GC-MS法测定艾瑞昔布中溴乙酸酯类基因毒性杂质.pdf

天津药学TianjinPharmacy2023年第35卷第5期含麸炒枳壳、橘红以柚皮苷计，存在不合理性，因橘红几乎不含柚皮苷，故该成分基本都来源于麸炒枳壳，这对药厂遴选药材提出了更高的要求，从而给生产造成了很大的困难。其次，可通过该方法检出的橙皮苷与法标中柚皮苷的含量来判断厂家是否存在替代或混用投料的现象，如果该品种柚皮苷含量较高，但橙皮苷含量极低，则可初步判断其处方以化橘红代替橘红投料，目前市售的小儿抗痫胶囊中确实存在此种情况。最后，监管部门应该从投料药材的源头进行监督检查，精准溯源该儿童用药处方中橘红与化橘红的种类，杜绝二者混用或替代的风险隐患。未来希望该方法能解决更多药企在生产过程中存在的实际困难，同时也为监管打假提供良好的技术支持与保障。参考文献1王晓雅，喻惠敏，孙汉，等.儿童用药研究现状 J.中国农村卫生事业管理，2018，38（10）：60-62.2中国药典 S.一部.2015：560-561.3陈岩，胡燕琴.橘红与化橘红临床药用不同 J.北京中医药，2001，20（3）：43.4谢扬，潘伟，杨雪峰，等.HPLC测定消积化虫散中橙皮苷含量 J.亚太传统医药，2017，13（13）：31-33.5但宇超，曾琪，马安献，等.经典名方华盖散中橙皮苷含量测定方法 J.生物化工，2019，5（4）：18-20，31.6姚娜，黄燕明，李雪银，等.HPLC同步测定麸炒枳壳配方颗粒特征图谱与柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷含量 J.中国现代中药，2019，21（11）：1569-1572.7陈少茹，李智勇.中风复元合剂中芍药苷和橙皮苷的含量测定 J.今日药学，2020，30（1）：15-18.8张恒，饶坤林，向韩.橙皮苷药理活性研究进展 J.中南药学，2016，14（10）：1097-1100.9张瑞.HPLC法测定橘红片中橙皮苷和柚皮苷含量 J.安徽医药，2013，（3）：47-48.10冷玉杰.橘红丸质量标准研究 J.辽宁中医药大学学报，2013（9）：56-58.11中国药典 S.一部.2020：395.收稿日期：2023鄄05鄄31艾瑞昔布（Imrecoxib）化学名为N-正丙基-3-（4-甲基苯基）-4-（4-甲磺酰基苯基）-2，5-二氢-1H-2-吡咯酮。是一种选择性环氧合酶2（cyclooxygenase-2，COX-2）抑制剂，可用于关节炎等诱发的疼痛症状，与塞来昔布相当，临床上可以与其他药物联合应用于抗炎治疗1-5。艾瑞昔布的合成工艺中会使用溴乙酸，溴乙酸会与有机溶剂甲醇、乙醇、异丙醇等反应生产溴乙酸酯类物质，溴乙酸酯类化合物由于其脂肪族卤GC-MS法测定艾瑞昔布中溴乙酸酯类基因毒性杂质刘丹丹1，李云达2（1.开封市中医院，河南475000；2.天津凯莱英生命科学技术有限公司，天津300457）摘 要目的：建立气质联用的方法测定艾瑞昔布中溴乙酸酯类基因毒性杂质溴乙酸甲酯、溴乙酸乙酯、溴乙酸丙酯、溴乙酸异丙酯的含量。方法：色谱柱为DB-5MS（30 m0.25 mm，0.25 m）；进样口温度为250；载气为高纯氦气，流速为1.0 ml/min；升温程序：起始柱温为40，保持3 min，再以20/min升至300，保持3 min；进样方式为直接进样，进样体积为1 l；分流比为101。离子源为EI源，离子源温度为260，电离能量70 eV；采集模式为选择性离子监测（SIM）。结果：溴乙酸甲酯在浓度10.260.9 ng/ml，溴乙酸乙酯在浓度5.262.1 ng/ml，溴乙酸异丙酯在浓度3.161.4ng/ml，溴乙酸丙酯在浓度4.461.1 ng/ml范围内浓度与峰面积线性关系良好，相关系数均大于0.99，溴乙酸甲酯、溴乙酸乙酯、溴乙酸丙酯、溴乙酸异丙酯的平均回收率均在98%102%范围内，回收率的RSD均小于2%，方法的耐用性良好。结论：该方法高效、准确、灵敏度高，可以用于艾瑞昔布中溴乙酸酯类基因毒性杂质溴乙酸甲酯、溴乙酸乙酯、溴乙酸丙酯、溴乙酸异丙酯的测定。关键词GC-MS；艾瑞昔布；基因毒性杂质；溴乙酸酯中图分类号：R927.1文献标识：A文章编号：1006-5687（2023）05-0013-0513天津药学TianjinPharmacy2023年第35卷第5期素基团为警示结构，因此应该按照基因毒性杂质进行研究与控制6。按照终生可接受摄入量限定在1.5 g/d的毒理学关注阈值（TTC），查阅其说明书，本品为口服给药，应与食物同服，1次/d。由说明书可知该药的最大日剂量为200 mg，基于此计算得出溴乙酸酯类化合物的限度分别为7.5 ppm。基因毒性杂质的检测方法基本涵盖了所有通用的分析方法，比如高效液相色谱法、气相色谱法、离子色谱法、质谱法等，有时还会采用衍生化法，其中质谱法由于专属性强、灵敏度高被广泛应用于基因毒性杂质的研究中7-11。查阅文献未见基因毒性杂质溴乙酸酯类化合物的分析研究。基于被测物的性质，本研究采用GC-MS法进行艾瑞昔布中溴乙酸甲酯、溴乙酸乙酯、溴乙酸丙酯、溴乙酸异丙酯4种基因毒性杂质的测定，并进行了系统的方法学验证，并对多批次样品进行了测定，建立了科学合理的控制策略。1仪器与试药1.1仪器Agilent 7890A-7000D三重四极杆气质联仪（MassHunter工作站，美国安捷伦公司）；METTLERXS105电子天平（十万分之一，瑞士梅特勒-托利多公司）；KQ3000超声波清洗机（昆山超声仪器有限公司）。1.2试药艾瑞昔布原料药（天津凯莱英生命科学技术有限公司提供，批号211003，211004，211005）。溴乙酸甲酯对照品（批号197651，纯度98%）、溴乙酸乙酯对照品（批号C15859，纯度98%）、溴乙酸丙酯对照品（批号L11951，纯度97%）、溴乙酸异丙酯对照品（批号133529，纯度95%）均购于百灵威科技；乙腈（色谱纯，美国默克公司）。水为市售纯净水（屈臣氏），其余试剂均为分析纯。2方法与结果2.1色谱条件色谱柱为Agilent DB-5MS（30 m0.25 mm，0.25 m）；进样口温度为260；载气为高纯氦气，流速为1 ml/min；升温程序：起始柱温为40，保持3 min，再以20/min升至300，保持3 min；进样方式为直接进样，进样体积为1 l；分流比为101。2.2质谱条件离子源为EI源，离子源温度为260，电离能量70 eV；采集模式为选择性离子监测（SIM），待测物的质谱离子参数见表1，质谱图见图1。2.3溶液的制备2.3.1对照品储备溶液的制备精密称取溴乙酸甲酯、溴乙酸乙酯、溴乙酸丙酯、溴乙酸异丙酯适量于量瓶中，配制成含溴乙酸甲酯、溴乙酸乙酯、溴乙酸丙酯、溴乙酸异丙酯均为3 mg/ml的对照品储备溶液。2.3.2对照品溶液的制备精密量取称取对照品储备溶液适量于量瓶中，配制成含溴乙酸甲酯、溴乙酸乙酯、溴乙酸丙酯、溴乙酸异丙酯均为30 ng/ml的对照品溶液。2.3.3供试品溶液的制备精密称定艾瑞昔布原料药适量，加乙腈适量，超声10 min，溶解后，用乙腈定容，稀释制成每1 ml中含艾瑞昔布约4 mg的溶液，摇匀，即得。名称分子量碎片离子（m/z）定量离子（m/z）定性离子（m/z）溴乙酸甲酯152.9842，59，72，93，95，108，110，121，1239342，59溴乙酸乙酯167.0142，43，73，93，95，121，123，138，14014043，93溴乙酸丙酯181.0341，42，43，59，93，121，123，139，141，165，16714143，121溴乙酸异丙酯181.0332，41，42，43，93，95，121，123，139，14114142，123表1待测物的质谱离子参数ABCD图1溴乙酸甲酯（A）溴乙酸乙酯（B）溴乙酸异丙酯（C）溴乙酸丙酯（D）质谱图14天津药学TianjinPharmacy2023年第35卷第5期2.3.4加标供试品溶液的制备精密称定已知含量的艾瑞昔布原料药适量，加对照品溶液适量，超声10 min，溶解后，用对照品溶液定容，稀释制成每1 ml中含艾瑞昔布约4 mg，溴乙酸甲酯、溴乙酸乙酯、溴乙酸丙酯、溴乙酸异丙酯均为30 ng/ml的溶液，摇匀，即得。2.4专属性试验与系统适应性试验取空白溶液乙腈、对照品溶液和供试品溶液，照文中前述的质谱色谱条件分别进行测定，见图2。试验结果表明空白无干扰，各待测峰的分离度均符合要求，本方法的专属性好。取对照品溶液，平行制备6份，作为系统适用性溶液，分别进行测定，要求各待测峰的保留时间的RSD均小于1%，待测物峰面积的RSD均小于2%。试验结果表明待测物溴乙酸甲酯、溴乙酸乙酯、溴乙酸丙酯和溴乙酸异丙酯的保留时间的RSD分别为0.87%、0.52%、0.72%和0.66%；待测物溴乙酸甲酯、溴乙酸乙酯、溴乙酸丙酯和溴乙酸异丙酯的峰面积的RSD分别为0.97%、1.39%、1.83%和1.22%，均符合要求。2.5检测限与定量限试验取对照品溶液，加乙腈稀释，按照文中前述的质谱色谱条件测定，定量限溶液的要求为信噪比大于10，检测限溶液的要求为信噪比大于3。通过试验确定溴乙酸甲酯、溴乙酸乙酯、溴乙酸丙酯和溴乙酸异丙酯的定量限浓度分别为10.2、5.2、3.1和4.4 ng/ml，信噪比分别为11.3、10.8、12.7和10.2；溴乙酸甲酯、溴乙酸乙酯、溴乙酸丙酯和溴乙酸异丙酯的检测限浓度分别为5.1、2.6、1.6和2.2 ng/ml，信噪比分别为4.3、5.2、5.6和3.6。2.6线性试验取对照品储备溶液，加乙腈逐级稀释，摇匀，即得定量限浓度200%限度浓度的线性试验溶液。按照文中前述的质谱色谱条件测定，以溴乙酸甲酯、溴乙酸乙酯、溴乙酸丙酯和溴乙酸异丙酯的浓度为横坐标，峰面积响应值为纵坐标，作图得到溴乙酸甲酯、溴乙酸乙酯、溴乙酸丙酯和溴乙酸异丙酯的线性方程与相关系数r，要求溴乙酸甲酯、溴乙酸乙酯、溴乙酸丙酯和溴乙酸异丙酯的线性方程相关系数r应不小于0.99，Y轴截距应在100响应值的25以内，结果见表2。试验结果表明，溴乙酸甲酯在浓度10.260.9 ng/ml，溴乙酸乙酯在浓度5.262.1 ng/ml，溴乙酸异丙酯在浓度3.161.4 ng/ml，溴乙酸丙酯在浓度4.461.1 ng/ml范围内浓度与峰面积线性关系良好，相关系数r均大于0.99，Y轴截距在100响应值的25以内，线性范围符合测定要求。2.7重复性试验取对照品溶液，平行制备6份，即得重复性试验溶液1。按照文中前述的质谱色谱条件测定，分别记录溴乙酸甲酯、溴乙酸乙酯、溴乙酸丙酯和溴乙酸异丙酯的峰面积。结果溴乙酸甲酯、溴乙酸乙酯、溴乙酸丙酯和溴乙酸异丙酯的峰面积的RSD分别为1.4%、0.7%、0.9%和1.2%。取加标供试品溶液（批号211003），平行制备6份，即得重复性试验溶液2。按照文中前述的质谱色谱条件测定，分别记录溴乙酸甲酯、溴乙酸乙酯、溴乙酸丙酯和溴乙酸异丙酯的t/minBt/minAt/minC1.溴乙酸甲酯2.溴乙酸乙酯3.溴乙酸异丙酯4.溴乙酸丙酯图2空白溶液（A）对照溶液（B）供试品溶液（C）GC-MS谱图名称线性方程r溴乙酸甲酯Y=122.14X-74.2130.999 5溴乙酸乙酯Y=84.637X-66.3850.999 7溴乙酸丙酯Y=184.26X-226.940.999 8溴乙酸异丙酯Y=62.825X-42.3860.999 8表2线性试验结果051015051015051015132415天津药学TianjinPharmacy2023年第35卷第5期峰面积。结果溴乙酸甲酯、溴乙酸乙酯、溴乙酸丙酯和溴乙酸异丙酯的峰面积的RSD分别为1.3%、0.8%、0.7%和0.5%。两种重复性溶液中峰面积的RSD均小于2%，表明该方法的重复性良好，符合要求。2.8精密度试验取对照品溶液，连续进样6次，溴乙酸甲酯、溴乙酸乙酯、溴乙酸丙酯和溴乙酸异丙酯的峰面积的RSD分别为0.3%、0.2%、0.7%和0.5%，RSD均1%，表明仪器精密度良好。2.9回收率试验称取已知含量的艾瑞昔布（批号211003）约40 mg，共9份，精密称定，置于10 ml量瓶中，分别按照限度水平的80%、100%、120%三个浓度水平（对应浓度分别为6、7.5和9 g/g）准确加入不同浓度的混合对照品溶液溶解并稀释至刻度，作为加样回收试验溶液，每个浓度水平平行配制3份，依法进样测定，结果溴乙酸甲酯、溴乙酸乙酯、溴乙酸丙酯和溴乙酸异丙酯平均回收率分别为99.95%、99.78%、100.19%和100.67%，RSD分别为0.37%、1.11%、1.77%和0.34%，见表3-6，结果表明所建立方法的回收率符合要求。2.10稳定性试验取对照品溶液，按照文中前述的质谱色谱条件测定，分别在0、2、4、6、8、12、16、20和24 h的时间点进行测定。试验结果表明24 h内对照品溶液中溴乙酸甲酯、溴乙酸乙酯、溴乙酸丙酯和溴乙酸异丙酯的峰面积RSD分别为0.3%、0.2%、0.4%和0.5%，峰面积RSD没有显著变化，溶液在24 h内稳定。取加标供试品溶液（批号211003），按照文中前述的质谱色谱条件测定，分别在0、2、4、6、8、12、16、20和24 h的时间点进行测定。试验结果表明24 h内对照品溶液中溴乙酸甲酯、溴乙酸乙酯、溴乙酸丙酯和溴乙酸异丙酯的峰面积RSD分别为0.8%、0.8%、0.7%和0.9%，峰面积RSD没有显著变化，溶液在24 h内稳定。2.11耐用性试验分别考查了离子源温度 （26010）、进样口温度 （26010）、流速 （1.00.1）ml/min、升温速率 （201）、更换气相色谱柱的不同条件下，计算加标供试品溶液中各基因毒性杂质的回收率。试验结果表明在上述检测条件下，溴乙酸甲酯、溴乙酸乙酯、溴乙酸丙酯和溴乙酸异丙酯的回收率均在98%102%范围内，证明了该方法的耐用性良好。表4溴乙酸乙酯回收率试验结果（n=9）样品含量（ng）加入量（ng）测定量（ng）回收率（%）0.0241.7241.199.750.0241.7241.9100.080.0241.7242.4100.290.0302.1302.9100.260.0302.1301.099.640.0302.1302.5100.130.0362.5361.299.640.0362.5360.199.340.0362.5364.1100.44样品含量（ng）加入量（ng）测定量（ng）回收率（%）0.0241.0237.198.380.0241.0236.398.050.0241.0238.298.840.0301.2300.699.800.0301.2301.9100.230.0301.2302.4100.400.0361.4362.5100.300.0361.4364.5100.860.0361.4365.7101.19表3溴乙酸甲酯回收率试验结果（n=9）表6溴乙酸异丙酯回收率试验结果（n=9）样品含量（ng）加入量（ng）测定量（ng）回收率（%）0.0241.1243.5101.000.0241.1242.8100.710.0241.1244.2101.290.0301.4301.9100.170.0301.4302.6100.400.0301.4303.7100.760.0361.7363.1100.390.0361.7363.8100.580.0361.7364.4100.75表5溴乙酸丙酯回收率试验结果（n=9）样品含量（ng）加入量（ng）测定量（ng）回收率（%）0.0240.6243.5101.210.0240.6242.6100.830.0240.6244.7101.700.0300.8295.598.240.0300.8305.8101.660.0300.8303.2100.800.0361.0355.498.450.0361.0350.597.090.0361.0367.3101.7516天津药学TianjinPharmacy2023年第35卷第5期2.12样品测定取3批中试批样品，配制成供试品溶液，按照文中前述的质谱色谱条件进行测定，按外标法计算溴乙酸甲酯、溴乙酸乙酯、溴乙酸丙酯和溴乙酸异丙酯基因毒性杂质的含量，均未检出，均符合限度的要求，具体结果见表7。3讨论3.1色谱条件的优化色谱柱的优化，分别选择了不同极性的气相毛细管色谱柱，如Agilent DB-5MS、Agilent DB-624MS与Agilent WAXMS，非极性色谱柱的分离度和各项参数更优，优选Agilent DB-5MS气相色谱柱。稀释剂的选择，药物的溶解度很差，优选了几种溶解度比较好的溶剂，如二甲基亚砜、N-甲基吡咯烷酮、乙腈与N，N-二甲基甲酰胺作为溶剂，其中在乙腈的溶解度和稳定性最好，优选乙腈作为最终的溶剂。进样方式的选择，分别考查了顶空进样方式与直接进样方式，直接进样的灵敏度更高，顶空进样会造成待测物的稳定性下降，进而对于测定造成干扰，因此采用直接进样方式。载气的选择，主要考查了氮气和氦气，氮气的成本低，氦气的成本高，经过比对研究，氦气的峰型和基线更优，优选氦气作为载气。分流比的选择，对于直接进样方式，分流比的选择至关重要，分别考查了51、101、151、201，优选101作为最终的参数。3.2溴乙酸酯类基因毒性杂质的控制策略基因毒性杂质因其特殊性，无论是仿制药，还是创新药，都是药品申报注册中的技术资料核查的重点，因此制定合理的控制措施是非常必要的，特别是在药物的研发阶段。在本试验中，笔者对于艾瑞昔布原料药中的溴乙酸甲酯、溴乙酸乙酯、溴乙酸丙酯和溴乙酸异丙酯进行了研究，3批次中试样品中均未检出。按照ICH指导原则的要求，多批次样品中的检测结果均小于限度的30%，可以不订入质量标准。在后续的研究中，将继续对样品进行检测，积累足够的数据，降低质量的风险。通过对于原料药的基因毒性杂质的控制，进而保证相关制剂产品的基因毒性杂质的产生风险，保证制剂产品的质量。本试验建立的GC-MS直接进样的方法，相对于气相色谱法灵敏度更高，专属性更强，可以用于艾瑞昔布中溴乙酸酯类基因毒性杂质溴乙酸甲酯、溴乙酸乙酯、溴乙酸丙酯和溴乙酸异丙酯检测，能够更好地控制该产品的质量，保证用药的安全。参考文献1罗叶萍，吴松，阳国平.艾瑞昔布的研发及应用进展 J.中国临床药理学杂志，2021，37（5）：596-600.2董杰，王可欣，何文娟，等.艾瑞昔布对CYP2C9酶活性及mRNA和蛋白表达的影响 J.中国医院药学杂志，2022，42（11）：1112-1116.3王小波，周硌瑶，周少朋.艾瑞昔布联合奥沙利铂对裸鼠人结肠癌LOVO细胞移植瘤模型的细胞凋亡作用机制研究 J.中国临床药理学杂志，2020，36（16）：2444-2447.4武乖利，边林.艾瑞昔布的合成 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