IL-33通过miR-19a-3p_MAPK6通路影响心肌缺氧_复氧损伤的机制研究.pdf

论著 收稿日期:作者单位:江苏大学附属人民医院心内科江苏 镇江 通信作者 :./.通过/通路影响心肌缺氧/复氧损伤的机制研究高 旺田 欣姬林娟郭俊芳陶艾彬芮 涛姚永伟 摘 要 目的探讨白细胞介素()通过/通路对心肌缺氧/复氧(/)损伤的影响及可能的分子机制方法建立/诱导的新生小鼠心肌细胞体外模型使用 进行预处理向心肌细胞中转入 以上调 表达转入 以抑制 表达转入 以上调 表达 通过 活性、细胞凋亡 法和原位细胞凋亡染色检测心肌细胞凋亡 数据库预测 的潜在靶点双荧光素酶检测报告显示 与 之间关系 法检测心肌细胞 和 表达 法检测 蛋白表达结果 预处理可以抑制/诱导的 表达下调和细胞凋亡 双荧光素酶测定报告显示 靶向调控 抑制了/诱导的 表达上调过表达 减弱了 对/的抗凋亡作用 过表达 抑制了/诱导的 表达上调而敲低 可以消除 对/诱导的 表达下调结论 通过调控/信号通路减少/诱导的心肌细胞凋亡关键词 白细胞介素()缺氧/复氧(/)损伤丝裂原活化蛋白激酶()/()()/(/)/./././././.:/(/)引言白细胞介素()是白介素 家族成员在组织受损时从坏死或凋亡的细胞中释放出来通过与其受体生长刺激表达因子()结合抑制细胞凋亡 既往研究表明 在许多心血管疾病中具有心脏保护作用 在压力超负荷模型中 治疗可明显改善 野生型小鼠心肌肥厚和纤维化并提高其存活率 在大鼠心肌梗死模型中 通过诱导抗凋亡因子的表达抑制心肌细胞凋亡改善预后 在阿霉素诱导的心肌损伤中 抑制活性氧簇()的释放调节/信号通路减轻心肌细胞凋亡 尽管近年来对 进行了广泛的研究但其心脏保护作用的潜在机制尚不明确尤其是 对心肌缺血/再灌注实用药物与临床 年第 卷第 期 .(/)损伤的影响 本研究旨在探讨 在心肌细胞缺氧/复氧(/)损伤中的作用并进一步揭示其作用机制为治疗心肌/损伤开拓新的思路 材料和方法 主要实验试剂 胎牛血清购自美国 公司 培养基购自美国 公司、细胞凋亡 检测试剂盒和原位细胞凋亡染色检测试剂盒购自美国 公司 模拟物()、抑制剂()质粒及其相应阴性对照()购自美国 公司 转染试剂、试剂购自美国 公司 逆转录试剂盒购自日本 公司 试剂盒购自美国 公司 试剂盒购自德国 公司 和 抗体均购自美国 公司双荧光素酶报告基因测定试剂盒购自美国 公司 活性检测试剂盒购自美国 公司 心肌细胞培养与转染 取新生小鼠(日龄)心脏切碎(/)消化心脏组织反复轻柔吹打后收集悬浮细胞 离心 将沉淀细胞重新悬浮于含有 胎牛血清的 培养基中 预培养 后去除非贴壁细胞将贴壁细胞重悬于培养基中继续培养 直至心肌细胞达到 融合 按照 转染试剂盒说明书所示的转染步骤分别将 、重组质粒或 质粒转入心肌细胞内 首先使用 培养基稀释拟转染的 将其按 的体积比加入到 转染试剂中 在室温下孵育 再将该(脂质体)混合物加入到心肌细胞培养基中 继续孵育 通过 法检验转染效果 序列插入 载体以构建 质粒并将空 质粒作为阴性对照 将 和 质粒通过 转染心肌细胞 具体方法同上 下继续孵育 用于后续实验 缺氧复氧模型心肌细胞在无血清 和厌氧条件(和 )中孵育 以诱导缺氧 随后将细胞在常氧条件下培养 以诱导复氧构建缺氧/复氧(/)模型 常氧条件下的细胞(常氧/复氧/)作为对照 细胞处理及分组()用不同浓度(/)预处理每组各取样本 例样本总量为 例 根据实验结果选取适当 预处理浓度进行后续实验然后根据是否进行/处理分为对照组()、/组、/组、组每组各取样本 例样本总量为 例根据是否使用 预处理和不同的复氧时间()将心肌细胞进行分组每组各取样本 例样本总量为 例根据是否转染、预处理或/处理将心肌细胞分为 组、组、组、组、/组、/组、/组、/组每组各取样本 例样本总量 例()用 、及 分别转染心肌细胞将其分为 组、组及 组每组各取样本 例样本总量为 例()经/处理后根据是否使用 预处理将其分为/组、/组、/及 组每组各取样本 例样本总量为 例用 或 转染心肌细胞将其分为对照组()、组及 组每组各取样本 例样本总量为 例根据是否使用 预处理、转染心肌细胞或者/处理将其分为 组、组、组、组、/组、/组、/组、/组每组各取样本 例样本总量为 例()根据是否使用 转染心肌细胞或/处理分为对照组、/组、/组、/组每组各取样本 例样本总量为 例根据是否使用 转染心肌细胞、预处理或/处理将其分为对照组、/组、/组、/组、/组每组各取样本 例样本总量为 例 实时荧光定量 用 试剂处理实用药物与临床 年第 卷第 期 .从心肌细胞中提取总 使用 试剂盒对 进行逆转录并通过 通用 测定 水平 按照说明用 试剂盒对 的表达进行定量 通过 法计算 和 的相对表达水平分别以 和 作为内参 上游引物:下游引物:上游引物:下游引物:上 游 引物:下 游 引物:上游引物:下游引物:双荧光素酶基因报告检测 将 序列的 插入 双荧光素酶 靶向表达载体构建野生型 ()同时通过定点突变 中的 结合位点 构 建 突 变 体()在 过表达实验中用 或 转染心肌细胞在 抑制实验中用 或 共转染心肌细胞 根据双荧光素酶报告基因试剂盒说明书所述步骤检测荧光素酶活性 蛋白表达检测从每个细胞培养孔中裂解并刮取心肌细胞离心后获得蛋白质样品并测定其浓度 通过 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳()将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上 分别与 抗体()和 抗体(内参 )在 下孵育过夜 然后将膜与 偶联的二抗在室温下孵育 最终通过 发光液在凝胶成像系统中曝光获得可视化特异条带通过 系统分析条带的灰度值 细胞凋亡检测 活性试剂盒测定 活性待细胞裂解后把 底物、反应缓冲液和细胞上清液(/孔)在 下孵育 借助微孔板读取器测定 处光密度值()活性()(实验组 值/组 值)通过细胞凋亡 检测试剂盒测定片段化 用试剂盒内裂解液把细胞裂解充分离心后转移裂解液上清到链霉素包裹的 孔板然后加入试剂盒内生物素标记抗组蛋白抗体、过氧化物酶标记的抗 单克隆抗体放置室温下孵育 最后分光光度计检测 处的细胞凋亡状态原位细胞凋亡染色实验中收集实验组、对照组贴壁及漂浮的所有细胞 清洗 次之后加入 制作细胞悬液涂在载玻片上自然晾干然后放置于 多聚甲醛中室温固定 浸润使用原位细胞凋亡染色检测试剂盒对凋亡 片段进行 末端标记 荧光显微镜观察 标记的 阳性细胞并拍照随机选择 个区域计算凋亡细胞百分比 统计学方法 应用 软件进行统计学分析 本研究所有计量资料都符合正态分布以均数 标准差()表示 两组间比较采用两独立样本 检验多组间比较采用单因素方差分析组间多重比较采用 检验 为差异具有统计学意义 结果 通过调节 减轻/诱导的心肌细胞凋亡与对照组相比/增加心肌细胞凋亡 单独作用不影响心肌细胞的凋亡但是以剂量依赖的方式减少了/诱导的细胞凋亡(图、)并选择 浓度为 /进行后续实验/后 水平降低然而与不同复氧时间的/组相比 预处理组中 的降低消失(图)与/组的心肌细胞相比无论转染 或 预处理都可以减轻/诱导的细胞凋亡(图)是 的靶基因 检索 数据库发现 与 存在潜在的结合位点(图)双荧光素酶报告基因检测显示 可抑制 组的荧光素酶活性而不影响 组荧光素酶活性()(图)抑制了心肌细胞中 ()和蛋白表达()(图)可增加 组的荧光素酶活性而不影响 组荧光素酶活性()(图)且 促进了 ()和蛋白表达()(图)结果表明 可以负向调控 实用药物与临床 年第 卷第 期 .图 通过 影响/诱导的心肌细胞凋亡注:./诱导的心肌细胞凋亡、活性与 组相比 与(/)/组相比 .原位细胞凋亡染色法结果(与 组相比 与/组相比 细胞核表达蓝色荧光的为凋亡阳性细胞细胞质表达红色荧光的为心肌细胞放大倍数).检测 对/诱导的心肌 表达的影响(与 /组相比 与各自复氧时间的 /组相比).细胞凋亡 及 活性检测过表达 或 预处理对/诱导的心肌细胞凋亡的影响(与各自/组相比 与 /且未经 处理组相比 与 /且未经 处理组相比)图 对靶基因 的影响注:.数据库分析 与 的结合位点.双荧光素酶报告基因检测 对 及 组荧光素酶活性的影响.对 及蛋白表达的影响.检测 对 及 组荧光素酶活性的影响.对 及蛋白表达的影响 通过 影响心肌细胞凋亡与对照组相比/组心肌细胞 的表达上调此外 单独作用并不影响 的表达但逆转了/诱导的 (图)和蛋白(图)的表达上调 经/处理后与转入空载 质粒的心肌实用药物与临床 年第 卷第 期 .细胞相比转入 重组质粒后心肌细胞 蛋白表达上调(图)能抑制/诱导的心肌细胞凋亡而转入 的心肌细胞由于 表达增加减弱了 对/的抗凋亡作用(图)结果表明 通过下调 表达减弱/诱导的心肌细胞凋亡图 通过 减少心肌细胞凋亡注:、及 检测 对/诱导的心肌细胞 表达的影响(与 组相比 与/组相比 )验证 过表达效率(与 组相比 )细胞凋亡 及 活性检测 过表达对 抗凋亡作用的影响(与各自/组相比 与/且未经 处理组相比 与/组相比 )在/损伤中参与调控/通路与转入 的心肌细胞相比转入 后抑制了/诱导的 (图)和蛋白(图)表达上调 与单纯/处理的心肌细胞相比 预处理可以抑制/诱导的 和蛋白的表达上调()与 预处理相比 预处理的心肌细胞转入 后 表达无明显变化 而 预处理的心肌细胞转入 后 和蛋白的表达增加(图、)即敲低 消除了 对/诱导 表达上调的影响 讨论急性心肌梗死是导致我国居民死亡的主要原因之一尽早达到有效的心肌再灌注是急性心肌梗死救治的核心 然而血流的突然开通往往会引起恶性心律失常、无复流从而导致心肌损伤进一步加重即心肌缺血/再灌注损伤 目前认为缺血心肌在血流恢复后由于能量代谢障碍、钙离子超负荷和自由基大量生成等原因导致心肌超微结构、功能、代谢及电生理等方面的进一步损害这是导致心肌缺血/再灌注损伤的主要原因但其机制尚不明确()是一类非编码的单链小分子 通过与靶基因 的 非翻译区()结合来负性调控基因表达 越来越多的证据表明 在心肌/损伤中起关键作用 等发现在猪/损伤模型中抗 治疗可预防/损伤引起的心力衰竭 另有研究发现在经/诱导的 细胞中 水平降低而 过表达可减少心肌/损伤 作为 基因簇的重要成员 首先被发现与肿瘤的发生、发展密切相关 一系列研究证实了 在心力衰竭、心肌梗死、心肌纤维化和心肌肥厚等病理生理机制中起重要作用 等研究表明与阴性对照组相比心肌/损伤后 的表达明显减少 本研究也显示在/损伤后的表达水平降低 此外 转染能增加 的表达从而有效抑制/诱导的心肌细胞凋亡 上述结果表明/损伤可降低而实用药物与临床 年第 卷第 期 .图 在/损伤中参与调控/通路注:、及 检测过表达 对/诱导的 表达升高的影响、敲低 消除 对/诱导的 过表达 与空白对照组相比 与/组相比 与/组相比 水平的升高可以减轻/诱导的心肌细胞凋亡已知/损伤可以诱导心肌细胞凋亡而 同时具有抗氧化和抗凋亡等心肌保护作用 在心肌/损伤模型中 等证明了外源性 通过抑制/通路减轻/诱导的氧化应激最终减弱心肌细胞凋亡 等研究表明 通过调控 和 信号通路抑制心肌细胞凋亡减轻心肌/损伤 本研究结果表明/损伤增加心肌细胞的凋亡而 以剂量依赖性的方式显著逆转了这一趋势这与之前发表的研究结论相一致 此外增加了心肌 的表达这是导致减少/损伤的重要原因 既往研究显示 对多种 具有调节作用 等发现 能够刺激 的表达从而促进急性结肠炎中结肠上皮细胞的修复 等研究显示 调节 的表达从而促进非小细胞肺癌细胞的增殖 本研究中 增加了心肌 的表达但其发生机制尚不明确 有研究表明 可抑制/损伤中 的释放而 可通过转录因子 和 来调控某些特定的 的表达 据此推测 可能通过调控 的激活而影响 的表达或直接干预 的转录过程 属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶能被细胞外多种炎症因子刺激进而调节基因表达、细胞存活和凋亡 尽管 在多种细胞中均有表达但由于其缺乏经典 通路中保守的 基序导致有关 激活的确切分子机制研究甚少 研究表明 通过抑制 信号通路减少心肌/损伤而 作为非典型 成员之一其过表达可促进/损伤诱导的细胞凋亡 本研究显示/损伤增加了 表达而 预处理可逆转 的过表达 根据生物信息学分析本研究预测 为 的靶基因并通过双荧光素酶报告基因实验加以证实 此外转染 可显著抑制 的表达减轻心肌细胞凋亡而转染 结果 相 反 结 果 表 明 通 过 抑 制 的表达减轻/诱导的心肌细胞凋亡综上所述本研究证实了/通路在 抗/诱导的心肌细胞凋亡中的重要作用为心肌/损伤提供了新的潜在治疗靶点和理论依据参考文献:.实用药物与临床 年第 卷第 期 .():./.():.():.():./.():.:.张文杨巍.缺血后适应对心肌缺血/再灌注损伤的影响及其进展.中国循证心血管医学杂志():.():./:/.():.:.:./.():.:.:.():./.():./.:.()():./.():./.():.():.():./.:.:.():.():.():.:.():.():.(本文编辑:高宽)实用药物与临床 年第 卷第 期 .