方法 纸片扩散法 纸片扩散法 培养基培养基 MHA 含 5%（V/V）的脱纤维绵羊血的 MHA 或含 5%（V/V）脱纤维绵羊血的 TSA 平皿 药物浓度药物浓度 红霉素（15 g）和克林霉素（2 g）纸片 红霉素（15 g）和克林霉素（2 g）纸片 接种接种 标准纸片扩散法操作步骤 红霉素和克林霉素纸片边缘相距 15 mm26 mm 标准纸片扩散法操作步骤 红霉素和克林霉素纸片边缘相距 12 mm 孵育条件孵育条件 35 2 空气环境 35 2 的 5%的 CO2环境 孵育时间孵育时间 16 h18 h 20 h24 h 结果读取结果读取 阳性：邻近红霉素纸片侧，克林霉素抑菌圈出现“截平”现象（称为“D”抑菌圈） ，提示存在可诱导的克林霉素耐药，报告克林霉素耐药。阴性：无“截平”现象，报告克林霉素敏感。 WS/T 6392018 13 常规质控菌株常规质控菌株 金黄色葡萄球菌 ATCC 25923 肺炎链球菌 ATCC 49619 补充的质控菌株补充的质控菌株 金黄色葡萄球菌 BAA-976 （D 试验阴性） ，金黄色葡萄球菌 BAA-977（D 试验阳性） 。 5.2.5 肠球菌属氨基糖苷类高水平耐药（High-level aminoglycoside resistance, HLAR）表型检测 肠球菌属氨基糖苷类高水平耐药表型检测见表 5。 表5 肠球菌属氨基糖苷类高水平耐药表型检测 检测检测 庆大霉素高水平耐药性庆大霉素高水平耐药性 链霉素高水平耐药性链霉素高水平耐药性 检测检测 方法方法 纸片扩散法 微 量 肉 汤 稀释法 琼脂稀释法 纸片扩散法 微量肉汤稀释法 琼脂稀释法 培养基培养基 MHA BHI 肉汤 BHI 琼脂 MHA BHI 肉汤 BHI 琼脂 药物药物 浓度浓度 庆大霉素 （120 g） 庆大霉素 500 mg/L 庆大霉素 500 mg/L 链霉素纸片 （300 g） 链霉素 1000 mg/L 链霉素 2000 mg/L 接种接种 标准纸片扩散法操作步骤 标 准 微 量 肉汤 稀 释 法 操作步骤 吸取 10 L 的0.5麦氏浊度菌悬液到琼脂表面 标准纸片扩散法操作步骤 标准微量肉汤稀释法操作步骤 吸取 10 L的 0.5 麦氏浊度菌悬液到琼脂表面 孵育孵育 条件条件 35 2 空气环境 35 2 空气环境 35 2 空气环境 35 2 空气环境 35 2 空气环境 35 2 空气环境 孵育孵育 时间时间 16 h18 h 24 h 24 h 16 h18 h 24 h48 h 24 h48 h 结果结果 读取读取 耐药： 6 mm， 即 HLAR 不确定：7 mm9 mm，需 MIC 法进一步确认 敏感：10 mm HLAR：微孔内有任何生长 HLAR：1 个菌落生长 耐药： 6 mm， 即 HLAR 不确定：7 mm9 mm，需 MIC 法进一步确认 敏感：10 mm HLAR：微孔内有任何生长 HLAR：1 个菌落生长 质控质控 菌株菌株 阳性：粪肠球菌 ATCC 51299，阴性：粪肠球菌 ATCC 29212 备注备注 纸片扩散法为筛选试验，不确定时宜采用 MIC 方法确认 5.2.6 产超广谱-内酰胺酶（Extended-spectrum -lactamases, ESBLs）表型检测 ESBLs检测适用菌种为大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌和奇异变形杆菌。ESBLs确证试验包括纸片扩散法、MIC法（稀释法或梯度扩散法）。 纸片扩散法：使用每片含30 g头孢他啶、头孢噻肟纸片和头孢他啶/克拉维酸（30 g/10 g）、头孢噻肟/克拉维酸（30 g/10 g）复合物纸片进行检测，当任何一种复合物纸片抑菌圈直径比其单独药敏纸片抑菌圈直径大于或等于5 mm，可确证该菌株产ESBLs。 稀释法： 使用头孢他啶 （0.25 mg/L128 mg/L） 、头孢他啶/克拉维酸 （0.25/4 mg/L128/4 mg/L） 、头孢噻肟（0.25 mg/L64 mg/L）、头孢噻肟/克拉维酸（0.25/4 mg/L64/4 mg/L）进行检测，当与克拉维酸联合药物组的MIC小于或等于单独药物组MIC 3个倍比稀释度时（或比值8），可确证该菌株产ESBLs。 5.2.7 碳青霉烯酶的表型检测 5.2.7.1 适用条件 当肠杆菌科细菌和铜绿假单胞菌对厄