DSPE-mPEG2000修饰荷叶碱脂质体制备及其体内药动学研究.pdf

制 剂 修饰荷叶碱脂质体制备及其体内药动学研究李燕红，张春燕，陈 乾，（黄河科技学院，河南 郑州；黄河科技学院附属医院，河南 郑州；河南中医药大学第二附属医院，河南 郑州）收稿日期：基金项目：国家自然科学基金（）作者简介：李燕红（），女，硕士，讲师，主治中医师，研究方向为中医药。：（），：通信作者：陈乾（），男，博士，主治医师，研究方向为中医药开发。：（），：摘要：目的 制备二硬脂酰磷脂酰乙醇胺聚乙二醇 （）修饰荷叶碱脂质体，并考察其体内药动学。方法 薄膜超声法制备脂质体。以磷脂酰胆碱与胆固醇比例、脂药比、用量、水化温度、超声时间为影响因素，单因素试验优化处方，测定包封率、载药量、粒径、电位、体外释药。只大鼠随机分为 组，分别灌胃给予荷叶碱原料药、不含 荷叶碱脂质体、修饰荷叶碱脂质体的 混悬液（），于、采血，法测定荷叶碱血药浓度，计算主要药动学参数。结果最佳处方为荷叶碱用量 ，磷脂酰胆碱与胆固醇比例 ，脂药比 ，用量 ，水化温度 ，超声时间 ，平均包封率为 ，载药量为 ，粒径为 ，为 ，电位为 。修饰后，荷叶碱在人工胃液、人工肠液中 内累积释放度分别为 、。与原料药比较，脂质体、延长（），、升高（），相对生物利用度增加至 倍。结论 修饰脂质体可促进荷叶碱口服吸收。关键词：荷叶碱；脂质体；二硬脂酰磷脂酰乙醇胺聚乙二醇 （）；制备；体内药动学；薄膜超声法；中图分类号：文献标志码：文章编号：（）：（），（，；，；，）：（），（），年 月第 卷 第 期中 成 药 ，（），（），）：；（）；荷叶碱是一种类白色粉末，为荷叶主要成分之一，属于阿朴啡型生物碱类化合物，具有调节脂质代谢、抗氧化、降血糖、抗菌、抗肿瘤等多种活性，存在开发成新药的潜力。但该成分在水中的溶解度仅为 ，透膜性差，属于生物药剂学分类系统中的药物；在胃肠道中容易被破坏，体内稳定性差；半衰期短，口服吸收生物利用度仅为 ，故不利于临床应用。脂质体结构类似于生物膜囊泡，其主要材料磷脂、胆固醇均有较高的生物相容性，安全性理想，并且存在疏水的磷脂双层膜和亲水的空腔，可包载疏水或亲水性药物，从而促进后者体内吸收，提高口服生物利用度及疗效。本实验制备二硬脂酰磷脂酰乙醇胺聚乙二醇 （）修饰荷叶碱脂质体，并进行体内药动学研究，以期为相关新制剂开发提供参考，也为后续注射药动学、抗糖尿病药效学等方面的研究奠定基础。材料 仪器 安捷伦 型高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；型三重四级杆质谱仪（美国 公司）；型激光粒度仪（英国马尔文仪器有限公司）；型电子分析天平（上海仪天科学仪器有限公司）；型超声仪（张家港市海航超声电器有限公司）；型恒温水浴锅（江苏新春兰科学仪器有限公司）；型磁力搅拌器（常州市亿能实验仪器厂）；型氮气吹扫仪（上海继谱电子科技有限公司）；型旋转蒸发仪（德国 公司）；型离心机（德国 公司）。试 剂 与 药 物 荷 叶 碱 原 料 药（批 号，纯度 ，四川维克奇生物科技有限公司）。荷叶碱对照品（批号，纯度 ，中国食品药品检定研究院）；罂粟碱对照品（批号，纯度 ，上海士锋生物科技有限公司）；大豆磷脂酰胆碱对照品（批号，纯度 ，上海源叶生物科技有限公司）。胆固醇（批号，上海谱振生物科技有限公司）；（批号，上海艾 韦 特 医 药 科 技 有 限 公 司）。蔗 糖（批 号，湖南九典制药股份有限公司）。动物 大鼠，清洁级，雌雄兼具，体质量，由河南省动物实验中心提供，动物生产许可证号 （豫）。方法与结果 荷叶碱含量测定 采用 法。色谱条件 色谱柱（，）；流动相甲醇 三乙胺（）；体积流量 ；柱温 ；检测波长 。线性关系考察取 荷叶碱对照品至 量瓶中，甲醇超声溶解后定容至刻度，摇匀，得 对照品溶液，流动相依次稀释至、，在“”项色谱条件下进样测定。以对照品质量浓度为横坐标（），峰面积为纵坐标（）进行回归，得方程为 （），在 范围内线性关系良好。供试品溶液制备 取 脂质体混悬液至 量瓶中，加 甲醇超声（、）处理 ，甲醇定容至刻度，微孔滤膜过滤，取续滤液 至 量瓶中，流动相定容，即得。方法学考察取供试品溶液适量，在温度、相对湿度 条件下于、年 月第 卷 第 期中 成 药 在“”项色谱条件下进样测定，测得荷叶碱峰面积 为 ，表明该方法稳定性良好。按“”项下方法制备 份供试品溶液，在“”项色谱条件下进样测定，测得荷叶碱含量 为 ，表明该方法重复性良好。取、对照品溶液适量，在“”项色谱条件下各进样测定 次，测得峰面积 分别为 、，表明仪器精密度良好。取 脂质体混悬液共 份，分为低、中、高 组，分别加入 对照品溶液、，按“”项下方法制备供试品溶液，在“”项色谱条件下进样测定，测得平均加样回收率分别为 、，分别为 、。脂质体制备参考文献 报道，取磷脂酰胆碱、胆固醇、适量，溶于 氯仿乙醇混合溶液（，超声处理 混匀）中；另取 荷叶碱，置于 无水乙醇中，加热溶解，将它们合并后置于圆底烧瓶中，、减压旋蒸，得到均匀薄膜，加入 缓冲液（），恒温水化 ，超声（）处理，过 微孔滤膜，即得，加入 蔗糖，在 下预冻，冷冻干燥，得到 冻 干 粉，密 封。同 法 制 备 不 含 的脂质体。指标测定 取 脂质体混悬液，置于超滤管（截 留 相 对 分 子 质 量 ）中，、离心 ，取续滤液，在“”项色谱条件下进样测定，计算游离药量；取 脂质体混悬液至 量瓶中，加 甲醇超声（、）处理 ，甲醇定容至刻度，微孔滤膜过滤，取续滤液 至 量瓶中，流动相定容，在“”项色谱条件下进样测定，计算荷叶碱总量，采用透析法测定包封率、载药量，公式分别为包封率 （）、载药量 （），其中 为荷叶碱、脂质、总量。另取脂质体混悬液适量，蒸馏水稀释 倍后测定粒径、电位。单因素试验 磷脂酰胆碱与胆固醇比例保持荷叶碱用量 、脂药比：（脂质总量为磷脂酰胆碱、胆固醇总量）、用量 、水化温度 、超声时间 不变，考察磷脂酰胆碱与胆固醇比例对包封率的影响，结果见图。由此可知，包封率随着磷脂酰胆碱在脂质总量中比例的增加先升后降，可能是由于胆固醇用量过多时可能与药物竞争磷脂双分子层空间，导致包封率降低；当胆固醇用量不足时，脂质体稳定性差而容易泄露，也会使包封率降低，故选择磷脂酰胆碱与胆固醇比例为 。图 磷脂酰胆碱与胆固醇比例对包封率的影响（）（）脂药比保持荷叶碱用量 、磷脂酰胆碱与胆固醇比例 、用量、水化温度 、超声时间 不变，考察脂药比对包封率的影响，结果见图。由此可知，包封率随着脂质用量增加逐渐升高，当脂药比为 时达到最大值，而再进一步增加时无明显变化，并且也会影响制剂载药量，故选择脂药比为 。图 脂药比对包封率的影响（）（）用量保持荷叶碱用量、磷脂酰胆碱与胆固醇比例 、脂药比 、水化温度 、超声时间 不变，考察 用量对包封率的影响，结果见图。由此可知，包封率随着 用量增加逐渐升高，为 时达到最大值，而再 年 月第 卷 第 期中 成 药 进 一 步 增 加 时 无 明 显 变 化，故 选 择 用量为 。图 用量对包封率的影响（）（）水化温度保持荷叶碱用量 、磷脂酰胆碱与胆固醇比例 、脂药比 、用量 、超声时间 不变，考察水化温度对包封率的影响，结果见图。由此可知，包封率随着水化温度增加先升后降，可能是由于水化温度较低时达不到磷脂酰胆碱相变温度，脂质膜吸水溶胀性较差，不利于包裹药物；但磷脂酰胆碱热稳定性较差，水化温度过高时会影响脂质体稳定性，导致包封率降低，故选择水化温度为 。图 水化温度对包封率的影响（）（）超声时间保持荷叶碱用量 、磷脂酰胆碱与胆固醇比例 、脂药比 、用量 、水化温度 不变，考察超声时间对包封率的影响，结果见图。由此可知，超声时间越长，包封率下降程度越大，表明时间过长可能会对脂质体有一定破坏作用，使包封率降低，并且在 时较高，故选择超声时间为。验证试验根据“”项下结果，确定最图 超声时间对包封率的影响（）（）优工艺为荷叶碱用量 ，磷脂酰胆碱与胆固醇比例 ，脂药比 ，用量，水化温度 ，超声时间 。按上述优化工艺制备 批脂质体混悬液，测得其平均包封率为 ，载药 量为 ，粒径为 ，为 ，电位为 。再将其制成冻干粉，蒸馏水复溶后测得平均包封率为 ，载药量为 ，粒径为 （图），为 ，电位为 （图）。图 修饰荷叶碱脂质体粒径分布 （）图 修饰荷叶碱脂质体 电位 （）再制备不含 的脂质体，测得其平均包封率为 ，载药量为 ，粒径为 ，为 ，电位为。其 冻 干 粉 复 溶 后，测 得 平 均 包 封 率 为 ，载药量为 。平均粒径为 ，为 ，电位为 。体外释药研究 取原料药、不含 年 月第 卷 第 期中 成 药 脂质体、修饰脂质体冻干粉适量（荷叶碱含量均为 ），加入 人工胃液（含胃蛋白酶）或人工肠液（含胰蛋白酶）制成混悬液，置于透析袋中（重均分子量 ）。选择 人工胃液（含 吐温）或人工肠液（含 吐温）作为释放介质，设定转速为 ，释药介质温度为 ，于、各取样，并补加空白释药介质，离心 ，在“”项色谱条件下进样测定，结果见图。由此可知，原料药在人工胃液、人工肠液中 内累积释放度分别为 、，而 修饰后分别提高至 、。图 模拟胃液中荷叶碱体外释药曲线（）（）图 模拟肠液中荷叶碱体外释药曲线（）（）体内药动学研究 分析条件 参考文献报道，色谱柱（，）；柱温 ；流动相 冰醋酸甲醇（）；体积流量 ；电喷雾离子源；正离子扫描；多反应监测（）模式；气帘气体积流量 ；加热辅助气体积流量 ；雾化气体积流量 ；荷叶碱、罂粟碱检测离子分别为 、。分组、给药与采血取原料药、修饰脂质体、不含 脂质体冻干粉适量，溶液制成灌胃液（以荷叶碱计，质量浓度为 ）。只大鼠禁食过夜后随机分为 组，每组 只，分别给予上述 种灌胃液，剂量均为 ，于、眼眶后静脉丛取血各约 ，置于肝素化离心管中，离心 ，取上层血浆至另一空白离心管中，冷冻保存。血浆样品处理参考文献 报道，取室温解冻后的血浆样品 ，置于 离心管中，加入内标（罂粟碱）溶液（）、乙酸乙酯 ，涡旋 ，离心 ，取有机相至另一离心管中，氮气吹干得残渣，加入 甲醇涡旋 ，离心 。线性关系考察 取 对照品溶液适量，甲醇依次稀释至 、，分别取 至离心管中，氮气吹干，加入空白血浆 ，涡旋混合 ，即得血浆对照品溶液（荷叶碱质量浓度分别为、），按“”项下方法处理，在“”项条件下进样测定。以对照品质量浓度为横坐标（），对照品、内标峰面积比值为纵坐标（）进行回归，得方程为 （），在 范围内线性关系良好。专属性试验取空白血浆、定量限血浆样品（荷叶碱质量浓度为 ）、荷叶碱灌胃给药 血浆样品适量，在“”项条件下进样测定，结果见图，可知该方法专属性良好。方法学考察取血浆适量，于、在“”项条件下进样测定，测得荷叶碱、罂粟碱峰面积比值 为 ，表明血浆样品在 内稳定性良好。取、质控样品适量，同一天内在“”项条件下进样测定 次，测得荷叶碱、罂粟碱峰面积比值 分别为 、，表明该方 法 日 内 精 密 度 良 好，并 且 准 确 度 分 别 为 年 月第 卷 第 期中 成 药 内标（罂粟碱）荷叶碱 （）图 荷叶碱 色谱图 、；同法连续测定 ，每天 次，测得两者比值 分别为 、，表明该方法日间精密度良好，并且准确度分别为 、。取上述 种质量浓度质控样品适量，在“”项条件下进样测定，计算峰面积；取空白血浆适量，按“”项下方法处理（不加内标），在“”项条件下进样测定，计算峰面积；以甲醇代替空白血浆，其余操作不变，计算峰面积，以、比值计算基质效应，、比值计算提 取 回 收 率，测 得 荷 叶 碱 基 质 效 应 分 别 为 、，而内标为 ；荷叶 碱 提 取 回 收 率 分 别 为 、，而内标为 ，表明该方法基质效应较小，提取回收率较高。结果分析 血药浓度时间曲线见图，再采用 软件中的非房室模型计算药动学参数，结果见表。由此可知，与原料药比较，不含 脂质体 延长（），、升高（），相对生物利用度 增 加 至 倍；与 原 料 药、不 含 脂质体比较，修饰脂质体上述指标变化更显著（），相对利用度与原料药相比增加至 倍。表 荷叶碱主要药动学参数（，）（，）参数单位荷叶碱不含 荷叶碱脂质体 修饰荷叶碱脂质体 注：与荷叶碱比较，；与不含 荷叶碱脂质体比较，。年 月第 卷 第 期中 成 药 图 荷叶碱主要血药浓度时间曲线（）（）讨论普通脂质体易泄露，不稳定，而引入 后可增加其稳定性，可能是由于它在脂质体双分子层表面形成了保护层，增加了粒子之间的排斥力。王向涛等认为，链会对分子结构中含有氨基或羟基的药物产生吸附作用（如荷叶碱，含有叔氨），从而使包封率增加。但文献 报道，用量过大时容易与磷脂形成混合胶束，使包封率下降。本实验发现，荷叶碱 种脂质体在人工胃液、人工肠液中的累积释放度均明显提高，以前者更明显，可能是由于脂质体在前者中的稳定性更低；不含 荷叶碱脂质体在不同时间点的释放度均高于 修饰荷叶碱脂质体，可能与 在脂质体双分子层表面形成保护层，从而减慢药物释放有关；荷叶碱 种脂质体 延长，可能是脂质体本身缓释作用所致。前期报道，引入高分子材料 后可赋予脂质体一定胃肠道粘附性，也能使其修饰脂质体 显著延后。本实验发现，荷叶碱 种脂质体均可促进吸收，可能与改善该成分溶出有关。另外，药物被包裹于磷脂双分子层后，可减 弱 胃 肠 道 中 各 种 酶 对 药 物 的 代 谢、降 解等，并且磷脂等辅料本身可促进药物吸收；脂质体粒径较小，与胃肠道接触面积较大，有利于药物口服吸收。另外 修饰脂质体后，生物利用度提高程度更大，可能是由于 化后与普通脂质体相比稳定性更高，能促进药物透过胃肠 道 黏 液 层 进 入 血 液 循 环，发 挥 长 循 环 作用，。但本实验所制备的 修饰荷叶碱脂质体包封率不足 ，可能是与所用辅料负载药物能力有限、药物本身理化性质等原因有关，今后仍需进行深入研究。参考文献：陈 畅，谢永艳，黄丽萍 荷叶碱药理作用的研究进展南京中医药大学学报，（）：赵珺睿，任晓亮，王 萌 荷叶药材中荷叶碱生物药剂学分类系统研究 中国中药杂志，（）：李 娜，宋金春 莲生物碱抗肿瘤研究进展 中国药师，（）：但 凡，姜 维，徐彩菊，等 荷叶碱自组装纳米粒的制备与评价 精细化工，（）：；，：，（）：陈一桢，张文娟，唐兰如，等 和厚朴酚长循环脂质体的制备及药动学研究 中草药，（）：，（）：张文娟，陈一桢，唐兰如，等 二氢杨梅素长循环纳米脂质体的制备及大鼠体内药动学研究 中草药，（）：邢 宇，李 雄，于 颖 银杏内酯 脂质体的处方与制备工艺研究 中国现代应用药学，（）：刘 淼，高 悦，李康帆，等 聚乙二醇修饰木犀草素脂质体的制备及其理化性质 现代食品科技，（）：；，：刘 慢，余文洁，赵新娜，等 法快速测定降脂宁颗粒中 种化合物的含量 河南师范大学学报（自然科学版），（）：叶林虎，孔令提，闫明珠，等 法研究荷叶生物碱在大鼠体内的组织分布 中国新药杂志，（）：宋婷婷，蔡荣珊，王宏，等 修饰的地榆皂苷长循环脂质体的制备及质量评价 中草药，（）：王向涛，李 沙，张小滨，等 修饰脂质体对阿霉素载药量的影响 北京大学学报（医学版），（）：年 月第 卷 第 期中 成 药 任 婧，张丹参，侯文书，等 姜黄素长循环脂质体的制备及表征 河北科技大学学报，（）：，：，：，：，：，：，（）：吕竟夷，梁丽玲 三七总皂苷口服脂质体的制备及大鼠体内药动学研究 中南药学，（）：，：，：彭涛兴，彭 辉，许应超，等 黏液穿透纳米递送系统克服口服吸收黏液屏障的研究进展 中国新药杂志，（）：金合欢素磷脂复合物介孔二氧化硅纳米粒制备及其体内药动学研究杨金枝，崔晓鸽（郑州澍青医学高等专科学校，河南 郑州）收稿日期：作者简介：杨金枝（），女，硕士，副教授，从事中医学、中药学研究。：（），：摘要：目的 制备金合欢素磷脂复合物介孔二氧化硅纳米粒，并考察其体内药动学。方法 以大豆磷脂用量、水浴温度、搅拌时间为影响因素，复合率为评价指标，响应面法优化磷脂复合物处方，射线粉末衍射进行晶型分析，测定油水分配系数。溶剂挥发法制备介孔二氧化硅纳米粒，测定体外释药、包封率、载药量、粒径、电位，在扫描电镜下观察微观结构。只大鼠随机为 组，分别灌胃给予金合欢素、磷脂复合物、介孔二氧化硅纳米粒的 混悬液（），于、采血，法测定金合欢素血药浓度，计算主要药动学参数。结果 最优处方为大豆磷脂用量 ，水浴温度 ，搅拌时间 ，复合率接近 。原料药以无定形状态存在于磷脂复合物中，油水分配系数明显升高。介孔二氧化硅纳米粒呈球形，平均包封率为 ，载药量为 ，粒径为 ，为 ，电位为 ，内累积释放度约为 。与原料药、磷脂复合物比较，介孔二氧化硅纳米粒 缩短（），、升高（），相对生物利用度增加至 倍。结论 磷脂复合物介孔二氧化硅纳米粒可促进金合欢素口服吸收。关键词：金合欢素；磷脂复合物；介孔二氧化硅纳米粒；制备；体内药动学；溶剂挥发法；中图分类号：文献标志码：文章编号：（）：，（，）：，年 月第 卷 第 期中 成 药