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370ctDNA在 B细胞淋巴瘤中的研究进展内科急危重症杂志2 0 2 3年第2 9 卷第5期沈克锋肖敏*华中科技大学同济医学院附属同济医院血液内科，湖北武汉430 0 30摘要循环肿瘤DNA（c t D NA)是肿瘤患者体液循环中一种广泛存在的游离DNA片段,相较于肿瘤实体病灶，ctDNA具有取材方便、安全无创、信息全面等优势。ctDNA检测可应用于B细胞淋巴瘤的治疗前、治疗中和治疗后等各个阶段，在肿瘤辅助诊断、预后分层、靶向治疗、疗效评估、微小残留病灶（MRD)监测及预测复发等方面具有重要指导意义。本文主要就ctDNA在B细胞淋巴瘤中的相关检测手段、应用进展和前景展望等作一概述。关键词循环肿瘤DNA；液态活检；二代测序；B细胞淋巴瘤；微小残留病灶中图分类号R557*.4Research progress of circulating tumor DNA in B-cell lymphoma SHEN Ke-feng,XIAO Min*:Department of Hematol-ogy,Tongji Hospital,Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology,Hubei Wuhan 430030,ChinaCorresponding author:XIAO Min,E-mail:xiaomin Abstract Circulating tumor DNA(ctDNA)refers to the cell-free DNA fragments that are widely distributed in thebody fluids of tumor patients.Compared with solid tumor lesions,a competitive advantage of ctDNA is its easy accessibility,non-invasive,and comprehensive characteristics.ctDNA detection can be used at all episodes of B-cell lymphoma before,during,and after treatment,and it has important guiding significance in tumor auxiliary diagnosis,prognosis stratification,targeted therapy,efficacy evaluation,minimal residual disease(MRD)monitoring,and prediction of recurrence.In thisreview,we present an overview of current technical methods,application progress,and perspectives of ctDNA in B-celllymphoma.Key words Circulating tumor DNA;Liquid biopsy;Next generation sequencing;B-cell lymphoma;Minimal residualdiseaseB细胞淋巴瘤是最常见的淋巴瘤亚类,在中国约占所有淋巴瘤的6 6.3%，它是一组分子遗传学变异显著和临床表现多样的肿瘤 1 3。传统意义上,B细胞淋巴瘤的诊断治疗和预后评估依赖于病理活检和影像学检查（如 CT、8 F-FD G PET/CT 等)4 6 。但受限于淋巴瘤原发病灶的解剖部位和疾病进展的空间异质性,特殊部位的病理取材困难,病理活检存在一定的失败率或片面性，不能如实反映肿瘤全貌；影像学检查手段也存在诸多不足 7 。临床实践中，函需开发一种灵敏度高、特异性强、信息全面的肿瘤标志物去辅助诊断、指导治疗和预后评估等。细胞游离DNA（c e l l-f r e e D NA，c f D NA）是细胞增殖、凋亡或坏死等生理过程中释放入体液的一种循环双链 DNA片段,它主要存在于外周血中,但在脑脊液、尿液、胸腹水和唾液中也可检出 8.9。循环肿瘤 DNA(circulating tumor DNA,ctDNA）特指肿瘤细胞来源的cfDNA片段,ctDNA 可用于所有类型的*基金项目：国家自然科学基金（No:82270203）*通信作者：肖敏,E-mail：x i a o mi n t j h.t j mu.e d u.c n，湖北省武汉市硚口区解放大道10 95号文献标识码A人/缺失及拷贝数变异（copynumbervariation,CNV）等 10 12 本文结合目前文献研究进展和相关临床试验结果,重点阐述 ctDNA在B 细胞淋巴瘤中的相关检测手段、应用进展和前景展望等。ctDNA概述cfDNA（包含ctDNA)是一种双链DNA片段,半衰期短（5150 min），长度主要集中于10 0 200bp,主峰长度约16 6 bp，相当于一个核小体及Linker蛋白的DNA缠绕长度，少部分cfDNA长度也可达1 0 0 0 bp以上 13,14。肿瘤细胞来源的ctDNA较正常细胞来源的cfDNA偏短2 0 40 bp,突变状态ctDNA似乎更片段化；有研究表明短片段cfDNA（90 150 b p）富集的建库策略,可提高ctDNA占比,增强低频基因突变检出率 15。外周血中 cfDNA 浓度,正D0I10.11768/nkjwzz20230504肿瘤相关基因变异检测，如单核苷酸变异、易位、插内科急危重症杂志2 0 2 3年第2 9 卷第5期常健康人群(0 10 0 ng/mL,中位值5ng/mL)低于淋巴瘤患者(5 10 0 ng/mL,中位值2 5ng/mL),不同肿瘤类型或临床分期患者 cfDNA 浓度也存在变化,如惰性淋巴瘤低于侵袭性淋巴瘤、晚期淋巴瘤高于早期,妊娠、运动、炎症、糖尿病、组织创伤、感染或应激状态时也可导致外周血cfDNA浓度升高 10.16 。淋巴瘤外周血ctDNA在总cfDNA中的占比波动巨大，可低至0.1%以下或高达90%以上,与疾病分期、肿瘤负荷、侵袭性、病灶位置（如血脑屏障可阻碍原发中枢淋巴瘤ctDNA进人外周血循环）等均有关 17,18 人类单倍体基因组当量（haploidgenome equiva-lents,hGE)约等于3.3pg DNA,若设定淋巴瘤患者外周血cfDNA浓度为中位值2 5ng/mL,可估算其cfDNA当量浓度为7 50 0 hGE/mL;10mL外周血约含4 6 mL血清,约含30 0 0 0 450 0 0 0 hGE,可满足变异等位基因频率（variant allele frequency,VAF）0.01%突变位点检测所需的DNA投人量,考虑到50%患者cfDNA浓度可能不足2 5ng/mL,故送检时外周血建议抽取10 mL。此外,cfDNA半衰期极短（8 0%的B细胞淋巴瘤中 2 3,2 4癌症个性化突变谱系深度测序（cancer person-alized profiling by deep sequencing,CAPP-Seq）是在常规基因套餐（panel)设计上,结合独特的集成数字错误抑制（integrated digital error suppression,iDES）生信技术（主要包括分子标签和背景噪音抛除），可将检测的 ctDNA 突变VAF 值降至 0.0 0 3%2 5。O双重测序是在二代测序基础上，对DNA双链分子分别进行独立的标记、测序和校对，可极大提高测序的精确度,检测灵敏度可达 0.0 0 0 1%2 6 。阶段性变异富集及检测测序（phased variant enrichment anddetection sequencing,PhasED-seq）是在二代测序基础上，在单个DNA分子片段上检测多个体细胞突变，可提高ctDNA突变检测灵敏度至0.0001%27。此外,ctDNA还可用于全外显子组测序（whole exon sequencing，W ES）、全基因组测序（w h o l e g e n o me s e q u e n c i n g，W G S）CNV检测和甲基化检测等 2 1 在进行液态活检前，有些因素需要考虑：检测灵敏度受限于cfDNA投人量，例如研究表明Ig-HTS监测 CLL患者MRD时,10-5检测灵敏度约需cfDNA投人量为8 ug,10检测灵敏度则需2 7 g/28;淋巴瘤患者中cfDNA浓度波动大,为保证足量可供后续分析的cfDNA片段,应用特制的cfDNA保存管采集不低于10 mL的外周血;基因胚系突变或克隆造血相关基因突变会干扰肿瘤来源的体细胞突变检测,必要时采用胚系DNA 标本或白细胞来源的DNA对照标本进行配对测序,以剔除相关干扰。372检测技术PCR 法ASO-PCRdPCRNGS 法Ig-HTSCAPP-SeqDuplex sequencingPhasED-seqWES/WGSCNV检测甲基化检测ctDNA在B细胞淋巴瘤中的应用进展肿瘤分子分型和辅助诊断传统意义上，淋巴瘤病理活检诊断是金标准，但部分患者难以进行组织切除/穿刺活检，或取材不佳导致病理诊断不明。近年来,随着肿瘤分子生物学的发展,肿瘤的基因突变图谱或基因表型被阐述得日益明晰，如同人类指纹可鉴定身份一样,许多淋巴瘤特异性的基因突变图谱也可用于辅助诊断等 2.3,2 9,30 O例如,Wright等 31 研究表明约57.4%的DL-BCL可归为6 个主要分子亚型:BN2 型（16.1%，Bcl6重排和NOTCH2突变）,MCD 型（13.9%，MYD88126SP、CD 7 9B、PIM 1、H LA-B、BT G 1 突变),EZB型（13.2%，EZH2突变和Bcl2重排），A53型（6.6%,T P53突变/缺失和非整倍体核型），ST2型（4.7%,TET2、SG K 1、D U SP2、ZFP36 L1、A CT G 1突变），N1 型（2.8%，NOTCH1、I RF2 BP2、I D 3、BCOR突变）。每个亚型的分子机制、预后分组、靶向治疗有所不同。外周血 ctDNA和新鲜组织/病理白片提取的基因组DNA（g e n o m i c D NA,g D NA）均可用于淋巴瘤分子分型。但ctDNA检测（如CAPP-Seq、D u p l e xsequencing、Ph a s ED-s e q）优势更明显：ctDNA和gDNA基因突变图谱检测结果有较高的一致性（8 5%）,但ctDNA检测可克服肿瘤空间异质性，突变内容更丰富，更能代表突变图谱全貌，也更易检内科急危重症杂志2 0 2 3年第2 9 卷第5期表1B细胞淋巴瘤中液态活检技术一览表灵敏度应用0.001%突变热点筛查（如MYD88126sP、BRAFV6OE）;动态追踪基因突变、重排0.001%等,MRD定量监测。0.0001%检测免疫球蛋白VDJ重排；灵敏度高，可用于 8 0%的B细胞淋巴瘤MRD监测。0.003%检测数百个淋巴瘤特异的基因突变、（0.0001%重排、Ig/TCR等；ctDNA定量，多维度0.0001%动态监测MRD,追踪克隆演变等。5%10%基因突变、基因重排、CNV分析等。20%淋巴瘤CNV检测。5%癌症早筛，辅助分层等。概述方便快捷，灵敏度高，成本较低，可及性较强；主要针对突变热点的筛查或已知阳性基因变异的监测。I g-H T S可解决少数B细胞淋巴瘤缺乏MRD监测Marker的难题；cfDNA投入量与检测灵敏度呈正相关。肿瘤基因分型,MRD监测，多位点追踪；干湿试验过程复杂，生信分析难度较高，成本不低。检测范围广，但灵敏度低。灵敏度过低，限制其临床应用。前沿领域,尚未临床推广,分析难度较高。出驱动肿瘤耐药或复发的突变亚克隆 12,2 1,32 ;c t D NA 取材更方便，安全无创，患者接受度更高，方便连续监测；ctDNA检测灵敏度更高，一般情况下gDNA靶向二代测序灵敏度仅2%5%，如霍奇金淋巴瘤（Hodgkinlymphoma,HL)往往背景细胞丰富、肿瘤细胞稀少,组织gDNA二代测序检测极易假阴性，而外周血 ctDNA二代测序却能精确检出 32,33 肿瘤负荷定量和预后评估?淋巴瘤肿瘤负荷高低与疾病转归和预后显著相关,反映其水平的指标很多，如国际预后指数（internationalprognosticindex,IPI）、总肿瘤代谢体积（total metabolic tumorvolume,TMTV)）、乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,LDH)等 34 3。最近,多项研究表明ctDNA 定量水平即ctDNA浓度也可作为B细胞淋巴瘤肿瘤负荷指标 2 1.2.32 。外周血ctDNA浓度计算公式如下：hCE/mL（每毫升单倍体基因组当量）=外周血 cfD-NA 浓度（pg/mL）外周血肿瘤体细胞突变平均VAF值：3.3，它取决于ctDNA在cfDNA中占比和cfDNA浓度高低,可反映肿瘤负荷水平。在DLBCL中，基线ctDNA水平与IPI评分、TMTV及Ann Arbor分期等指标具有显著相关性,都可指导治疗和评估预后。例如，Alig等 37 采用CAPP-Seq 法检测2 6 7 例多中心DLBCL患者治疗前ctDNA水平，证实其与诊断治疗间隔（diagnosis-to-treatment interval，D T I）、T M T V、I PI 和预后等显著相内科急危重症杂志2 0 2 3年第2 9 卷第5期关;Ann Arbor III/IV期ctDNA水平显著高于I/II期,高IPI评分组 ctDNA水平显著高于低IPI评分组，ctDNA水平和TMTV呈线性正相关，ctDNA水平和DTI呈线性负相关，低ctDNA组无事件生存(event-free survival,EFS）和总生存(overall survival,OS)均优于高ctDNA组。Rivas-Delgado等 38 研究前瞻性临床试验中10 0 例 DLBCL患者 cfDNA 数据，结果表明:cfDNA 和配对组织gDNA 样本检出的肿瘤突变图谱高度一致;ctDNA基线水平与肿瘤负荷相关参数（如 LDH或-M、临床分期、IPI评分和TMTV)关联度高;以治疗前 ctDNA浓度2.5 loghGE/mL为阈值，高ctDNA基线水平（2.5loghGE/mL）与更低的完全缓解（completeremission，CR)（6 5%u s 9 6%，P 55 ng/mL）是独立的临床不良预后因素,与更短的 OS 相关;高 cfDNA 组患者常规R-CHOP方案治疗后总OS较差，而挽救性疗法和造血干细胞移植可改善OS。疗效评估和预测复发目前,B细胞淋巴瘤疗效评估标准多依赖于影像学检查（如CT、1F-FD GPET/CT等）,其中以2 0 14 年Lugano 会议修订的淋巴瘤疗效评价5-PS评分法（Deauville标准）最为常用 4。但影像学评估存在诸多局限性,灵敏度较低和精确度不足，如PET多仅用于高代谢淋巴瘤（如HL、D LBCL、外周T细胞淋巴瘤）,结节病、感染及炎性反应等良性疾病可能导致PET结果假阳性 45,且有近15%的 DLBCL患者 PET评估为 CR后疾病却复发进展，小部分患者PET评估为阳性而疾病却未复发(40 。淋巴瘤启动治疗后，ctDNA水平变化剧烈,可作373为疗效评估指标。例如 Kurtz 等 47 采用 CAPP-Seg法动态检测2 17 例多中心DLBCL患者治疗期间的ctDNA水平,结果：1 周期治疗后 ctDNA浓度降低2个log值的早期分子学反应（early molecular re-sponse,EMR）和2 周期治疗后 ctDNA浓度降低2.5个log值的主要分子学反应（major molecularresponse，M M R）均可评估疗效；与基线ctDNA水平、IPI、中期PET评估结果相比,EMR和MMR指标可更好的预测DLBCL患者一线治疗后的两年EFS和OS。国内李苗苗等 48 研究7 3例DLBCL在治疗前、治疗中和结束一线治疗后的系列 ctDNA 检测数据,也发现2 周期治疗后 ctDNA 下降明显组患者有更好的PFS和OS。在其它B细胞淋巴瘤中,也可发现类似结果。Spina 等 32 研究2 4 例 ABVD方案治疗的进展期经典型霍奇金淋巴瘤（classic Hodgkin lymphoma，cHL)患者ctDNA连续性监测数据：2 周期ABVD方案治疗后ctDNA浓度降低10 0 倍/2 个log值组患者CR和治愈情况更佳、累计PFS更长。Lakhotia等 41 采用Ig-HTS法监测53例MCL患者ctDNA数据,中位随访12.7 年,结果显示2 周期诱导治疗后ctDNA阴性组患者PFS和OS更长。ctDNA和PET-CT相比，其特异性强、灵敏度高，更易发现低肿瘤负荷的早期复发病灶，提前预测肿瘤复发。例如,Roschewski等 49 采用Ig-HTS 法检测12 6 例DLBCL患者的系列 ctDNA数据,中位随访11 年,结果:2 周期治疗后的中期评估时,ctDNA阳性组患者5年疾病进展率更高（8 0.2%Us41.7%，P 8 0%的B细胞淋巴瘤中,检测每例B细胞淋巴瘤特异的克隆性VDJ重排序列信息,实现肿瘤MRD 监测;NGS法(如 CAPP-seq等),可计算ctD-NA水平、全景式检测肿瘤相关基因突变、评估克隆演变、寻找耐药突变克隆等,其获取信息更全面丰富。目前,基于MRD检测的淋巴瘤全程管理成为一种发展趋势，可依据中期评估的MRD监测结果来调整后续治疗方案（如升阶梯/巩固/延长治疗或者降阶梯/停止治疗等），以实现B细胞淋巴瘤个体化的精准治疗 52 54。MRD 指导的危险度分层和治疗策略在急性髓系白血病、ALL、C LL等血液肿瘤管理中已被证明可显著提高疗效、延长生存期、改善预后,但其中B细胞淋巴瘤中的应用尚未推广到实践,相关的临床试验正在进行中 55 57 在CAR-T细胞治疗中的应用嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)T细胞治疗是一种新兴的免疫疗法,在复发难治性DLBCL、M C L等B细内科急危重症杂志2 0 2 3年第2 9 卷第5期胞淋巴瘤中具有良好的疗效和广阔的应用前景(8.9。Swoder等 90 开发了一种利用外周血etDNA同时检测 CD19CAR-T治疗患者肿瘤细胞和 CAR-T效应细胞的方法,可实现CAR-T细胞动力学监测、治疗反应评估、复发预测和耐药克隆鉴定等目的。结语近年来，随着分子生物学检测技术的不断发展，ctDNA在B细胞淋巴瘤中的应用价值日益显现。ctDNA是肿瘤患者体液循环中的一种游离 DNA片段,广泛存在于外周血、脑脊液及胸腹水中,相较于肿瘤实体病灶，ctDNA具有取材方便、安全无创、方便连续监测及克服肿瘤空间异质性等优势。ctDNA检测技术可分为PCR法（如ASO-PCR、d PCR等）和NGS 法（如Ig-HTS、CA PP-Se q 等）两大亚类,可应用于B 细胞淋巴瘤的治疗前、治疗中和治疗后肿瘤监测等各个阶段,在肿瘤辅助诊断、预后分层、靶向治疗、疗效评估、MRD监测及预测复发等方面具有重要指导意义,见图1。随着研究的深入，ctDNA检测将更多的参与B细胞淋巴瘤全程精细化管理,在提高疗效、延长生存期、改善预后等方面将日益发挥重要作用。然而,ctDNA虽然有其独特的优势,但目前B细胞淋巴瘤诊断的金标准仍是病理组织活检,ctD-NA检测尚不能完全代替组织活检和影像学检查。诊断治疗监测临床复发PETICT早期复发3.5月ctDNA时间肿瘤检测突变图谱肿瘤负荷定量预后指标图1ctDNA在B细胞淋巴瘤全程管理中的应用示例图早期复发检测疗效评估追踪克隆演变MRD监测MRD指导治疗肿瘤异质性或克隆演变鉴定内科急危重症杂志2 0 2 3年第2 9卷第5期1李小秋,李甘地，高子芬，等.中国淋巴瘤亚型分布：国内多中心性病例10 0 0 2 例分析 J.诊断学理论与实践,2 0 12,11(2):111-115.2Kuppers R.Mechanisms of B-cell lymphoma pathogenesis 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