HPLC测定兽用替米考星注射液含量的不确定度分析.pdf

实验研究HPLC测定兽用替米考星注射液含量的不确定度分析上海畜牧兽医通讯2 0 2 3年第5期胡永萍，石露莎1*，莫艳萍”，于莹”（云南省红河州动物疫病预防控制中心，云南蒙自6 6 1199；2云南省泸西县动物卫生监督所，云南红河哈尼族彝族自治州6 52 40 0；3北京维德维康生物技术有限公司，北京10 0 0 9 5）摘要：为了评定高效液相色谱法（high performance liquid chromatography,HPLC)测定兽用替米考星注射液含量的不确定度，分别从对照品重复测量、对照品溶液制备、样品溶液制备、测量仪器4个方向，分析不确定度来源，计算合成不确定度及相对扩展不确定度。结果显示：对照品重复测量、对照品溶液制备、样品溶液制备、测量仪器引人的相对标准不确定度分别为0.7 3910-3、1.18 310-3、0.93410-3和0.7 57 10-3，其中样品溶液制备过程中样品量取体积引入的相对标准不确定度（1.7 34X10-3）是该检测方法不确定度的主要来源，应重点关注并严格控制。关键词：兽用替米考星注射液；高效液相色谱法（HPLC)；不确定度替米考星（tilmicosin)是一种以泰乐菌素的水解产物为前体半合成的大环内酯类畜禽专用抗生素1，主要用于治疗牛、羊、鸡、猪等动物的细菌、支原体、螺旋体等感染，对禽畜呼吸道感染也有很好的疗效2 。临床使用的替米考星产品多为其磷酸盐制剂，具有较强、较广的抗菌和抗病毒功效，能提高动物机体免疫力3，且无交叉耐药性，用过替米考星的禽畜的产品对人类无潜在危险性，已成为禽畜养殖领域的主流抗生素4-5。高效液相色谱法（highperformanceliquid chromatography，H PLC）是现行兽药质量标准（2 0 17 版）C6中规定的替米考星注射液中替米考星含量标准测定方法，但该方法操作步骤相对复杂，测量结果可能存在误差，导致药物用量不当进而影响临床使用疗效。不确定度是指由于测量误差的存在，对测量值不能肯定的程度，同时也表明该结果的可信赖程度，是衡量测量结果质量的指标7-8 。测量不确定度评定是日常检验工作的重要组成部分，但目前关于替米考星含量测定不确定度的评定鲜有报道。因此，笔者结合CNAS-GL06化学分析中不确定度的评估指南测量不确定度评定和表示和成分分析中的数理统计及不确定度评定概要9-1中不确定度评定的基本程序，对HPLC测量兽用替米考星注射液的不确定度进行评定，分析检测的关键点和影响不确定度的因素，为客观评价替米考星含量的测定结果提供参考数据。1材料与方法1.1主要仪器与试剂高效液相色谱仪（Ultimate3000）、纯乙睛（色谱级）为赛默飞世尔科技（中国）有限公司产品，电子天平（A P135W)为日本岛津仪器有限公司产品，替米考星对照品（批号：K0311805)为中国兽医药品监察所产品，替米考星注射液（批号：10 0 32 9-2 0 18 32 4）为四川康而好动物药业有限公司产品，色谱柱（AgelaVenusilXBPC18，4.6 mmX2 50 mm，5m）为天津博纳艾杰尔科技有限公司产品，纯净水（色谱级）为杭州娃哈哈集团有限公司产品。作者简介：胡永萍（197 7 一），女，本科，正高级兽医师，研究方向：兽药及畜产品质量安全监测。*通信作者，E-mail：40 2 0 90 12 1 q q.c o m14实验研究1.2方法1.2.1 HPLC分析条件色谱条件（理论塔板数2 0 0 0 12 );DAD检测器，进样量为2 0 L,波长为2 54nm，流速为1.0 mL/min，柱温为30；AgelaVenusilXBPC18色谱柱；磷酸盐缓冲液-乙腈（体积比1：1,pH为8.0)为流动相。1.2.2溶液的制备对照品溶液制备13：精密称取替米考星对照品8 8.34mg，加入1mol/L盐酸溶液0.5mL，溶解后转移到50 mL容量瓶中，使用流动相定容，摇匀。样品溶液制备13：量取兽用替米考星注射液5mL，放置在50 mL容量瓶中，使用流动相稀释定容，摇匀。1.2.3系统适用性实验峰面积采用外标法定量14，量取对照品溶液2 0 L，注入高效液相色谱仪，测定色谱峰峰面积15，反复6 次。1.3数学模型替米考星含量计算公式：式中：X为样品溶液中替米考星的质量浓度（mg/L);C对照为对照品溶液中替米考星的质量浓度（mg/L)；A样品为样品溶液中替米考星的测定峰面积；V样品为样品溶液量取体积（mL）；A 对照为对照品溶液中替米考星的测定峰面积；V定容为样品溶液定容体积（mL）。1.4不确定度来源分析1.4.1不确定度来源设计根据实验方法和分析步骤，设计HPLC测定替米考星注射液中替米考星含量不确定度来源“鱼骨图”，具体见图1。校正因子方法重复性量取-定容样品溶液制备图1不确定度来源分析图1.4.2对照品重复测量引入不确定度的分析校正因子的相对标准不确定度测定：精确称取2 份对照品，平行配制对照品溶液，每份对照品溶液进样3针，连续进样6 针；校正因子为对照品峰面积与对照品溶液浓度的比值16 ，按照A类不确定度计算公式：U.=一（Srp为标准偏差；X为平均值；n为6），计算对照品校正引入的相对标准不确定度U（1)。XX/n对测定方法重复性的相对标准不确定度测定：精确称取1份对照品，配制对照品溶液，平行测定6 次，按照A类不确量度计算对照品重复测量引人的相对标准不确定度U,（2）。对照品重复测定引人的相对标准不确定度U,（3)计算公式：上海畜牧兽医通讯2 0 2 3年第5期X=CunXAxXVamA对照XV定容对照品重复测量对照品溶液制备纯度称量定容液相色谱仪测量仪器15实验研究式中:U,(1)为校正引入的相对标准不确定度;U,（2)为重复测量引入的相对标准不确定度。1.4.3对照品溶液制备引入不确定度的分析参照文献17 进行对照品溶液制备引入的相对标准不确定度分析。1.4.3.1对照品纯度引入相对标准不确定度的分析兽用替米考星注射液的纯度（P）=92.58%，药物说明书中未给出其浓度标准偏差，故不考虑纯度引人的不确定度，即对照品纯度引人的相对标准不确定度U,（P)为0。1.4.3.2对照品称量引入不确定度的分析评定实验所用电子天平的感量为0.0 1mg，其允许误差为土0.0 5mg，电子天平称量数据符合均匀分布，包含因子 k=/3,天平重复性引入的相对标准不确定度U,(m1)-0 5-5=0.0289；天平示值误差引的相V3对标准不确定度U.(m)=-0-=0 57 8.V3对照品称量引入的相对标准不确定度U,（m）计算公式：U,(ma)=VLU.(m)J+LU,(m)Fm3式中:U,(mi)为天平重复性引入的相对标准不确定度;U,（m 2）为天平示值误差引人的相对标准不确定度。1.4.3.3对照品定容引入不确定度的分析对照品定容引人的不确定度主要来源于容量瓶体积与温度效应。检测使用的容量瓶为A级50 mL容量瓶，该容量瓶最大误差为0.0 5mL；温度效应：根据国家计量检定规程规定18 ，容量瓶校准温度为2 0，假设实验室温度波动范围为士3，水体积膨胀系数为2.110-4mL/。根据均匀分布原则，分别计算容0.05量瓶体积和温度效应的不确定度。则50 mL容量瓶校准引入的相对标准不确定度U,（V)=V3X500.57810-;50 mL容量瓶体积与温度效应引人的相对标准不确定度U,(V.)-2.1X1%503V3X200.728X10-3。对照品定容引人的相对标准不确定度U,（V）计算公式：式中:U,(Vi)为50 mL容量瓶校准引入的相对标准不确定度;U,(V）为50 mL容量瓶体积与温度效应引人的相对标准不确定度。替米考星对照品溶液制备过程引入的不确定度U,（C)计算公式：式中:U,（P)为对照品纯度引入的相对标准不确定度;U,（m）为对照品称量引入的相对标准不确定度；U,（V）为对照品定容引人的相对标准不确定度。1.4.4样品溶液制备引入不确定度的分析参照文献19 进行样品溶液制备步骤引人不确定度的测定。1.4.4.1样品量取体积引入不确定度的分析样品量取体积引入的不确定度主要来源于移液管体积与温度效应。移液管体积不确定度计算时，A级5mL移液管最大容积误差为0.0 15mL，移液管校准温度为2 0，假设实验室温度波动范围为土3，水体上海畜牧兽医通讯2 0 2 3年第5期U,(3)=VU,(1)J+U,(2)U,(V,)=VU,(V)J+U,(V,)?U,(C)=VU,(P)+U,(m3)J+U,(V.)?16U=2XU,实验研究积膨胀系数为2.1X10-4mL/。根据均匀分布原则，分别计算移液管体积与温度效应的不确定度。5 mL 移液管校准引人的相对标准不确定度U,(V,)一%0 15V3X5效应引人的相对标准不确定度U,(V,)-2.1X1x5x3-0.91 10-V3X20样品量取体积引入的相对标准不确定度U,（V。）计算公式：U,(V)=VU,(V)+U,(V,)J式中：U,(V4)为5mL移液管校准引入的相对标准不确定度;U,(Vs）为5mL移液管体积与温度效应引人的相对标准不确定度。1.4.4.2样品定容引入不确定度的分析样品定容引人的不确定度主要来源于容量瓶体积与温度效应。50 mL容量瓶校准引人的相对标准不确定度U,（V，）和50 mL容量瓶体积与温度效应引人的相对标准不确定度U,（V）计算方法同1.4.3.3节，分别为0.57 8 10-3和0.7 2 8 X103。样品定容引入的相对标准不确定度U,（V。）计算公式：式中：U,(V,）为50 mL容量瓶校准引入的相对标准不确定度;U(V。）为50 mL容量瓶体积与温度效应引人的相对标准不确定度。因此，样品溶液制备过程引人的相对标准不确定度U,（V1o）计算公式：式中：U,（V。）为样品量取体积引人的相对标准不确定度；U,（V。）为样品定容引人的相对标准不确定度。1.4.5测量仪器引入不确定度的分析对购置的兽用替米考星注射液进行含量测定，连续完成3次重复测定，比较测定值与标示量；再结合HPLC检定证书上的测量相对标准偏差值（0.131%），按照均匀分布，计算液相色谱仪引入的相对标准不确定度U,(HPLC)=0.001 31,1.5计算合成不确定度及扩展不确定度将1.4.2 1.4.5中各不确定度分量合成，合成不确定度（U,)计算公式：U,=VU,(3)?+U,(C)?+U,(V10)+U,(HPLC)式中:U,（3)为对照品重复测量过程引人的相对标准不确定度;U,（C)为对照品溶液制备引入的相对标准不确定度;U(V1o)为样品溶液制备过程引人的相对标准不确定度;U,（H PLC)为液相色谱仪引人的相对标准不确定度。取置信度为9 5%时的扩展因子k=2,该方法相对扩展不确定度（U)计算公式：式中：U，为合成不确定度。2结果与分析2.1对照品重复测量引入的相对标准不确定度校正因子为46.0 2 士0.0 8，校正引入的相对标准不确定度U,（1)为0.7 12 X10-3（表1）。6次重复测定结果见表2。计算重复测量引入的相对标准不确定度U（2)为0.19910-。上海畜牧兽医通讯2 0 2 3年第5期=1.732X10-3;5mL移液管体积与温度U,(V,)=VU,(V,)+U,(V.)?U,(V10)=VU,(V.)J+U,(V,)J=0.757X10-3。V317.实验研究重复序号峰面积，177.492277.341377.246477.441577.421677.69512102.371102.325对照品重复测量过程引人的相对标准不确定度U,（3)为0.7 39X10-32.2对照品溶液制备引入的相对标准不确定度替米考星对照品称量引人的相对标准不确定度U,（m3）为0.7 31X10-3,对照品溶液制备过程引人的相对标准不确定度U,(C)为1.18 3X10-3。2.3样品溶液制备引入的不确定度5mL移液管量取样品引入的相对标准不确定度U,（V)为1.7 3410-3。样品定容过程引入的相对标准不确定度U,(V)为0.9 30 X10-3。综上，替米考星样品溶液制备过程引人的相对标准不确定度U,(Vio）为0.934X10-3。2.4HPLC法测定兽用替米考星注射液中替米考星含量的结果3次重复测定结果表明：注射液中替米考星测定值（表3)为标示量（10 1.9mg/L)的97.99%98.31%，符合相关要求。序号1232.5合成不确定度及扩展不确定度HPLC法测定替米考星注射液中替米考星含量的不确定度评定过程中，4个评定方向8 个分量所引人的相对标准不确定度见表4。评定方向对照品重复测量对照品溶液制备样品溶液制备测量仪器上海畜牧兽医通讯表1对照品校正因子测定参数校正因浓度校正因子1.682446.061.682445.971.682445.911.682846.021.682846.011.682846.17表2 对照品六次重复测定结果序号34102.328102.258表3HPLC测定兽用替米考星注射液含量替米考星含量/（mgL-1)99.85100.01100.18表4HPLC测定兽用替米考星注射液不确定度分量表校正因子方法重复性对照品纯度对照品称量定容体积量取体积定容体积液相色谱仪182023年第5期校正因子校正因子的相对子平均值标准偏差46.020.08平均值56102.402102.311标准偏差/%0.134分量标准不确定度0.712X10-3(单位:mg/L)相对标准偏差102.3330.05相对标准偏差/%0.131相对标准不确定度0.712X10-30.199X10-300.731X10-30.930X10-31.73410-30.930X1030.757X10-3实验研究由以上不确定度分量计算该方法的合成不确定度和相对扩展不确定度分别为1.8 4110-3和3.682X10-3。3讨论HPLC具有分析时间短、理论塔板数高、样品用量少等优点L201，但HPLC测定兽用替米考星注射液中替米考星含量的实验操作步骤相对复杂，因此，需引入不确定度来评价测量结果的准确度，以提高检测数据的质量2 1。为了提高HPLC测定兽用替米考星注射液中替米考星含量的精确度，降低测定过程中的不确定度，本研究依据相关标准规定的测量过程和数学模型，从对照品重复测量、对照品溶液制备、样品溶液制备以及测量仪器4个方向，对引入的不确定度进行评定，分析各分量的不确定度贡献。结果显示：不确定度来源分量中，引入不确定度占比较大的有样品溶液量取、样品溶液定容以及对照品溶液定容，不确定度分别为1.73410-3、0.930 10-3、0.930 10-3；其中，样品溶液量取体积是该测定过程中引起实验结果不确定度的主要来源。因此，为了降低人为因素造成的检测误差，在HPLC测定兽用替米考星注射液中替米考星含量操作过程中，可针对性地采取预防或改进措施，降低样品溶液量取体积引入的不确定度。上海畜牧兽医通讯2 0 2 3年第5期参考文献1龚兰，栾枫婷，温天锐，等固相萃取净化/高效液相色谱-串联质谱法测定饲料中7 种大环内酯类药物含量J分析测试学报，2 0 2 0，39（7)：8 7 4-8 8 8.2周浩替米考星长效注射液的研制D开封：河南大学，2 0 14.3李涛，王策，徐兆安，等基于分散固相萃取-超高效液相色谱串联质谱法测定沉积物中大环内酯类抗生素J环境化学，2 0 2 2，41(1)：2 31-2 40.4J MANOEL J W,PRIMIERI G B,BUENO L M,et al.Determination of empagliflozin in the presence of its organicimpurities and identification of two degradation products using UHPLC-QTOF/MSEJJ.Microchemical Journal,2021,161:105795.5营娇龙，秦晓鹏，郎杭，等。超高效液相色谱-串联质谱法同时测定水体中37 种典型抗生素J.岩矿测试，2 0 2 2，41(3）：394-403.6 杜国辉，姜海芳，焦燕，等超高效液相色谱-串联质谱法测定配合饲料中大环内酯类药物J饲料研究，2 0 2 1，44(16)：104-107.7 马康，李小佳，崔萌萌，等高效液相色谱法测定葡萄酒中苋菜红的不确定度评定J计量学报，2 0 15，36（1：10 2-10 6.8肖亭，王晨，姚尚辰，等测量结果不确定度评定在我国药物分析领域中的应用 药物分析杂志，2 0 2 1，41（11）：1851-1859.9 中国合格评定国家认可委员会CNAS一GL06化学分析中不确定度的评估指南Z2 0 0 6.10 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，中国国家标准化管理委员会.测量不确定度评定和表示：GB/T27418一2017S.北京：中国标准出版社，2 0 18.11臧慕文，柯瑞华成分分析中的数理统计及不确定度评定概要M.北京：中国质检出版社，2 0 12.12牛蓉，秦丽波，张梦丽，等超高效液相色谱-串联质谱法同时测定饮用水中林可霉素、替米考星和泰乐菌素残留J.食品安全质量检测学报，2 0 2 1，12（2 0）：8 150 8 15513吴子静，梁大虎，杨斌，等高效液相色谱-串联质谱法同时测定五味子糖浆中7 种木脂素的含量J安徽医药，2 0 2 0，24(5):869-873.14徐敦明，曾三妹，柳训才，等固相萃取-高效液相色谱-串联质谱法同时测定燕窝中45种激素及其水平调查J，色谱，2022，40(5):42 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