eEF-2K基因沉默对肝癌细胞增殖、侵袭和凋亡的影响.pdf

Journal of Inner Mongolia Medical UniversityJune.2023Vol.45No.3eEF-2K基因沉默对肝癌细胞增殖、侵袭和凋亡的影响（1.内蒙古医科大学 分子病理学重点实验室，内蒙古呼和浩特010059；2.首都医科大学附属北京世纪坛医院，北京100038；3.解放军总医院 第一医学中心，北京100853）【摘要】目的 检测eEF-2K基因在肝细胞癌（HCC）组织内的表达并分析其表达水平对HCC细胞增殖、侵袭和凋亡的影响。方法 用RT-qPCR和Western Blot检测了64例肝癌组织及癌旁肝组织，5种HCC细胞系LM3、Hep3B、Huh7、97H、HepG2及人正常肝细胞系 LO2中eEF-2K基因在mRNA及蛋白水平的表达。用eEF-2K 特异性siRNA沉默LM3及Hep3B细胞性中eEF-2K基因后，经qPCR检测确认。随后用CCK-8、Transwell方法及流式细胞技术检测eEF-2K基因沉默对增殖、侵袭与凋亡的影响。结果 相较癌旁组织，HCC组织内eEF-2K mRNA与蛋白表达显著上调，差异有统计学意义（P0.05）；与正常人肝细胞系LO2相比，肝癌细胞系LM3、Hep3B、97H、HepG2、Huh7中的eEF-2K mRNA和蛋白表达分别升高，差异有统计学意义（P0.05）。在LM3及Hep3B细胞系中用特异性siRNA沉默eEF-2K后，与非特异性siRNA对照组相比，细胞增殖活性和侵袭能力显著降低（P0.05），凋亡率显著升高，差异有统计学意义（P0.05）。TCGA数据库分析结果表明eEF-2K高表达与肝癌预后不良相关，差异有统计学意义（P0.05）。结论eEF-2K蛋白在肝癌组织和细胞中高表达且与预后不良相关；沉默eEF-2K后肝癌细胞增殖和侵袭能力降低并诱发凋亡，提示eEF-2K可用作HCC潜在的预后标志物和治疗靶点。【关键词】肝细胞癌；eEF-2K；siRNA；增殖；侵袭；凋亡中图分类号：R363.1文献标识码：A文章编号：2095-512X（2023）03-0240-06肖瑞雪1，路帅2，杨鹏辉3，康毅敏1*收稿日期：2022-09-12；修回日期：2023-04-20基金项目：内蒙古医科大学致远人才计划治学人才团队项目（ZY0130011）第一作者：肖瑞雪（1989），女，2019级硕士研究生。E-mail:*通信作者：康毅敏，男，硕士，副教授，硕士研究生导师。研究方向：分子病理学。E-mail:【Abstract】Objective To detect the expression level of eEF-2K in hepatocellular carcinoma(HCC)and the effect of itssilencing on proliferation,invasion and apoptosis of HCC cells.Methods RT-qPCR and Western Blot were used to examinethe expression of eEF-2K gene at mRNA and protein levels in HCC and their adjacent liver tissues resected from 64 HCC pa-tients,as well as in five HCC lines(LM3,Hep3B,Huh7,97H,HepG2)and normal human liver cell line LO2.LM3 and Hep3bcellsweretransfectedwitheEF-2Kspecificandnon-specificsiRNAsrespectively.ThesilencingofeEF-2KgeneaftersiRNAtrasfection in LM3 and Hep3B cell lines was confirmed by RT-qPCR.The effect of silencing of eEF-2K gene on proliferation,invasionandapoptosisofHCCweredetectedbyCCK-8assay,Transwellassayandflow-cytometry.Results TheexpressionofeEF-2K was significantly up-regulated both at mRNA and protein levels in HCC tissues as well as in LM3,HEP3B,97H,Hepg2,Huh7 lines compared to the expressions in adjacent tissues(P0.05)and in normal LO2 line(P0.05).The prolifera-tion rates of eEF-2K-silenced groups were decreased compared to control group(P 0.05),and the percentages of transmem-EFFECTS OF eEF-2K GENE SILENCING ON PROLIFERATION,INVASION AND APOPTOSIS OF HEPATOCELLULARCARCINOMA CELLSXIAO Ruixue1，LU Shuai2，YANG Penghui3，KANG Yimin1*(1.Key Laboratory of Molecular Pathology,Inner Mongolia Medical University,Hohhot 010059,China；2.Beijing Shijitan Hospital of Capital Medical University,Beijing 100038,China；3.The First Medical Center,PLA General Hospital，Beijing 100853,China）240内蒙古医科大学学报2023 年 6 月第 45 卷第 3 期brane cells in eEF-2K-silenced groups groups were decreased compared to control group(P0.05).Silencing of eEF-2K bysiRNA also led to increased apoptosis in HCC(P 0.05).The analysis of TCGA database showed that the high expression ofeEF-2K was associated with poor prognosis of HCC(P0.05).Conclusions eEF-2K was highly expressed in HCC tissuesand cell lines,which is associated with poor prognosis.Knock-down of eEF-2K gene by siRNA inhibited the proliferation andinvasion ability,and induced apoptosis in HCC cells.This study provided evidence that eEF-2K is potential prognostic markerandtherapeutictargetforHCC.【Keywords】Hepatocellular carcinoma；eEF-2K；siRNA；Proliferation；Invasion；Apoptosis肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是全球第六大常见癌症。由于HCC起病隐匿，大多数患者在确诊时已处于疾病的中晚期，从而错过了手术切除的最佳时期1。手术治疗是目前公认最有效的肝癌治疗方法，但即使接受手术治疗，患者5年总体生存率仍低于10%2。临床症状出现晚是诊断晚、预后差的原因。靶向基因疗法为现今HCC治疗的研究主流之一，而HCC分子发生机制则是此疗法的基础3。鉴定可靠的 HCC 生物标志物尤为重要，筛选HCC的新靶点和相应的药物是此领域医学研究的一项重要任务4。真核延伸因子2激酶（eEF-2K）属于非典型-激酶家族，是一类进化方面具有保守性的蛋白质合成调节剂5，对于信使RNA（messengerRNA，mRNA）翻译的延伸阶段施以负向调控，由此对蛋白质合成进行调节。eEF-2K参与多种信号通路，具有调节细胞周期、增殖、凋亡、自噬、侵袭和糖酵解的功能。eEF-2K在癌细胞的迁移与存活及肿瘤发展方面发挥着关键作用。eEF-2K的功能异常使肿瘤细胞适应微环境条件，包括缺氧、营养耗竭和酸中毒6，因而与肿瘤的形成、迁移与侵袭具有相关性6，相当于癌基因的作用7。目前的研究已证明8，eEF-2K在乳腺癌、胰腺癌、肺癌和脑肿瘤等癌细胞中表达上调且其高表达与乳腺癌、胰腺癌和肺癌患者的总体生存率较低有关，被认为是治疗这些癌症的一个新兴分子靶点。但其在HCC中的表达水平及作用研究尚少。因此，本研究拟探索eEF-2K基因在人肝癌细胞中的表达情况，并利用RNA干扰（RNA interference，RNAi）技术沉默eEF-2K基因后观察对HCC细胞增殖、侵袭和凋亡的影响，旨在为临床HCC新疗法的开发提供更多参考。1材料与方法1.1TCGA数据分析eEF-2K在肝癌中表达与远期生存（overall survival，OS）的相关性使用 TCGA 数据（https：/xena.ucsc.edu）肝癌样本，共计424例，其中374例肝癌样本、50例正常样本。分析 eEF-2K 在肝癌组织中表达的临床意义，eEF-2K表达与远期生存的相关性分析数据来源于Kaplan-Meier数据库（https：/ LO2均由中国人民解放军第五医学中心感染病医学部研究提供。1.3主要试剂和仪器DMEM、MEM和血清购于北京百普赛斯公司；CCK8购于日本同仁公司；eEF-2K siRNA 由上海吉玛公司合成；Annexin V-FITC凋亡试剂盒购于南京诺唯赞公司；eEF-2K一抗及二抗均购于美国Abcam公司；-actin一抗及二抗均购于北京华兴博创公司；ECL化学发光底物试剂盒为北京华兴博创公司产品；PowerUp SYBR Green 预混液为赛默飞公司产品；RIPA裂解液、TRIzol Reagent皆为北京华兴博创公司产品；逆转录试剂盒为北京全式金公司产品；Lipofectamine2000 为北京索莱宝公司产品。二 氧 化 碳 培 养 箱、实 时 荧 光 定 量 qPCR 仪（QuantStudio 6 Flex）皆为Thermo Fisher公司（美国）产品；双稳定时电泳仪（DYY-6C型）为北京六一仪器厂产品；倒置显微镜（Ti-s）为日本尼康公司产品；全功能酶标仪（Synergy H4）为美国BIO-TEK公司产品；流式细胞仪（facscantoii）为美国BD公司产品；全自动化学发光（5200 Multi）为上海天能公司产品；微量核酸浓度测定仪为美国Pultton Technology公司产品。1.4实验分组及细胞的培养LM3、Hep3B这两类细胞分别划分成以下3组：siRNA#1 组、siRNA#2 组，以及非特异性 siRNA 对照组（si-NC 组），分别转染 si-eEF-2K#1 7.5 L 241Journal of Inner Mongolia Medical UniversityJune.2023Vol.45No.3（20p mol/L）/si-eEF-2K#2 7.5 L（20p mol/L）与si-NC7.5 L（20p mol/L）。肝癌 LM3 和 Hep3B 细胞分别培养于含10%血清的DMEM和含10%血清的MEM培养基中，在37、5%CO2孵箱中培养。1.5siRNA合成和转染siRNA 由上海吉玛公司合成，基于转染试剂（Lipofectamine TM2000）说明书所示，分别通过培养基DMEM、MEM对LM3、Hep3B进行重悬处理，先调节细胞浓度，再向6孔板内植入，接着移至孵箱内，在 37 下培养一整夜。将 si-eEF-2K#1、si-eEF-2K#2、si-NC分别瞬时转染LM3细胞和Hep3B细胞，培养24 h后进行检测。具体序列见表1。1.6实时荧光定量 PCR 检测转染eEF-2K siRNAs后肝癌细胞中eEF-2K mRNA表达以“1.4”分组进行细胞培养及转染，细胞在转染24 h时加入 Trizol。通过氯仿、异丙醇（IPA）等进行总RNA的提取。基于逆转录试剂盒说明书所示步骤进行加样，25下计时5min；42下计时30min；85 下计时5 s，结束反应。在RT-qPCR反应方面，基于人 eEF-2K 序列，对 RT-PCR 引物进行设计。eEF-2K 上游引物是：5 CAGCTCTGGACGGG-TATGTG 3，下游引物是：5 CCCCAAAATG-GACTTCCCGA 3;GAPDH 上游引物是：5 GGTGGTCTCCTCTGACTTCAACA 3，下游引物是：5 GTTGCTGTAGCCAAATTCGTTGT 3。扩增条件：50 下2 min升温，95 下10 min变性；95 下计时15 s，60 下计时1 min，重复 40 个循环。对于Real-Time PCR所得数据，经由2-Ct法开展分析。1.7蛋白质印迹分析检测HCC患者组织及转染eEF-2K siRNAs后肝癌细胞中eEF-2K 蛋白的表达采用RIPA裂解液提取细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。取各样本等量蛋白进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，湿转将蛋白转移至PVDF膜。BSA室温封闭 1 h 后，分别孵育 eEF-2K（1：1000）或者-actin（1 1500）一抗4 过夜。洗膜后，室温孵育二抗1 h。采用ECL发光液检测蛋白条带，-actin为内参。1.8CCK8细胞增殖-毒性检测试剂盒检测eEF-2K siRNAs对肝癌细胞增殖的影响基于“1.4分”组开展细胞培养与转染，将LM3、Hep3B细胞转移至96孔板内，各孔植入量皆为5103个，各孔培养基皆为0.2 mL。各组设置5个复孔，先转染，再分别培养 0.5 d、1 d、2 d，接着向各孔添加0.01 mL的CCK8溶液（10 mg/mL），进行2 h培养，借助酶标仪对OD值展开测定，测定波长是450 nm。1.9Transwell检测eEF-2K siRNAs对肝癌细胞侵袭的影响取转染后培养 2 d 的各组分细胞，胰蛋白酶（trypsin）消化，制备细胞悬液，将细胞浓度调节成1105个/mL，向 Transwell 小室上室（铺有 Matrigel胶）内接种，同时将0.8 mL完全培养基添加至下室内，于37 下进行2 d培养，将上室培养液清理掉，通过棉签将未迁移的细胞以及残留的Matrigel胶擦除掉，多聚甲醛（POM）固定 30 min，结晶紫溶液（0.1）染色20 min，借助倒置显微镜查看各组细胞的侵袭状况。1.10流式细胞仪检测eEF-2K siRNAs 对肝癌细胞凋亡的影响基于“1.4”分组开展细胞培养与转染，收集转染24 d后的各组细胞，通过预冷的PBS对细胞实施2遍洗涤，每遍的温度、速度与时间皆为4、1000 rpm、5 min，将上清倒掉。添加 0.1 mL 的 Binding Buffer（1），小心吹匀，得到单细胞悬液。将 5 L An-nexin V-FITC和5 L PI Staining Solution加进去，轻轻吹匀；遮光、室温下进行 10 min 孵育；接着添加0.4 mL的Binding Buffer（1），小心混合均匀。待完成染色，样品于60 min内借助流式细胞仪测定，通过软件Flow J对数据展开处理。2实验结果2.1TCGA数据库中eEF-2K在HCC组织内高表达且与总生存期呈负相关。相较于癌旁组织，HCC 组织内 eEF-2K mRNA与蛋白表达上调，表现出显著区别（*P0.05，如图1A、1B所示）。TCGA数据分析结果表明eEF-2K高表达与肝癌患者生存率呈负相关（*P0.05，见图1C）。基因名称si-eEF-2K#1si-eEF-2K#2si-NC正义链GGAAGAUAUUGCCACCGAATTCCUGGAAGUGCAAAGGCUUTTUUCUCCGAACGUGUCACGUTT反义链UUCGGUGGCAAUAUCUUCCTTAAGCCUUUGCACUUCCAGGTTACGUGACACGUUCGGAGAATT表1靶向沉默eEF-2K siRNA核苷酸序列Tab.1 TargetedsilencingofeEF-2KsiRNAnucleotidesequences 242内蒙古医科大学学报2023 年 6 月第 45 卷第 3 期2.2eEF-2KsiRNA在不同HCC细胞系内的表达状况与正常肝细胞系LO2相比，HCC细胞系中LM3和Hep3B的eEF-2K mRNA表达显著升高，差异有统计学意义（*P0.05，见图2A）。与正常肝细胞株LO2相比，LM3和Hep3B两种HCC细胞系中的eEF-2K蛋白水平较高，差异有统计学意义（*P0.05，见图2B）。2.3eEF-2K siRNAs 在肝癌细胞中的沉默效率在LM3、Hep3B细胞内，相较于转染si-NC组，si-eEF-2K#1和si-eEF-2K#2降低了eEF-2K mRNA和蛋白的表达，差异具有统计学意义（*P0.05，见图3）。ABC图1eEF-2K在肝癌组织中的表达及生存分析Fig.1Expression and survival analysis of eEF-2K inliver cancer tissue（A.通过RT-qPCR检测64例患者HCC样本和配对的癌旁组织中eEF-2K的mRNA水平；B.通过蛋白质印迹分析确定2例HCC患者组织中eEF-2K蛋白水平。T代表HCC组织，P代表癌旁组织。-肌动蛋白用作内参照（左图：典型蛋白印迹结果，右图：3次蛋白印迹结果灰度与内参调定之后相对值的量化图）；C.TCGA数据分析eEF-2K在肝癌中表达与远期生存的相关性。Tumor:肝癌组织，Para-carcinoma:癌旁正常肝组织）（A.Detection of eEF-2K mRNA levels in HCC samples from64 patients and paired adjacent cancer tissues using RT qPCR;B.Determine the levels of eEF-2K protein in the tissues of two HCCpatients through Western Blot analysis.T represents HCC tissue,and P represents paracancerous tissue.-actin is used as internalreference(left:typical protein imprinting results,right:quantita-tive diagram of the gray scale of three protein imprinting resultsand the relative value after internal parameter setting);C.TCGAdata analysis of the correlation between eEF-2K expression andlong-term survival in liver cancer.Tumor:Liver cancer tissue,Pa-ra-carcinoma:Normallivertissueadjacenttocancer）图2eEF-2K在不同肝癌细胞系中的表达情况Fig.2Expression of eEF-2K in different liver cancercell linesA.通过RT-qPCR检测正常肝细胞系LO2和5种HCC细胞系（LM3、Hep3B、Huh7、97H、HepG2）中 eEF-2K mRNA 表达水平；B.通过蛋白质印迹分析正常肝细胞系LO2和5种HCC细胞系（LM3、Hep3B、Huh7、97H、HepG2）中eEF-2K 蛋白水平（上图：典型蛋白印迹结果，下图：3次蛋白印迹结果灰度与内参调定之后相对值的量化图）A.Detection of eEF-2K mRNA expression levels in normalliver cell line LO2 and five HCC cell lines(LM3,Hep3B,Huh7,97H,HepG2)using RT qPCR;B.Analysis of eEF-2K protein lev-els in normal liver cell line LO2 and 5 HCC cell lines(LM3,Hep3B,Huh7,97H,HepG2)using Western blot analysis(Upper:Typical Western blot results,Below:Quantification of relative val-uesafterthreeWesternBlotresultsandinternalparametersettings)AB图3在不同肝癌细胞中转染eEF-2K siRNAs后eEF-2K表达变化Fig.3Changes in eEF-2K expression after transfectionwith eEF-2K siRNAs in different liver cancer cellsA、B：在LM3细胞中转染eEF-2K siRNA后，各分组中eEF-2K mRNA和蛋白的表达情况；C、D：在Hep3B细胞中转染eEF-2K siRNA后，各分组中eEF-2K mRNA和蛋白的表达情况（其中B、D中上图：典型蛋白印迹结果，下图：3次蛋白印迹结果灰度与内参调定之后相对值的量化图）A.B:The expression of eEF-2K mRNA and protein in eachgroup after transfection with eEF-2K siRNA in LM3 cells;C.D:Expression of eEF-2K mRNA and protein in each group aftertransfection with eEF-2K siRNA in Hep3B cells(where B,D,topfigure:typical protein blotting results,bottom figure:quantificationof gray scale and relative values after internal parameter setting ofthreeproteinblottingresults)ABCD 243Journal of Inner Mongolia Medical UniversityJune.2023Vol.45No.32.4降低eEF-2K表达可降低LM3和Hep3B细胞增殖在LM3细胞和Hep3B细胞中，与转染si-NC组相比，转染 siRNA 12 h、24 h、48 h时细胞增殖活性显著降低，差异有统计学意义（*P0.05，见图4）。2.5降低eEF-2K表达可抑制LM3和Hep3B细胞侵袭相较于转染si-NC组，转染 siRNA后，si-eEF-2K#1 和si-eEF-2K#2 组均降低了 LM3 和Hep3B 细胞的侵袭能力，差异有统计学意义（*P0.05，见图4）。2.6 降低eEF-2K表达促进LM3和Hep3B细胞凋亡与转染si-NC组相比，LM3和Hep3B转染siR-NA后，si-eEF-2K#1和si-eEF-2K#2组中细胞凋亡率明显增加，差异有统计学意义（*P0.05，见图5）。3讨论HCC的发生发展是一个多基因、多步骤参与的复杂活动9。尽管分子靶向药物等全身治疗方法取得了很大进展，但HCC由于耐药和频繁复发转移，是预后较差的肿瘤之一10。越来越多的研究人员开始关注RNA干扰（RNA interference，RNAi）、小分子干 扰 RNA 片 段（small interfering RNA，siRNA）。siRNA能够使基因mRNA被双链RNA分子敲除，当前siRNA已经能被人工合成，它在基因治疗和基因功能研究中有着广泛应用11。相关研究已经观察到各种肿瘤细胞中eEF-2K的高表达，抑制这种激酶的活性会降低肿瘤细胞的活力12。最近的一些研究表明eEF-2K在促进肿瘤细胞迁移和侵袭中也起着重要作用13。研究表明13eEF-2K可以通过PI3K/Akt和STAT3促进肝细胞癌血管生成。Bircan等14研究在不同的肺癌细胞系中转染两种不同序列的eEF-2K siRNA，抑制了肺癌细胞的增殖。本研究发现用siRNA技术沉默eEF-2K基因后肝癌细胞株增殖活性降低，随着转染时间延长，增殖活性逐渐降低，较si-NC组有显著区别，与上述其他肿瘤组织类型中的研究结论存在共性。这可能与细胞增殖的关键介质，包括NF-B和cyclin D1，它们在细胞增殖和分化中发挥重要作用有关15。Erdogan等16发现敲除eEF-2K可降低卵巢癌细胞的侵袭能力，靶标siRNA序列对eEF-2K的沉默显著抑制了HeyA8、SKOV3ip1和SKOV3-TR细胞的迁移和侵袭水平。本研究结果表明，eEF-2K siRNA组穿膜细胞数较siRNA-NC组低，表明沉默eEF-2K图4eEF-2K siRNAs 对不同肝癌细胞增殖和侵袭的影响Fig.4Effects of eEF-2K siRNAs on proliferation andinvasion of hepatocellular carcinoma cellsA、B：在LM3和Hep3B细胞中转染eEF-2K siRNA后，通过CCK8法测定12,24,48 h时各分组对细胞增殖活性的影响；C、D：转染eEF-2K siRNA后，各分组对LM3和Hep3B细胞侵袭的影响（其量化用柱状图表示）A、B:After transfection of eEF-2K siRNA in LM3 andHep3B cells,the effects of each group on cell proliferation activi-ty at 12,24,48 h were measured by CCK8 method.C、D:Effects ofeach subgroup on invasion of LM3 and Hep3B cells after trans-fection of eEF-2K siRNA(quantified by histogram)ABCDAB图5eEF-2K siRNA对不同肝癌细胞凋亡的影响Fig.5Effect of eEF-2K siRNA on apoptosis ofdifferent liver cancer cellsA.转染eEF-2K siRNA后，各分组对LM3细胞凋亡的影响；B.转染eEF-2KsiRNA后，各分组对Hep3B细胞凋亡的影响A.The effect of each group on LM3 cell apoptosis aftertransfection with eEF-2K siRNA;B.Effects of different groupson Hep3B cell apoptosis after transfection with eEF-2K siRNA 244内蒙古医科大学学报2023 年 6 月第 45 卷第 3 期基因后肝癌细胞侵袭能力降低。由于eEF-2K可能通过调节Src信号通路促进细胞迁移和侵袭，而Src信号是促进细胞迁移和侵袭的重要途径之一17，因此其分子机制可能是沉默eEF-2K基因表达可抑制癌基因信号因子转录，进而影响细胞迁移及侵袭能力，减少穿膜细胞数量。Ashour等18研究发现eEF-2K促进胰腺癌（Pa-Ca）细胞存活，其抑制可通过多种凋亡途径引发凋亡细胞死亡。下调eEF-2K可显著降低PANC-1和MIAPaCa-2细胞的活力，并通过受体介导的（外源性途径）、线粒体介导的（内源性途径）和aif介导的途径显著诱导细胞凋亡。本研究通过siRNA技术沉默eEF-2K基因后肝癌细胞株LM3和Hep3b的凋亡率明显增加，与si-NC组有显著差异，与上述结论一致，表明siRNA沉默eEF-2K基因表达可诱导肝癌细胞的凋亡，其确切的分子机制尚待进一步研究。本研究通过生物信息学分析及其体外实验表明，eEF-2K基因沉默会使肝癌细胞的增殖和侵袭能力降低，凋亡率升高，提示eEF-2K基因沉默能有效抑制肝癌的部分恶性生物学行为。因此它可能是肝癌的潜在治疗靶点，但其确切的分子机制及其在肝癌治疗方面的应用价值需要进一步深入研究。本研究仅在体外条件下分析了eEF-2K对肝癌细胞功能的影响，下一步我们会进一步扩大样本量进行验证，并且将eEF-2K基因敲除以后进行体内实验，进一步探索eEF-2K在肝癌发生发展中的相关机制。4结论本研究结果显示，eEF-2K在肝癌组织和不同肝癌细胞系中显著上调，特异性沉默eEF-2K基因表达可抑制肝癌细胞增殖及侵袭，促进肝癌细胞凋亡。参考文献1Song C，Zhang J，Wen R，et al.Improved anti-hepatocellularcarcinoma effect by enhanced Co-delivery of Tim-3 siRNA andsorafenib via multiple pH triggered drug-eluting nanoparticlesJ.Mater Today Bio，2022，16：1003502王学斌，董勤.原发性肝癌行肝癌根治术前后循环肿瘤细胞（CTC）、血清甲胎蛋白（AFP）测定值变化分析J.内蒙古医科大学学报，2022，44（2）：139-1423Mantovani S，Oliviero B，Lombardi A，et al.Deficient naturalkiller cell NKp30-mediated function and altered NCR3 splicevariants in hepatocellular carcinomaJ.Hepatology，2019，69（3）：1165-11794Liu X，Li J，Yu Z，et al.miR-935 promotes liver cancer cellproliferation and migration by targeting SOX7J.Oncol Res，2017，25（3）：427-4355Das JK，Ren Y，Kumar A，et al.Elongation factor-2 kinase isa critical determinant of the fate and antitumor immunity of CD8（+）T cellsJ.Sci Adv，2022，8（5）：eabl97836Zhang B，Zou J，Zhang Q，et al.Progress in the developmentof eukaryotic elongation factor 2 kinase（eEF2K）natural productand synthetic small molecule inhibitors for cancer chemotherapyJ.Int J Mol Sci，2021，22（5）：24087Li S，Li Y，Bai Y.What is the impact of eukaryotic elongationfactor 2 kinase on cancer：a systematic reviewJ.Eur J Phar-macol，2019，857：1724708Comert OF，Durdagi S，Sahin K，et al.Design，Synthesis，andMolecularModelingStudiesofNovelCoumarinCarboxamideDerivatives as eEF-2K InhibitorsJ.J Chem Inf Model，2020，60（3）：1766-17789Zhang Y，Tao R，Wu SS，et al.TRIM52 up-regulation inhepatocellular carcinoma cells promotes proliferation，migrationand invasion through the ubiquitination of PPM1AJ.J ExpClin Cancer Res，2018，37（1）：11610Oura K，Morishita A，Tani J，et al.Tumor Immune Microenvi-ronment and Immunosuppressive Therapy in HepatocellularCarcinoma：A ReviewJ.Int J Mol Sci，2021，22（11）：580111刘洋，陈立军，靳秋月，等.STAT3-siRNA表达载体对肝癌细胞pim-2基因表达的影响J.内蒙古医科大学学报，2021，43（3）：301-30412Yu P，Wang HY，Tian M，et al.Eukaryotic elongation factor-2kinaseregulatesthecross-talkbetweenautophagyandpyroptosisin doxorubicin-treated human melanoma cells in vitroJ.ActaPharmacol Sin，2019，40（9）：1237-124413Zhou Y，Li Y，Xu S，et al.Eukaryotic elongation factor 2kinase promotes angiogenesis in hepatocellular carcinoma viaPI3K/AktandSTAT3J.IntJCancer，2020，146（5）：1383-139514Bircan HA，Gurbuz N，Pataer A，et al.Elongation factor-2kinase（eEF-2K）expression is associated with poor patientsurvival and promotes proliferation，invasion and tumor growthof lung cancerJ.Lung Cancer，2018，124：31-3915Chen F，Castranova V，Shi X.New insights into the role ofnuclear factor-kappaB in cell growth regulationJ.Am J Pathol，2001，159（2）：387-39716Erdogan MA，Ashour A，Yuca