D-半乳糖诱导青年树鼩卵巢衰老.pdf

第 40 卷第 5 期2023 年 10 月实验动物科学LABORATORY ANIMAL SCIENCEVol.40No.5October 2023论著收稿日期:2023-03-06基金项目:全军实验动物专项重点项目(SYDW202019);军队实验动物专项科研课题青年基金(SYDW_KY202118)作者简介:田川(1994),男,研究方向:干细胞抗衰老研究.E-mail:2896981795 通信作者:潘兴华(1963),男,主任医师,研究方向:干细胞抗衰老研究.E-mail:xinghuapan D-半乳糖诱导青年树鼩卵巢衰老田 川 叶 丽 赵晓娟 朱向情赵 晶 阮光萍 潘兴华(中国人民解放军联勤保障部队第 920 医院基础医学实验室,云南省细胞治疗技术转化医学重点实验室,干细胞与免疫细胞生物医药技术国家地方联合工程实验室,昆明650032)摘要:目的通过 D-半乳糖诱导法建立树鼩衰老模型,为卵巢衰老的研究提供模型参考方案。方法(1)筛选青年树鼩 8 只,随机分为对照组(n=4)与模型组(n=4)。(2)模型组按 8 g/kg 的剂量颈背部皮下注射 D-半乳糖 5 个月,采集卵巢,液氮冻存以及 4%多聚甲醛固定。(3)HE 染色观测卵巢组织结构;免疫组织化学染色观测衰老相关标志分子蛋白表达;Ki67 染色观测增殖活性;Tunel 染色观测细胞凋亡。结果(1)对照组树鼩卵巢组织髓质与间质界限明显,细胞排列整齐,可见原始、初级、次级和成熟卵泡,有少量闭锁卵泡;模型组树鼩卵巢组织结构散乱,局部只见原始、初级卵泡,有大量闭锁卵泡。(2)模型组衰老相关标志分子 P53、P21、P16 蛋白表达水平明显高于对照组。(3)模型组细胞增殖活性显著低于对照组。(4)模型组卵巢细胞凋亡率显著高于对照组。结论D-半乳糖可诱导卵巢组织结构散乱,卵泡闭锁,使细胞增殖活性减弱,凋亡率增加。关键词:树鼩;卵巢衰老;卵泡;细胞凋亡;衰老标志分子中图分类号:Q95-3文献标志码:A文章编号:1006-6179(2023)05-0012-07DOI:10.3969/j.issn.1006-6179.2023.05.003D-galactose Induced Young Tree Shrews Ovarian SenescenceTIAN Chuan,YE Li,ZHAO Xiaojuan,ZHU Xiangqing,ZHAO Jing,RUAN Guangping,PAN Xinghua(the Basic Medical Laboratory of 920th Hospital of Joint Logistics Support Force of PLA,the Transfer Medicine Key Laboratory ofCell Therapy Technology of Yunnan Province,the Integrated Engineering Laboratory of Cell BiologicalMedicine of State and Regions,Kunming 650032,China)Abstract:ObjectiveEstablishing the aging model of tree shrew induced by D-galactose and providing a model reference scheme for the study of ovarian senescence.Method(1)eight young tree shrews were selected and randomly divided into control group(n=4)and model group(n=4).(2)the model group was subcutaneously injected with D-galactose on the back of neck according to the dose of 8 g/kg for 5 months,and the ovaries were collected,frozen in liquid nitrogen and fixed with 4%paraformaldehyde.(3)the tissue structure of ovary was observed by HE staining,the expression of aging-related molecular proteins was observed by immunohistochemical staining,cell proliferation activity was observed by Ki67 staining,and apoptosis was observed by Tunel staining.Result(1)the boundary between medulla and stroma in the ovarian tissue of tree shrew in the control group was obvious,and the cells were arranged neatly,showing primitive,primary,secondary and mature follicles with a small number of atretic follicles,while in the model group,the ovarian tissue structure of tree shrew was scattered,only primitive and primary follicles were seen locally,and there were a large number of atretic follicles.(2)第 5 期田川等:D-半乳糖诱导青年树鼩卵巢衰老 the expression level of aging-related marker molecules p53,P21 and P16 in the model group was significantly higher than that in the control group.(3)the activity of cell proliferation in the model group was significantly lower than that in the control group.(4)the apoptosis rate of ovarian cells in the model group was significantly higher than that in the control group.ConclusionD-galactose can make ovarian tissue structure scattered,follicle atresia,weaken cell proliferation activity,and increase apoptosis rate.Key words:Tree shrew;ovarian senescence;follicle;apoptosis;aging marker molecule卵巢作为衰老最敏感的器官之一,可随年龄增长而自然衰老,也可因疾病、感染、中毒等导致卵巢衰老,引起女性内分泌紊乱和全身组织器官结构退变以及功能衰退,导致女性不孕,并使卵巢衰老相关疾病高发1。卵巢衰老是一个长期而复杂的过程,其与神经、内分泌、免疫、氧化应激、遗传易感、线粒体受损等因素有关,然而,目前多因素导致卵巢衰老的分子机制并不完全清楚2。可见,一个合适的模式生物将有助于研究人员探索卵巢功能下降的危险因素和阐明其分子机制,并有助于预防或延缓卵巢衰老过程3。而树鼩的遗传、解剖、生理、神经、免疫等与人类相对接近,比现有的中小型实验动物更接近于人类,比猕猴等灵长类实验动物成本低,用于实验研究的结果对人类有较大参考价值4-5。此外,树鼩的体质量、体积均与大、小鼠相接近,实验操作方便,易于大规模实验研究6。因此,树鼩卵巢衰老模型是研究卵巢衰老的理想模型。D-半乳糖(D-galactose,D-gal)作为一种还原糖,可通过半乳糖激酶和半乳糖 1 磷酸尿苷转移酶分解为葡萄糖代谢,使活性氧过度累积,破坏基因组的稳定性,引起氧化应激损伤,导致机体代谢紊乱、抗氧化应激系统失衡7。此外,D-gal 可与蛋白质、氨基酸等游离基团发生反应,形成晚期糖基化终产物(advanced glycation end products,AGE),AGE 通过与晚期糖基化终产物受体和其他受体结合,在卵巢颗粒、叶黄素和单核细胞等表面积聚,促进炎性反应,加速卵巢衰老。因此,D-gal 被广 泛用于抗 衰老药物开发 的动 物 模 型 研 究。基 于 以 上 研 究 结果,本研究以树鼩来作为卵巢衰老的研究对象,利用 D-gal 诱导法,通过观测卵巢组织结构、增殖活性、细胞凋亡和衰老相关标志分子等指标,评价、建立卵巢衰老模型,可为卵巢衰老的研究提供技术参考方案。1材料和方法1.1材料1.1.1实验动物:SPF 级雌性青年树鼩(n=8)购买自中国科学院昆明动物研究所,实验动物生产许可证号【SCXK(滇)K2017-0003】,平均年龄 3.5 岁,体质量 130 160 g,饲养于中国人民解放军联勤保障部队第 920 医院动物实验室,其环境清洁、卫生,达到动 物 饲 养 环 境 标 准,实 验 动 物 使 用 许 可 证 号【SYXK(军)2017-0051】,实验动物伦理审批号为:伦审 2021-055(科)-01。1.1.2主要实验试剂与器材:通用型中性组织固定液、HE染 液(Servicebio)、Masson 染 液(均Servicebio);Tunel 试剂盒(Vazyme);无水乙醇(天津市风船化学试剂科技有限公司);中性树胶(国药集团化学试剂有限公司);IX70-121 倒置相差显微镜(Olympus);冰 冻 切 片 机(Thermo);D-gal(Sigme,G0750-50G)。1.2方法1.2.1D-gal 溶液配制及颈背部皮下给药:电子天平称取适量的 D-gal 粉末,倒入 500 mL 烧杯中加入无菌注射用水,用磁力搅拌器搅拌至透明,并配制成30%的 D-gal 溶液,于 50 mL 无菌离心管中备用。8 只青年树鼩经 1 周适应性饲养、观察无异样后,随机分为对照组(n=4)与模型组(n=4),D-gal 溶液按 2.5 mL/g 的剂量,给予模型组树鼩颈背部皮下注射,每天 1 次,连续给药 5 个月。1.2.2HE 染 色:石 蜡 切 片 依 次 放 入 二 甲 苯 20 min、二甲苯 20 min、无水乙醇 5 min、无水乙醇 5 min、75%乙醇 5 min,加双蒸水冲洗 3 次。苏木精染液染 4 min,双蒸水冲洗 3 次,分化液处理5 min,加双蒸水冲洗 3 次,返蓝液处理 5 min,加双蒸水冲洗 3 次。切片依次放入 85%和 95%乙醇脱水 5 min,伊红染液处理 5 min。切片依次放入无水31 实验动物科学40 卷乙醇 I 5 min、无水乙醇 II 5 min、无水乙醇 5 min、二甲苯 5 min、二甲苯 5 min 透明。中性树胶封片。荧光倒置显微镜下观测、拍照。1.2.3Ki67 染色:切片依次放入环保型脱蜡液10 min、环保型脱蜡液10 min、环保型脱蜡液 10 min、无水乙醇5 min、无水乙醇5 min、无水乙醇 5 min、ddH2O2冲洗。抗原修复,PBS(PH7.4)洗涤 3 次,每次 5 min。组织周围画圈,加血清封闭30 min。加一抗(Ki67,1 200),湿盒内 4 孵育过夜。PBS 洗 涤 3 次,每 次 5 min。加 对 应 的 二 抗(CY3 山羊抗兔,1 200),避光室温孵育 50 min。PBS 洗涤 3 次,每次 5 min,加 DAPI 染液,避光室温孵育 10 min。PBS 洗涤 3 次,每次 5 min,加自发荧光淬灭剂 B 液 5 min,ddH2O2冲洗 10 min。加抗荧光淬灭封片剂封片。采集图像。1.2.4Tunel 染色:切片 37 烘箱烘烤 15 min,4%多聚甲醛固定 30 min,PBS(pH 7.4)洗涤 3 次,每次5 min。组织周围画圈并加蛋白酶 K 工作液,37 温箱孵育 25 min。PBS 洗涤 3 次,每次 5 min。加破膜液室温孵育 20 min,PBS 洗涤 3 次,每次 5 min。加 1平衡缓冲液室温孵育 10 min。加重组末端脱氧核糖核苷酸转移酶、BrightRed Labeling Mix、5平衡缓冲液和 ddH2O2的混合液,37 孵育 2 h。PBS洗涤 3 次,每次 5 min。加 DAPI 染液室温避光孵育10 min。PBS 洗涤 3 次,每次 5 min。加抗荧光淬灭封片剂进行封片。荧光倒置显微镜下观测、拍照。1.2.5免疫组织化学染色:切片依次放入二甲苯 20 min、二甲苯 20 min、无水乙醇 5 min、无水乙醇 5 min、75%乙醇 5 min 后,双蒸水冲洗 3次。EDTA 抗原修复液处理 5 min,中火 8 min、停火8 min、低火 7 min。PBS 洗涤 3 次,每次 5 min。组织周围滴加 BSA 孵育 30 min,加一抗(P53/21/16)4 过夜,PBS 洗涤 3 次后,每次 5 min。二抗孵育60 min。抗荧光淬灭封片剂封片。DAPI 染液孵育10 min。PBS 洗涤 3 次,每次 5 min,再用抗荧光淬灭封 片 剂 封 片。荧 光 倒 置 显 微 镜 下 观 察 并 采 集图像。1.3统计学分析所得数据通过 SPSS 统计分析软件进行单因素方差分析。统计结果以均数标准差(xs)表示,两组间差异采用独立样本 t 检验,多组间差异采用单因素方差分析,以 P0.05 为差异有统计学意义。2结果2.1卵巢组织结构变化对照组树鼩卵巢组织细胞排列整齐,间质和髓质界限明显,可见原始卵泡(黑色箭头)、初级卵泡(蓝色箭头)、次级卵泡(橙、绿色箭头)、成熟卵泡(紫色箭头),并有可见少量闭锁卵泡(深蓝色箭头)。模型组树鼩卵巢组织细胞排列散乱,间质和髓质界限模糊,局部只见原始卵泡(黑色箭头)、初级卵泡(蓝色箭头)、次级卵泡(橙色箭头)且其数量显著低于对照组树鼩,还可见大量闭锁卵泡(深蓝色箭头)(图 1)。注:黑色箭头:原始卵泡;蓝色箭头:初级卵泡;橙、绿色箭头:次级卵泡;紫色箭头:成熟卵泡;深蓝色箭头:闭锁卵泡。Note:Black arrow:primitive follicles;blue arrow:primary follicles;Orange,green arrow:secondary follicles;purple arrow:mature follicles;dark blue arrow:atretic follicles.图 1卵巢组织 HE 染色Fig.1HE staining of ovarian tissue2.2P53、P21、P16 蛋白表达P53、P21、P16 标记的细胞,蓝色为细胞核。结果显示,模型组可见大量 P53、P21、P16 标记的棕褐色细胞,而对照组局部只见少量棕褐色细胞。统计学分析结果显示,模型组 P53、P21、P16 标记的阳性细胞率显著高于对照组,表明模型组卵巢组织中P53、P21、P16 的蛋白表达水平均显著高于对照组(图 2)。2.3细胞分裂增殖Ki67 标记的细胞,蓝色为细胞核被。Ki67 染色结果显示,对照组成熟卵泡中可见大量红色荧光,而模型组局部只见少量红色荧光,统计学分析结果表明,对照组 Ki67 标记的阳性细胞率显著高于模型组(图 3)。2.4细胞凋亡红色为凋亡的细胞,蓝色为细胞核。结果显示,对照组树鼩卵巢局部只见少量红色荧光,而经 D-gal背颈部注射 5 个月后可见有大量红色荧光出现,表明对照组树鼩卵巢仅有少量细胞凋亡,模型组树鼩41第 5 期田川等:D-半乳糖诱导青年树鼩卵巢衰老 P0.01,P0.001图 2卵巢组织免疫组织化学染色(xs,n=4)Fig.2Immunohistochemical staining of ovarian tissue(xs,n=4)卵巢有大量细胞凋亡(图 4)。3讨论目前,多种因素导致卵巢衰老的女性人群不断增多,而针对卵巢衰老的治疗方法多是延缓疾病发展,并不能从根本上解决卵巢衰老诱发的内分泌紊乱、多组织器官结构衰退和不孕等问题,且会伴随相关并发症的发生,如激素替代治疗会引起乳腺癌、血栓和卵巢癌等病发,究其原因部分是因为引起卵巢衰老关键的细胞和分子调控机制尚不明确。获得与人类更为接近的卵巢衰老模型是解析卵巢衰老发生发展的关键要素之一。因此,树鼩属于非人类灵长类动物,其遗传和生理生化等与人类相近,通过 D-gal 诱导法建立树鼩卵巢衰老模型,获得的研究结果将对女性卵巢衰老治疗具有更重要的参考价值。卵巢衰老被认为是以卵泡数量逐渐减少为主导的,这与卵母细胞的质量下降相一致8。卵巢衰老的典型特征是组织结构破坏、卵母细胞数量减少且质量降低、卵泡闭锁。衰老作为一个渐进的、不可逆转的病理生理过程,表现为组织和细胞功能下降,各种与衰老相关的疾病风险显著增加9。本研究的HE 结果显示,青年健康雌性树鼩经 D-gal 溶液行颈背部注射 5 个月后,卵巢组织细胞排列散乱,局部只见少量原始卵泡和初级卵泡,并有大量闭锁卵泡。在小鼠模型上,通过连续皮下注射 D-gal 约 6 周已被证明可以加速大脑、肾、肝衰老,降低血浆中抗苗勒氏激素(AMH),诱导卵巢衰老10。这和本研究的实验结果相一致,提示 D-gal 溶液经颈背部给药可使青年树鼩卵巢组织结构破坏、卵泡闭锁。激活 P53-P21-和 P16 依赖的 DNA 损伤反应可减弱细胞的增殖能力,加速细胞衰老。研究表明,肿瘤蛋白 P53 可通过调节细胞周期停滞和细胞凋亡来决定 DNA 损伤检查点反应的结果,故在 DNA 损伤反应中起核心作用,包括对细胞衰老、基因组不稳定、线粒体功能障碍和代谢途径改变等调控方面扮51 实验动物科学40 卷P0.001图 3卵巢组织 Ki67 染色(xs,n=4)Fig.3Ki67 staining of ovarian tissue(xs,n=4)演重要角色11。P21 作为细胞周期进程的关键负调控因子,它可以与细胞周期蛋白依赖性激酶和特定的细胞周期蛋白形成复合物,在特定阶段诱导细胞周期阻滞,稳定 P21 蛋白表达,可导致细胞周期阻滞在 G1 期12。仅 P21 就足以驱动细胞衰老程序,包括转录组改变、DNA 损伤、线粒体功能障碍和衰老相关的分泌表型13。P16 细胞周期调节因子是最经典的衰老生物标志物之一,因为它在胚胎发育早期被抑制,在衰老过程中逐渐被激活,在细胞衰老和干细胞动力学等导致衰老的关键细胞命运决定中起着至关重要的作用14。P16 抑癌基因在衰老组织中积聚,是细胞衰老的生物标志物,其在体内限制干细胞的功能15。本实验中,与对照组相比较,模型组卵巢组织中 P53、P21、P16 的蛋白表达水平均显著升高,提示了青年雌性健康树鼩经 D-gal 溶液行背 颈 部 给 药 5 个 月,可 诱 导 卵 巢 组 织 细 胞衰老。Ki67 是细胞周期进程和进入静止状态以来的时间的分级标记,作为一种和细胞周期相关的蛋白质,可间接反映细胞增殖活性16,Ki67 染色在临床上被广泛用作增殖指标。因此,我们利用 Ki67 染色来观测经 D-gal 干预后细胞的增殖活性,结果显示,对照组细胞增殖活性显著高于模型组。有研究在单细胞水平观测内源性调控下 Ki67 水平随时间的变化,发现 Ki67 的积聚只发生在 S、G2 和 M 期16。卵母细胞凋亡导致卵巢功能不全17,颗粒细胞凋亡会导致卵泡闭锁18。卵巢卵泡池的大小受细胞凋亡和自噬的调节,前者是导致生理性下降的原因,后者在青春期前的生理性卵泡池缩小中起主要作用19。也有研究表明,衰老的卵泡间质细胞产生的与衰老相关的分泌表型相关的细胞分泌趋化因子配体,可能通过促进颗粒细胞凋亡而在卵巢衰老过程中损害卵泡的发育和成熟20。而本实验结果显示,青年健康树鼩经 D-gal 溶液行颈背部注射给药 5个月后,TUNAL 染色结果显示卵巢组织细胞凋亡率明显增加,且模型组树鼩卵巢组织可见大量的闭锁61第 5 期田川等:D-半乳糖诱导青年树鼩卵巢衰老 P0.01图 4卵巢组织 Tunel 染色(xs,n=4)Fig.4Tunel staining of ovarian tissue(xs,n=4)卵泡。有研究发现21,在 D-半乳糖诱导小鼠衰老的转录与代谢谱研究中,D-半乳糖对衰老的影响可能与糖和脂代谢紊乱、氧化损伤、晚期糖基化终末产物的积累和细胞凋亡显著相关21。这些研究结果提示了 D-gal 可诱导卵巢衰老,而这可能是由于卵巢细胞凋亡增加所导致的。综上所述,可见 D-半乳糖按 8 g/kg 的剂量给予青年树鼩颈背部皮下注射给药 5 个月,可使卵巢组织结构散乱,衰老标志分子 P53、P21、P16 蛋白表达上调,使细胞分裂增殖能力减弱,细胞凋亡率增加,从而诱导卵巢衰老。参 考 文 献 1 RUTH K S,DAY F R,HUSSAIN J,et al.Genetic insights into biological mechanisms governing human ovarian ageing J.Nature,2021,596(7872):393-397.2 LI C J,LIN L T,TSAIH W,et al.The molecular regulation in the pathophysiology in ovarian aging J.Aging Dis,2021,12(3):934-949.3 LU H,MA L,ZHANG Y,et al.Current animal model systems for ovarian aging research J.Aging Dis,2022,13(4):1183-1195.4 XU L,FAN Y,JIANG X L,et al.Molecular evidence on the phylogenetic position of tree shrews J.Dongwuxue Yanjiu,2013,34(2):70-76.5 LI B,ZHANG R P,LI J T,et al.Measurement and analysis of anatomical parameter values in tree shrews J.Dongwuxue Yanjiu,2013,34(2):132-138.6 XU L,CHEN S Y,NIE W H,et al.Evaluating the phylogenetic position of Chinese tree shrew(Tupaia belangeri chinensis)based on complete mitochondrial genome:implication for using tree shrew as an alternative experimental animal to primates in biomedical research J.J Genet Genomics,2012,39(3):131-137.7 AZMAN K F,ZAKARIA R.D-Galactose-induced accelerated aging model:an overview J.Biogerontology,2019,20(6):763-782.8 LI Q,GENG X,ZHENG W,et al.Current understanding of ovarian agingJ.Sci China Life Sci,2012,55(8):659-669.9 GUO J,HUANG X,DOU L,et al.Aging and aging-related diseases:from molecular mechanisms to interventions and treatmentsJ.Signal Transduct Target Ther,2022,7(1):391.71 实验动物科学40 卷10PARK J H,Choi T S.Polycystic ovary syndrome(PCOS)-like phenotypes in the d-galactose-induced aging mouse model J.Biochem Biophys Res Commun,2012,427(4):701-704.11VADDAVALLI P L,SCHUMACHER B.The p53 network:cellular and systemic DNA damage responses in cancer and agingJ.Trends Genet,2022,38(6):598-612.12JUNG M,KIM W,CHO J W,et al.Poly-ADP ribosylation of p21 by tankyrases promotes p21 degradation and regulates cell cycle progressionJ.Biochem J,2022,479(22):2379-2394.13ENGLUND D A,JOLLIFFE A,AVERSA Z,et al.P21 induces a senescence program and skeletal muscle dysfunction J.Mol Metab,2023,67:101652.14MARTIN N,BEACH D,GIL J.Ageing as developmental decay:insights from p16(INK4a.)J.Trends Mol Med,2014,20(12):667-674.15WANG Y,SHARPLESS N,CHANG S.p16(INK4a)protects against dysfunctional telomere-induced ATR-dependent DNA damage responses J.J Clin Invest,2013,123(10):4489-501.16AUNG T N,ACS B,WARRELL J,et al.A new tool for technical standardization of the Ki67 immunohistochemical assayJ.Mod Pathol,2021,34(7):1261-1270.17HUNG C,ZHAO S,YANG Y,et al.TP63 gain-of-function mutations cause premature ovarian insufficiency by inducing oocyte apoptosisJ.J Clin Invest,2023,133(5):e162315.18LIU Z,LI F,XUE J,et al.Esculentoside A rescues granulosa cell apoptosis and folliculogenesis in mice with premature ovarian failureJ.Aging(Albany NY),2020,12(17):16951-16962.19CACCIOTTOLA L,CAMBONI A,CERNOGORAZ 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