EZH2抑制剂与膀胱癌GC化疗药物联用增敏的作用研究.pdf

杨宏，教授，主任医师，硕士研究生导师，现任云南省肿瘤医院/昆明医科大学第三附属医院泌尿外科一病区副主任。从事泌尿外科临床、教学及科研工作 26 年，医院“十佳医生”。曾在上海交通大学医学院附属仁济医院及中山大学附属第二医院进修学习。研究方向：泌尿、男生殖系统肿瘤的诊断、手术及综合治疗。担任云南省抗癌协会泌尿男生殖系肿瘤专业委员会常务委员与云南省转化医学学会泌尿系肿瘤分会常务委员。主持省厅级课题 3 项，校级课题 2 项，参与国家地区科学基金项目 1 项，获云南省卫生科技成果奖三等奖 3 项。第 1 作者或通讯作者发表论文 20 余篇，其中SCI 收录 9 篇。主编专著新编临床外科学，副主编及参编多部专著和教材。EZH2 抑制剂与膀胱癌 GC 化疗药物联用增敏的作用研究谢峻1），刘绍有2），施鸿金1），毛秋玉1），杨宏2）（1）昆明医科大学第二附属医院泌尿外科，云南 昆明650101;2）云南省肿瘤医院泌尿外科，云南 昆明650118）摘要 目的探究多梳蛋白 zeste 基因増强子类同源物 2（histone methyltransferase enhancer of Zeke 2，EZH2）抑制剂对膀胱癌治疗中吉西他滨联合顺铂（gemcitabine and cisplatin，GC）化疗方案中的增敏作用。方法首先构建 EZH2 siRNA 敲低系，然后使用 qPCR 与 WB 检测验证 siRNA 在膀胱癌 UCC 细胞中的表达水平。根据不同的处理分为对照组（膀胱癌 T24 细胞正常培养）、GC 化疗组（T24 细胞+GC 化疗药物）、si EZH2 转染组（T24 细胞+si EZH2 转染+GC 化疗药物）、GSK126 抑制剂组（T24 细胞+GSK126 5 M+GC 化疗药物）、UNC1999 抑制剂组（T24 细胞+UNC1999 5 M+GC 化疗药物）、EI1 抑制剂组（T24 细胞+EI1 5 M+GC 化疗药物）、DZNep1 抑制剂（T24 细胞+DZNep1 5 M+GC 化疗药物）与 EPZ005687 抑制剂（T24 细胞+EPZ005687 5 M+GC 化疗药物），采用 CCK-8、平板克隆形成与 Annexin/PI 等实验分别检测 8 组细胞增殖率、凋亡率及其对细胞周期影响。随后将 30 只 BALB/C 雌裸鼠随机分为对照组（膀胱癌 T24 细胞正常培养）、T24 细胞+EZH2 抑制剂的溶媒缓冲液组、T24 细胞+GC 化疗组、T24 细胞+UNC1999 EZH2 抑制剂组与 T24 细胞+UNC1999 EZH2 抑制剂+GC 化疗组，每组 6 只。裸鼠成瘤实验检测转染后各组 UCC 细胞移植瘤的生长情况，免疫组化染色法观察移植瘤组织中 Ki67和 EZH2 的表达，血常规检测白细胞、红细胞及血小板数量裸鼠骨髓抑制情况。结果在已转染了 siRNA 质粒的 T24 细胞中，siEZH2-1 与 siEZH2-2 在 siRNA 与蛋白表达水平上与对照组的差异有统计学意义（P 0.01）。在细胞实验中，与对照组相比，上述 7 组实验组通过 CCK-8、平板克隆与 Annexin V/PI 双染、Pi 单染实验发现 EZH2 抑制剂可以抑制 T24 细胞的增殖、迁移和侵袭能力，早期凋亡细胞比例上调（P 0.01）。其中在平板克隆实验中，实验组 T24 细胞+EPZ005687 5 M+GC 化疗药物组细胞克隆数与对照组相比，差异有统计学意义（P 0.05）。小鼠体内实验表明，与对照组相比，经 GC 化疗药物或 EZH2 抑制剂的裸鼠瘤体重量减少（P 0.05），并且在血常规检测中血细胞含量也有所增高。结论EZH2 抑制剂能够提高膀胱癌 GC 化疗方案的敏感性，从而降低膀胱癌细胞的增殖、迁移与裸鼠体内移植瘤的生长。同时，联合用药也能够显著减少其骨髓抑制情况。提示协同治疗在膀胱癌化疗增敏中具有一定的作用。关键词膀胱癌；多梳蛋白 zeste 基因増强子类同源物 2；GC 化疗中图分类号 R737.14 文献标志码 A 文章编号 2095 610X（2023）10 0067 10Enhanceing Effect of EZH2 Inhibitors in Combination with GCChemotherapeutic Agents in Bladder CancerXIE Jun1），LIU Shaoyou2），SHI Hongjin1），MAO Qiuyu1），YANG Hong2）收稿日期20230522基金项目云南省科技厅-昆明医科大学应用基础研究联合专项基金资助项目（202001AY070001-077）作者简介谢峻（1998），男，江西高安人，在读硕士研究生，主要从事膀胱癌基础研究工作。通信作者杨宏，E-mail：昆明医科大学学报2023，44（10）：6776JournalofKunmingMedicalUniversityDOI:10.12259/j.issn.2095-610X.S20231017CN531221/R（1）Dept.of Urology，The 2nd Affiliated Hospital of Kunming Medical University，KunmingYunnan 650101;2）Dept.of Urology，Yunnan Tumor Hospital，Kunming Yunnan 650118，China）Abstract ObjectiveTo explore the synergizing effect of histone methyltransferase enhancer of Zeke 2（EZH2）inhibitors on Gemcitabine and Cisplatin（GC）chemotherapy regimen in bladder cancer treatment.MethodsFirstly，EZH2 siRNA knockdown lines were constructed，and then the expression level of siRNA inbladder cancer UCC cells was verified using qPCR and WB.According to different treatments，these cells weredivided into control group（bladder cancer T24 cells cultured normally），GC chemotherapy group（T24 cells+GC），siEZH2 transfection group（T24 cells+siEZH2 transfection+GC），GSK126 inhibitor group（T24 cells+GSK1265 M+GC），UNC1999 inhibitor group（T24 cells+UNC1999 5 M+GC），EI1 inhibitor group（T24 cells+EI15 M+GC），DZNep1 inhibitor group（T24 cells+DZNep1 5 M+GC），and EPZ005687 inhibitor group（T24cells+EPZ005687 5 M+GC）.CCK-8，plate clone formation，Annexin/PI，and other experiments were used todetect the proliferation rate，apoptosis rate，and the effect on the cell cycle of the eight groups of cells respectively.Then，30 female BALB/C nude mice were randomly divided into control group（bladder cancer T24 cells culturednormally），T24 cells+EZH2 inhibitor solvent buffer group，T24 cells+GC chemotherapy group，T24 cells+UNC1999 EZH2 inhibitor group，and T24 cells+UNC1999 EZH2 inhibitor+GC chemotherapy group，with 6mice in each group.Tumor formation experiment in nude mice was used to detect the growth of transplanted tumors ineach group after transfection，immunohistochemistry was used to observe the expression of Ki67 and EZH2 in thetransplanted tumor tissues，and blood routine examination was used to detect the number of white blood cells，redblood cells，and platelets and the degree of bone marrow suppression in nude mice.ResultsIn T24 cellstransfected with siRNA plasmids，siEZH2-1 and siEZH2-2 showed statistically significant differences in siRNAand protein expression levels compared to the control group（P 0.01）.Compared to the control group，the aboveexperimental groups found that EZH2 inhibitors can inhibit the proliferation，migration，and invasion ability of T24cells，and increase the proportion of early apoptotic cells through CCK-8，plate cloning，and Annexin V/PI doublestaining，and Pi single staining experiments（P 0.01）.Among them，in the plate cloning experiment，thedifference in the number of cell clones between the experimental group T24 cells+EPZ005687 5 M+GCchemotherapy drug group and the control group was statistically significant（P 0.05）.In vivo experiments in miceshowed that the tumor weight of nude mice treated with GC chemotherapy drugs or EZH2 inhibitors decreasedcompared to the control group（P 0.05），and the blood cell content also increased in the blood routineexamination.ConclusionEZH2 inhibitors can enhance the sensitivity of bladder cancer GC chemotherapy regimen，thereby reducing the proliferation，migration，and growth of bladder cancer cells in nude mice xenografts.Additionally，combination therapy can significantly reduce bone marrow suppression.These findings suggest thatcombination therapy plays a role in sensitizing bladder cancer chemotherapy.Key words Bladder cancer；Histone methyltransferase enhancer of Zeke 2；GC chemotherapy膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一，在男性中，其发病率据统计位于第十位，且发病率和病死率根据调查结果显示在近几年也呈逐年攀升的趋势，情况不容乐观1。在膀胱癌中其最重要的病理类型经研究为尿路上皮癌，膀胱癌患者的预后较差的原因主要为其早期缺乏特异性症状，由于肿瘤的转移导致部分患者就诊时已进入中晚期，行手术及放化疗等治疗手段疗效较差。因此，开发靶向治疗药物是阻止膀胱癌病情恶化的关键。EZH2 经研究得知属于多梳蛋白抑制复合物家族成员，该基因主要参与调控多种靶基因沉默并催化组蛋白 H3 的甲基化过程。研究表明，EZH2 与膀胱癌、前列腺癌、乳腺癌、肾细胞癌、肺癌、子宫内膜癌、胶质瘤等一系列肿瘤的恶性发生与发展关系极为密切28。并且越来越多的证据表明了 EZH2 抑制剂在多种癌症中化疗增敏作用9。因此这些研究提示 EZH2 抑制剂可以作为癌症化疗增敏新靶点，使得 EZH2 抑制剂成为化疗方案中重要的辅助策略。但是目前 EZH2 抑制剂在膀胱癌 GC 化疗中的研究仍然较少。因此本研究首次探讨 EZH2 抑制剂在尿路上皮癌（urothelial cell carcinoma，UCC）治疗与 GC 化疗方法联合治疗时的重要作用，将为临床指导用药方面提供理论基础，并且对于 UCC 患者的 GC 化疗方案提供新的辅助，最终为膀胱癌的治疗提供新思路。68昆明医科大学学报第 44 卷1材料与方法1.1主要试剂和仪器人膀胱癌 T24 细胞，GC 化疗药物（1 M 顺铂+1.56 M 吉 西 他 滨），5 种 EZH2 抑 制 剂（GSK126，UNC1999，DZNep1，EI1 和EPZ005687），EZH2 抑 制 剂 的 溶 媒 缓 冲 液、吉 西 他 滨、UNC1999 与顺铂 均由细胞平台提供，引物设计为 Beacon Designer 7.90，引 物 合 成 为 广 州invitrogen RPMI 1640。谷氨酰胺、基础培养基、青链霉素（双抗）、胎牛血清、0.25%胰酶均购自Gibco 公司，30%过氧化氢溶液（西陇化工），TritonX-100（Vetec V900502），PBS 缓冲液（北京中杉 ZLI-9061），DAB 显色试剂盒（北京中杉 ZLI-9018），恒温干燥箱与自动消毒锅均由 SANYO 公司提供。兔抗人 EZH2 单克隆抗体、GAPDH 抗体购自 Abmart 公司；羊抗人 HRP 标记 IgG 二抗购自 CST 公司。1.2实验动物BALB/C 裸鼠 30 只，雌，体重（184）g，购自斯贝福（北京）生物技术有限公司，动物许可证号 SCXK（京）2019-0010。1.3实验方法1.3.1EZH2 siRNA 的设计合成及筛选该实验根据 3 条不同的 siRNA 分别为 siEZH2-1/-2/-3。进行实验分组，分为 T24 细胞正常培养、T24 细胞+si NC、T24 细胞+si-EZH2 1、T24 细胞+siEZH2-2 和 T24 细胞+siEZH2-3 5 个组。然后将 T24 细胞用 0.25%胰酶消化收集细胞，去上清后 1 mL 完全培养基重悬细胞，按照每个孔接种5104个细胞将细胞接种在6 孔板中，每组接种6 重复，当细胞融合度达到 50%60%时，按照分组转染 si NC、siEZH2，以 riboFECT CP 作为转染试剂，转染浓度为 50 nM；稀释 riboTRA-CER：用 不 含 双 抗 的 完 全 培 养 基 将 10XriboFECT CP Buffer（v1）稀释成 1X 的 riboFECTCP Buffer（v2）；按照每孔用 120 L v2 加20 M 的riboTRACER Fluorescent Oligo（Green）储存液（v3）5 L，轻轻混匀。合液制备：加入 12 LriboFECT CP Reagent（v4），轻轻吹打混匀，室温孵育 015 min，制备 riboFECT CP 混合液。根据以上 siRNA 转染方法转染 24 h 后，收集细胞，每组 3 重复提取 RNA，进行后续 qPCR 检测；每组剩余 3 重复，提取蛋白，进行后续 WB 检测。1.3.2RT-qPCR收集 5 组细胞，分别为对照组（T24 细胞正常培养）、si-NC 组（T24 细胞+siNC）、si-EZH2 1 组（T24 细 胞 +siEZH2-1）、siEZH2-2 组（T24 细胞+siEZH2-2）与 siEZH2-3组（T24 细 胞 +siEZH2-3），细 胞 总 RNA 利 用TRIzol 法提取，琼脂糖凝胶电泳鉴定，酶标仪测定 RNA 浓度，待逆转录成 cDNA 进行 RT-qPCR反应，EZH2 引物序列见表 1。按照试剂盒说明书设定 20 L 反应体系：反应条件主要为以下 3 步：95 预变性 30 s；95 变性 10 s 与退火&延伸60 30 s，共 4045 个循环，最终使用 2-CT法计算目的基因的相对表达量。表1EZH2 引物序列Tab.1PrimersequencesofEZH2基因名称序列（53）长度（bp）GAPDH（H）-FTTGCCCTCAACGACCACTTT120GAPDH（H）-RTGGTCCAGGGGTCTTACTCC120EZH2（H）-FAAGAAGAAGAAGAGAAGAA161EZH2（H）-RATAGTAAGTGCCAATGAG161F：上游引物、正向；R：下游引物、反向。1.3.3Western blot各组细胞加入细胞裂解液，蛋白样品即为离心所得上清液。用 BCA 蛋白检测试剂盒用于测定各组蛋白浓度，待蛋白定量变性后进行 SDS-PAGE 分离蛋白，电泳后迅速转至PVDF 膜上，使用 5%脱脂牛奶 TBST 溶液中室温封闭 1 h，分别以抗 EZH2（11000）和 GAPDH 抗体（14000）为一抗，4 处理过夜，TBST 洗涤3 次后，以 HRP 标记 IgG 为二抗（14000）室温处理 2 h，之后加入 ECL 显色剂显色，在暗室中通过胶片曝光，胶片显影及定影，最后用扫描仪扫描记录胶片上蛋白印迹的变化。1.3.4CCK-8 试验将细胞按 5103个/孔接种于 96 孔板，每组设 6 个复孔，培养 24 96 h；当细胞融合度达到 50%60%时，按照分组转染si EZH2 或加入抑制剂处理 24 h 后，加入 GC 化疗药物（1 M 顺铂+1.56 M 吉西他滨）处理 2 h，之后更换不含 GC 化疗药物培养基继续培养 24 h和 48 h 后进行 CCK-8 检测。然后于每个设定的时间点每孔加入 10 L CCK-8 溶液孵育 2 h；酶标仪于 450 nm 波长处检测吸光度（OD）值。实验重复 3 次。1.3.5平板克隆实验与 Annexin V-FITC/PI 凋亡实验将转染细胞按 1103/孔接种于6 孔板培养，每组设 3 个复孔。培养 10 d 后，用 4%多聚甲醛溶液固定，用结晶紫染色，倒置显微镜（40）观察克隆形成情况并拍照。细胞接种于 6 孔板，培养至对数生长期后，收集细胞，PBS 重悬，取（510）104 个重悬细胞，1 000 r/min 离心 5 min，弃上清，加入 195 L Annexin V-FITC 结合液重悬细胞，加入 5 L Annexin V-FITC 混匀，室温第 10 期谢 峻，等EZH2 抑制剂与膀胱癌 GC 化疗药物联用增敏的作用研究69避光孵育 10 min，1000 r/min 离心 5 min，弃上清，加入 10 L PI，轻轻混匀，冷浴避光放置，上流式细胞仪（BD FACSVerse）检测。实验重复 3 次。1.3.6移植瘤裸鼠模型的建立与观察按实验要求进行分组，将 BALC/c 裸鼠随机分为 5 组，每组 6 只。5 组分别为对照组（T24 细胞正常培养）、溶媒缓冲液组（T24 细胞+100 L UNC1999 溶媒缓冲液）、GC 化疗组（裸小鼠+T24 细胞+GC 化疗 组）、UNC1999 组（裸 小 鼠 +T24 细 胞 +UNC1999）、UNC1999+GC 化疗组（裸小鼠+T24细胞+UNC1999+GC 化疗）在各组 BALB/C 裸鼠适应性饲养 1 周后，开始接种细胞，多次接种直到瘤体长出为止，瘤体长出后开始测量瘤体，培养至瘤体大小为 50 mm3左右，开始给药处理。UNC1999 给药：腹腔注射 50 mg/kg，每只给药量1 mg；吉西他滨：腹腔注射 40 mg/kg，每只给药量 0.8 mg；顺铂：腹腔注射 60 mg/kg，每只给药量 1.2 mg。第 2 周与 4 周时分别处死裸鼠，完整取出皮下肿瘤后称其质量。1.3.7免疫组化染色移植瘤组织的固定通过10%中性甲醛溶液，之后进行石蜡包埋、切片、脱蜡与水化，经过使用过氧化氢阻断其内源性过氧化酶活性后，分别加入鼠抗人 Ki67 与 EZH2，4 处理过夜。加入酶标羊抗小鼠/兔室温处理 1 h，DAB 显色，苏木精复染，乙醇梯度脱水、二甲苯透明、中性胶封片。最后，在显微镜（200）下镜检拍照。其中阳性染色为细胞核的棕色颗粒沉着。1.4统计学处理以上主要实验均独立重复 3 次。所有数据采用 GraphPad Prism8.0 软件进行统计学分析，采用 Shapiro-Wilk 正态性检验对检验数据进行正态性分析。采用单因素方差分析对组间差异进行比较分析，多重比较用 Bonferroni 法，数据以平均值平均值的标准误差（MeanSEM）表示，P 0.05 为差异有统计学意义。2结果2.1si-EZH2 质粒转染于 T24 细胞中对其 EZH2RNA 表达的影响首先将实验分为 T24 细胞正常培养、T24 细胞+si NC、T24 细胞+siEZH2-1、T24 细胞+siEZH2-2 和 T24 细胞+siEZH2-3 5 个组。然后将构建好的 siEZH2-1、siEZH2-2、siEZH2-3 质粒转染至 T24 细胞中，通过 qPCR 实验及 WB 实验检测 EZH2 基因表达水平，结果显示:与对照组正常 T24 细胞（1.2380.1210）相比，其余 4 组中只 有 siEZH2-1（0.62430.03135）、siEZH2-2（0.21680.03128）的 EZH2 siRNA 表达量低于对照组（P 0.01），见图 1。并且 si EZH2-2 的 Ct 值与 对 照 组 相 比 明 显 下 降，说 明 siEZH2-1、siEZH2-2 可以作为 EZH2 基因的 siRNA，并且siEZH2-2 更为合适。2.2si-EZH2 质 粒 转 染 于 T24 细 胞 中 对 其EZH2 蛋白表达量的影响上述 5 组实验组之间 WB 实验结果与 EZH2的蛋白相对表达量结果，见图 2。与正常 T24 细胞 相 比，其 余 4 组 实 验 组 中 只 有 siEZH2-1、siEZH2-2 的 EZH2 蛋白表达量低于对照组（P 0.01），其中与对照组膀胱癌 T24 细胞正常培养的EZH2 的相对蛋白表达量（1.07600.05931）相比，T24 细胞+siEZH2-2 实验组 EZH2 的相对蛋白表达量（0.33830.03978）降低，且差异有统计学意义（P 0.01）。表明膀胱癌 T24 细胞转染实验成功，同时提示，细胞中已转染的 siEZH2 对 EZH2 表达具有明显的抑制作用。2.3降低 EZH2 表达对在 GC 化疗中膀胱癌 T24细胞的增殖与克隆能力的影响为了检测不同的 EZH2 抑制剂之间对于 GC化疗中的膀胱癌 T24 细胞增殖与凋亡是否存在差异，对照组（膀胱癌 T24 细胞正常培养）、GC 化疗组（T24 细胞+GC 化疗药物）、si EZH2 转染组（T24 细 胞 +si EZH2 转 染 +GC 化 疗 药 物）、GSK126 抑制剂组（T24 细胞+GSK126 5 M+GC化 疗 药 物）、UNC1999 抑 制 剂 组（T24 细 胞 +UNC1999 5 M+GC 化疗药物）、EI1 抑制剂组（T24 细胞+EI1 5 M+GC 化疗药物）、DZNep1抑制剂（T24 细胞+DZNep1 5 M+GC 化疗药物）与 EPZ005687 抑 制 剂（T24 细 胞 +EPZ0056875 M+GC 化疗药物）的 24 h 与 48 h CCK8 实验结果，见图 3。研究结果表示，其中使用 UNC1999*2.01.51.00.502ctT24 siRNA 筛选T24 细胞正常培养T24 细胞+si NCT24 细胞+si EZH21T24 细胞+si EZH22T24 细胞+si EZH23图1qRT-PCR 检测 EZH2 siRNA 的表达Fig.1ExpressionofEZH2siRNAviaqRT-PCR*P 0.01。70昆明医科大学学报第 44 卷EZH2 抑制剂结合 GC 化疗药物的膀胱癌 T24 细胞活力在 24 h 和 48 h 均低于对照组与 GC 化疗组，24 h（48.632.958）%，（P 0.01）、48 h（43.561.709）%，（P 0.01）差异均有统计学意义。平板 克 隆 形 成 实 验 结 果，见 图 4。与 对 照 组（215.710.73）个相比，T24 细胞+DZNep1 5 M+GC 化疗药物组（84.466.066）个，（P 0.01）与 T24 细胞+EPZ005687 5 M+GC 化疗药物组（127.624.00）个，（P 0.05）的细胞克隆形成数目减少，差异均有统计学意义。以上实验结果说明 EZH2 抑制剂可以降低膀胱癌 T24 细胞在GC 化疗药物中增殖与克隆能力。2.4降低 EZH2 表达对 GC 化疗中膀胱癌 T24 细胞周期与细胞凋亡能力的影响为了进一步验证 EZH2 抑制剂可以有效提高膀胱癌 T24 细胞在 GC 化疗药物的敏感性，进行PI 单染检测细胞周期与平板克隆形成实验检测细胞克隆形成能力。细胞周期结果见图 5。与上述对照组相比，其余 7 组实验组在细胞周期方面G1 期都有所上升而 G2 期与 S 期所占的比例却都有所下降，说明单独 GC 化疗与 EZH2 抑制剂和GC 化疗药物联用均能在 G1 期水平上抑制膀胱癌T24 细胞增殖，并且 EZH2 抑制剂与 GC 化疗药物联用抑制膀胱癌 T24 细胞增殖效果比单独 GC 化T24 细胞正常培养T24 细胞+si NCT24 细胞+si EZH21T24 细胞+si EZH22T24 细胞+si EZH231:T24 细胞正常培养2:T24 细胞+si NC3:T24 细胞+si EZH214:T24 细胞+si EZH225:T24 细胞+si EZH23EZH2GAPDH85 kDa37 kDa12345*1.51.00.50EZH2 相对蛋白表达量AB图25 组膀胱癌 T24 细胞中 EZH2 的蛋白相对表达量分析Fig.2AnalysisofrelativeproteinexpressionofEZH2infivegroupsofbladdercancerT24cellsAB：各组 EZH2 相关蛋白表达。与对照组比较，*P 0.01。120100806040200细胞活力(%)T24 细胞T24 细胞+GC 化疗药物T24 细胞+si EZH2 转染+GC 化疗药物T24 细胞+GSK126 5 M+GC 化疗药物T24 细胞+UNC1999 5 M+GC 化疗药物T24 细胞+EI1 5 M+GC 化疗药物T24 细胞+DZNep1 5 M+GC 化疗药物T24 细胞+EPZ005687 5 M+GC 化疗药物120100806040200细胞活力(%)CCK8-24 hT24 细胞T24 细胞+GC 化疗药物T24 细胞+si EZH2 转染+GC 化疗药物T24 细胞+GSK126 5 M+GC 化疗药物T24 细胞+UNC1999 5 M+GC 化疗药物T24 细胞+EI1 5 M+GC 化疗药物T24 细胞+DZNep1 5 M+GC 化疗药物T24 细胞+EPZ005687 5 M+GC 化疗药物CCK8-48 h*AB图3CCK-8 实验检测 24 h 与 48 h EZH2 抑制剂对膀胱癌 T24 细胞增殖的影响Fig.3CCK-8assaytodetecttheeffectof24hand48hEZH2inhibitorsontheproliferationofbladdercancerT24cellsA：CCK-8 实验 24 h UCC 细胞活力百分比；B：CCK-8 实验 48 h UCC 细胞活力百分比。与 T24 细胞正常培养比较，*P 0.01；与 T24 细胞+GC 化疗药物组比较，*P 0.01。第 10 期谢 峻，等EZH2 抑制剂与膀胱癌 GC 化疗药物联用增敏的作用研究71疗药物的效果显著。其中与对照组（34.471.888）和 GC 化 疗 组（43.001.128）相 比，T24 细 胞+UNC1999 5 M+GC 化疗药物实验组中的 G1 期在细胞周期中所占百分比（61.800.4504）最高，差异有统计学意义（P 0.01）。另外，Annexin V-FITC/PI 检测结果显示，在早期凋亡比例中，与对照组（5.7500.1721）和 GC 化疗组（9.8300.1970）相比，T24 细胞+UNC1999 5 M+GC 化疗药物组的早期凋亡比例所占百分比（20.081.519）最高，且差异有统计学意义（P 0.01），见图 6。2.5EZH2 抑制剂对小鼠体内 T24 细胞移植瘤生长与骨髓抑制毒副作用的影响为了更加明确 EZH2 抑制剂在体内可以提高膀胱癌 T24 细胞在 GC 化疗药物的敏感性，移植瘤图片，见图 7A。实验分为 5 组，分别为对照组（T24 细胞正常培养）、溶媒缓冲液组（T24 细胞+100 L EZH2 抑制剂的溶媒缓冲液）、GC 化疗组（T24 细胞+GC 化疗组）、UNC1999 EZH2 抑制剂组（T24 细胞+UNC1999）与 UNC1999+和 GC 化疗组联用组（T24 细胞+UNC1999+GC 化疗）。结果显示，与单纯 GC 化疗组 2 周（0.27740.1031）g与 4 周（0.30190.04998）g 瘤体重量相比，GC 化疗与 UNC1999 EZH2 抑制剂联用组 2 周（0.20990.04483）g 与 4 周（0.21290.01886）g 瘤体重量减小，差异有统计学意义（P 0.05），见图 7B。免疫组化染色法检测结果，见图 7C。血常规检测结果，见图 7D。与单纯 GC 化疗组相比，GC 化疗与 UNC1999 EZH2 抑制剂联用组的红细胞 2 周（7.6870.4564）109/L 和 4 周（7.2770.4024）109/L、白细胞 2 周（4.7770.4641）109/L 和 4 周（4.1630.4271）109/L 与血小板 2 周（675.2对照组T24 细胞+GC 化疗药物T24 细胞+si EZH2 转染+GC 化疗药物T24 细胞+GSK126 5 M+GC 化疗药物T24 细胞+UNC1999 5 M+GC 化疗药物T24 细胞+EI1 5 M+GC 化疗药物T24 细胞+DZNep1 5 M+GC 化疗药物T24 细胞+EPZ005687 5 M+GC 化疗药物AB*300250200150100500细胞克隆数/个T24 细胞T24 细胞+GC 化疗药物T24 细胞+si EZH2 转染+GC 化疗药物T24 细胞+GSK126 5 M+GC 化疗药物T24 细胞+UNC1999 5 M+GC 化疗药物T24 细胞+EI1 5 M+GC 化疗药物T24 细胞+DZNep1 5 M+GC 化疗药物T24 细胞+EPZ005687 5 M+GC 化疗药物图4平板克隆形成实验检测使用 EZH2 抑制剂对膀胱癌 T24 细胞增殖的影响Fig.4EffectofusingEZH2inhibitorontheproliferationofbladdercancerT24cellsdetectedbyplatecloneformationassayA：对照组与 7 组实验组平板克隆形成实验；B：细胞克隆数统计图。T24 细胞+DZNep1 5 M+GC 化疗药物组与 T24 细胞正常培养比较，*P 0.01；T24 细胞+EPZ005687 5 M+GC 化疗药物组与 T24 细胞正常培养比较，*P 0.05。72昆明医科大学学报第 44 卷39.58）109/L 和 4 周（524.236.73）109/L 3 种血细胞数量均增加。以上实验结果表明，UNC1999EZH2 抑制剂与 GC 化疗药物联用可以相比于单用 GC 化疗药物更有效的抑制其体内膀胱癌 T24细胞的增殖与侵袭转移，与体外实验结果一致，并且可以有效减少骨髓抑制的毒副作用。3讨论膀胱癌是全球第十大最常见的癌症10。在膀胱癌中，UCC 是最常见的病理组织学类型11，最终导致死亡的原因主要归功于其病灶转移和复发。近几年药物治疗方面使用基于铂类化疗药物顺铂的 MVAC（甲氨喋呤、长春新碱、阿霉素、顺铂）化疗方案应用于临床以来，其治疗效果明显改善，并一直以来作为 UCC 化疗的标准一线方案也是肌层浸润性膀胱癌（muscle-invasive bladder cancer，MIBC）围手术期治疗的首选治疗方案。此外，膀胱内卡介苗免疫疗法或化学疗法被用作经尿道切除术后非肌层浸润性膀胱癌（non-muscle-invasivebladder cancer，NMIBC）的辅助治疗选择，以防止进展与复发11。所以近年来，随着普及铂类化疗药物的使用以及广泛应用分子靶向药物，在膀胱癌患者总体生存率方面也有所改善，并且迅速成为其热点研究领域归结于其精准的靶向治疗1213。自从新药 GC 联合应用于临床，该方案将成为治疗 UCC 的一线化疗方案，其逐渐取代 MVAC 方案的主要原因在于临床毒副作用方面 GC 要明显优于之前的 MVAC 方案，但化疗效果基本一致，基本吻合于国外同行报道结果14。然而，化疗过程中经常产生的主要毒副作用众所周知则为骨髓抑制，其中 2 种血细胞减少分别为白细胞与血小板较为容易发生。因此，进一步提升 UCC 治疗GC 方案的敏感性，降低药物使用剂量，对于UCC 患者具有重要意义。EZH2 是多梳抑制复合物（polycomb repressivecomplex 2，PRC2）的催化亚基，该催化亚基可使催化组蛋白 H3 赖氨酸（H3K27）甲基化15，该基因也为调控表观遗传的主要因子之一，并参与了组蛋白甲基化、EMT 等过程1516。EZH2 基因位于人类染色体 7q35