FABP4基因在3个贵州地方鸡种中多态性研究.pdf

492023.11试验研究0 引言脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白（FABP4）属于脂肪酸结合蛋白家族（FABPs）。Ockner R K等1于1972年在大鼠的小肠黏膜中首次发现脂肪酸结合蛋白家族。Spiegelman B M等2研究指出FABP4蛋白可积极调控动物机体内脂肪酸的合成与代谢。目前，在脂肪酸结合蛋白家族中作为肌内脂肪（IMF）候选基因的主要是FABP3和FABP43。王丹丹等4利用测序与酶切结合方法对鲁禽3号麻鸡FABP4基因SNP位点进行检测，揭示FABP4基因与鲁禽3号麻鸡生产性状具有强关联性。Liu 收稿日期：2023-08-24作者简介：何琦（1986-），男，硕士，畜牧师，研究方向：动物遗传育种与种质资源创新。*通信作者简介：杨红（1990-），女，硕士，研究方向：动物遗传育种与种质资源创新。何琦，郭勇，杨红FABP4基因在3个贵州地方鸡种中多态性研究J现代畜牧科技，2023，102（11）：49-52doi：10.19369/ki.2095-9737.2023.11.013HE Qi，GUO Yong，YANG HongPolymorphism and Bioinformatics Analysis of FABP4 Gene in Local Chickens of GuizhouJModern Animal Husbandry Science&Technology，2023，102（11）：49-52FABP4基因在3个贵州地方鸡种中多态性研究何琦1，郭勇2，杨红3*（1.贵州省贵阳市花溪区农业农村局，贵州 贵阳 550025；2.贵州黄牛产业集团科技服务有限公司，贵州 贵阳 550025；3.贵州省毕节市畜牧站，贵州 毕节 551700）摘要：为系统筛查贵州地方鸡FABP4基因多态性。该试验以3个贵州地方鸡种（高脚鸡、百宜黑鸡和乌蒙凤鸡）为研究对象，构建品种DNA池，PCR扩增FABP4基因所有外显子及部分内显子区域，采用直接测序结合生物信息技术检测FABP4基因多态性。结果显示，在3个贵州地方鸡资源群体中共发现C51T和T1751C 2个SNPs位点，其中C51T位于第一外显子区，属于同义突变位点；等位基因频率估算发现，C51T位点在3个地方鸡种中多态丰度较高，T1751C位点在群体中多态丰度低；生物信息学得出，C51T位点突变后，鸡FABP4基因mRNA二级结构发生变化，自由能提升，稳定性降低。该试验成功挖掘出贵州地方鸡FABP4基因外显子及部分内含子区域变异位点，以期为贵州地方鸡分子标记开发利用提供参考。关键词：贵州地方鸡种；FABP4基因；多态性中图分类号：S831文献标识码：Adoi：10.19369/ki.2095-9737.2023.11.013Polymorphism and Bioinformatics Analysis of FABP4 Gene in Local Chickens of GuizhouHE Qi1，GUO Yong2，YANG Hong3*（1.Agriculture and Rural Bureau of Huaxi District，Guiyang Guizhou 550025，China；2.Guizhou Cattle Industry Group Science Technology Service Co.,Ltd，Guiyang Guizhou 550025，China；3.Bijie City Animal Husbandry Station，Bijie Guizhou 551700，China）Abstract：In order to explore the polymorphisms of FABP4 gene among three breeds of chicken in GuizhouThis experiment build DNA pools for three species（Gaojiao chicken，Baiyi black chicken and Wumeng Crested chicken），amplify all exons and some introns of FABP4 gene by PCR and detected the polymorphism of FABP4 gene by direct sequencing combined with biological information technologyThe results showed that two SNP loci（C51T and T1751C）were found in three breeds of chicken in Guizhou，one of which C51T was located in the first exon region and belonged to the synonymous mutation siteThe allele frequency estimation found that the C51T has higher polymorphic abundance in three chicken breeds，and the T1751C was less polymorphic abundanceUsing bioinformatics software analysis，it was found that after the C51T site mutation，the minimum free energy of FABP4 gene mRNA was improvedand and the stability was decreasedThis study successfully screened the SNPs at all exons and some introns of FABP4 gene，and provide references for the development and utilization of molecular markers in local chicken in GuizhouKeywords：local chickens of Guizhou，FABP4 gene，polymorphism50 2023.11试验研究L等5通过构建快速生长AA（Arbor Acres）鸡和慢速生长北京地方鸡基因表达谱，利用微阵列分析，发现与脂肪生成相关的基因转录本中，FABP4基因表达水平在快速生长型鸡胸肌组织中显著高于生长缓慢型鸡种，印证了FABP4基因可促进快速生长型鸡胸肌中IMF沉积。贵州地方鸡种多以自然觅食为主，粗粮为辅的饲养方式饲喂，具有肉质鲜美、耐粗饲和抗病性能强等特点6-7。目前，针对贵州地方鸡种FABP4基因多态位点分析鲜有报道。本试验选择高脚鸡、百宜黑鸡和乌蒙凤鸡3个贵州代表性地方鸡种为研究对象，利用品种DNA混池结合PCR产物直接测序法对FABP4基因SNPs位点进行挖掘，分析变异位点的遗传变异分布，以期寻找与地方鸡肉质性状相关的遗传标记，为贵州地方鸡种的分子选育提供基础数据。1 材料与方法1.1 试验动物采集高脚鸡、百宜黑鸡和乌蒙凤鸡抗凝血各80管，实验室提取基因组DNA，-20保存备用。高脚鸡、百宜黑鸡和乌蒙凤鸡血液样品分别采自贵州省普定县硝洞高脚鸡保种场、贵阳市百宜乡百宜黑鸡核心产区和六盘水市金凤栖自然牧业有限公司乌蒙凤鸡保种扩繁场。1.2 主要试剂和仪器主要试剂：琼脂糖、2Taq Master Mix、核酸染料、DL2000-Marker均购自生工生物工程（上海）股份有限公司。主要仪器：凝胶成像仪（BioSens SC 710），购自上海山富科技仪器有限公司；PCR仪（BIO-RAD C1000 TouchTM Thermal Cy-cler），购自美国BIO-RAD公司；紫外分光光度（UItrospec 2100pro），购自英玛西亚中国有限公司。1.3 引物设计与合成根据NCBI上GenBank数据库中鸡 FABP4基因序列（登录号：NC_006089.5），利用Primer Premier 5.0对鸡FABP4基因第14外显子区序列进行引物设计。引物序列见表1，所有引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。表1 FABP4基因引物序列及参数引物名称引物序列（53）退火温度（）片段长度（bp）F1F：TAGGGGAGGAAGGAAAACAC58417R：TGACAACGCTAATCCAAACAF2F：AAATAGAAAGGGATGGGGAG54352R：GTGGATGTCAAAACAGCAACF3F：TCCACTCTTGAAATGCTGCCT57330R：ATTCCCCGTGTTTGAATCCAGF4F：ATGCTCCTTGGGTGTTCC53552R：GCCCGTTCTGACTAATGC注：F1F4引物：分别扩增FABP4基因14个外显子区域。1.4 PCR反应体系及条件 PCR扩增采用25 L反应体系，反应体系如下，2Es Taq MasterMix 12.5 L，ddH2O 8.5 L，上下游引物各1 L，模板DNA 2 L。反应条件为94 预变性2 min；94 变性30 s、退火30 s，72 延伸30 s，35个循环；72 终延伸2 min，PCR扩增产物4 保存，经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，挑选特异性好的PCR产物送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。1.5 变异位点筛选及等位基因频率估算鸡FABP4基因原序列与测序峰图运用Megalign和Seqman软件进行序列比对分析，确定SNPs位点。使用MWsnap3.0软件测量各SNPs等位基因的相应高度，等位基因频率计算公式：Fi=Hi/（H1+H2）（i=1，2）。式中，Fi表示SNP位点等位基因频率，H1、H2表示等位基因在测序峰图上的高度。1.6 mRNA二级结构分析采用在线生物信息学分析软件RNAfold WebServer对鸡FABP4基因突变前后的mRNA二级结构进行预测分析。2 结果2.1 PCR扩增3个贵州地方鸡种FABP4基因第14外显子PCR扩增产物长度分别为417、352、330、552 bp。由图1可知，扩增目的片段与预期片段大小相符，条带整齐、无拖尾，可用作下一步测序。图1 FABP4基因PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳检测结果M：DL2000 DNA Marker；16：F1引物扩增产物；712：F2引物扩增产物；1318：F3引物扩增产物；1924：F4引物扩增产物417 bp352 bp1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 M2 000 bp1 000 bp750 bp500 bp250 bp100 bp552 bp330 bpM 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 242 000 bp1 000 bp750 bp500 bp250 bp100 bp512023.11试验研究2.2 序列比对与SNP位点挖掘 将测序结果与NCBI上GenBank数据库中鸡 FABP4基因序列进行对比。由图2可知，共发现2个SNPs位点。以FABP4基因第1外显子区第一个碱基为+1，分别将发现的SNP位点命名为C51T（转换）和T1751C（转换）；其中，C51T位于第一外显子区，为同义突变位点；T1751C位于第二内含子区域。图2 不同贵州地方鸡FABP4基因2个SNPs位点测序比对峰图2.3 等位基因频率估算通过MWsnap3.0软件标尺对2个SNPs位点峰高进行测量，并根据等位基因频率计算公式进行频率估算，结果见表2。C51T位点在3个贵州地方鸡种中C和T等位基因频率值相近，尤其在百宜黑鸡和乌蒙凤鸡群体中多态含量最丰富；T1751C为非编码区SNP位点，在高脚鸡、百宜黑鸡和乌蒙凤鸡中T和C等位基因频率值存在差异，均呈现出T等位基因频率高于C，以乌蒙凤鸡最为明显。表2 贵州地方鸡FABP4基因变异位点等位基因频率估算SNP高脚鸡百宜黑鸡乌蒙凤鸡C51TC（0.60）T（0.40）C（0.51）T（0.49）C（0.53）T（0.47）T1751CT（0.75）C（0.25）T（0.77）C（0.23）T（0.84）C（0.16）2.4 FABP4基因突变前后的mRNA二级结构预测贵州地方鸡FABP4基因突变前后mRNA二级结构预测结果，见图3。FABP4基因编码区突变位点C51T可导致mRNA二级结构发生改变，C51T位点突变后，自由能由-569.693 KJ/mol变为-568.145 KJ/mol，突变后，自由能值增加了1.548 KJ/mol，mRNA自由能升高，稳定性降低。图3 鸡FABP4基因C51T位点突变前后mRNA二级结构3 讨论FABPs蛋白可以促进脂类产生与降解，尤其以FABP4基因在能量代谢和细胞内脂肪酸调节作用明显8。周志楠等9研究得出FABP4基因在巨型玫瑰冠鸡脂肪组织呈现高表达。张梅10针对巨型玫瑰冠鸡FABP4基因时序表达图谱进行构建，发现FABP4基因mRNA表达水平与肌肉组织中IMF呈显著正相关递增。吴琼等11发现中国环颈雉鸡FABP4基因AF1位点存在C到T单碱基突变，该位点AA基因型个体胸肌IMF含量显著高于BB基因型个体（P0.05），这证实了FABP4基因在IMF沉积的具有重要作用。本研究通过构建品种DNA池结合直接测序法在3个贵州地方鸡FABP4基因中共筛选得到C51T和T1751C 2个变异位点，并未在该基因第1 805位点（位于第3外显子区）筛查出SNP位点，与屠云洁等12研究报道相悖，该学者应用PCR-RFLP技术在尤溪麻鸡、鹿苑鸡、隐性白羽鸡3个鸡种FABP4基因第1 805位点处存在突变前突变后52 2023.11试验研究SNP位点，可导致脯氨酸转变为丝氨酸。分析其原因可能为尤溪麻鸡、鹿苑鸡、隐性白羽鸡与贵州地方鸡种地理位置及生存环境不同，亲缘关系远，导致品种间基因变异位点差异度大。针对本试验筛选出的C51T位点，该位点已在白耳鸡FABP4基因多态性研究中已有报道，张学余等13发现白耳鸡FABP4基因外显子1存在单核苷酸突变位点C51T，该位点与H-FABP基因内含子2区域单核苷酸突变位点C1523T，突变产生的3种基因型（TT/TC/CC）中，TT是2种有利单基因型，对胸肌IMF含量具有显著提高，并显著高于高于其他基因型聚合个体。尽管C51T为同义突变位点，虽不能改变氨基酸序列，但变异位点对单个碱基置换后，鸡FABP4基因mRNA自由能升高，稳定性降低。毛圆辉14发现mRNA可通过二级结构稳定性的变化调节翻译过程，表现为与蛋白质表达量呈显著正相关。鉴于mRNA二级结构稳定性与蛋白质表达量正相关关系，推测当C51T位点突变后，鸡FABP4基因mRNA翻译效率发生改变，降低FABP4蛋白表达水平，抑制了体内肌肉组织中脂肪沉积速率，进而影响畜禽屠宰肉质性能。等位基因频率估算发现，C51T位点在贵州高脚鸡、百宜黑鸡和乌蒙凤鸡资源群体中均呈现出丰富的多态性，多态信息含量高，便于后期有利基因型的定向选育。综合分析，针对C51T位点重要性，后期课题组将加快对C51T位点与贵州地方鸡屠宰肉质性能的关联分析，验证其开发利用价值。参考文献1Ockner R K，Manning J A，Poppenhausen R B，et alA binding protein for fatty acids in cytosol of intestinal mucosa，liver，myocardium，and other tissues JScience，1972，177（4 043）：56-582Spiegelman B M，Frank M，Green HMolecular cloning of mRNA from 3T3 adipocytesRegulation of mRNA content for glycerophosphate dehydrogenase and other differentiation-dependent proteins during adipocyte 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