ER受体测定.doc

雌激素受体及孕激素受体测定
人乳腺癌组织中，有60～70％的组织存在雌激素受体(ER)及／或孕激素受体(PR)，其存在状况与诊断、治疗及判断预后有关。受体阳性者约60％用抗相应受体治疗有效；阴性者亦有10％的有效反应率。测定ER及PR的常用方法包括生物化学及形态学两大类；前者为对受体蛋白作定量测定，后者是观察受体在肿瘤组织，包括细胞内的分布及半定量测定。近年来在测定方面屡有改进，如单克隆技术、高效液相及细胞流式计数测定的应用等,尚未作为常规方法应用。
目前我国开展的生物化学方法有葡聚糖包裹活性炭液吸附法(DCC法)及蔗糖密度梯度超离心法(SDG法)；形态学方面有17-FE细胞化学法及免疫组织化学法(荧光法及酶联法)。由于各自条件不同，所用测定方法也不相同。为便于对资料进行对比分析，本章介绍这些方法，以便统一标准。
第一节 生物化学法
一、葡聚糖包裹活性炭液吸附法(DCC法)
该类方法系通过3H标记的雌激素与受体的特异性竞争结合来检测受体，包括DCC法（葡聚糖包裹活性炭液吸附法，DextranCoatedCharcoal）、SDG法（蔗糖密度梯度超离心法，SucroseDensity GraientUltracontrifugation）、HPA（羟基磷石灰分析法，Hydroxylapatite）、鱼精蛋白沉淀法、琼脂糖凝胶电泳法（AGE）等，以DCC法和SDG法为经典方法。
(一)测定原理 在一定条件下，以氚标记雌二醇([3H]E2)为配体，与受体结合，以葡聚糖包裹活性炭液吸附游离的甾体激素，用液闪法测定与受体结合的标记激素含量，表示受体的量。以激素与受体结合的动力学方法计算受体含量。
(二)测定方法
1． 标本处理：乳腺癌标本离体后立即分成两份，一份送病理检查，另份立即放入冰壶，送实验室作受体测定。剪除待测标本中肿瘤周围的各种正常组织及坏死组织后，以生理盐水冲洗，吸干后置液氮罐中保存，待测定。
2． 制备上清液：全过程均在0～4℃下进行。
(1)组织粉碎：称湿重后，剪成碎块或用Auto-pulverizer于冰冻下粉碎。
(2)制备匀浆：以PolytzonPT-10-ST匀浆器(或玻璃匀浆器)，用1：10(重量：体积)、pH7.4的TED缓冲液(0.0lmol／L Tris-HCl，0.0015 mol／L EDTA，0.5 mmol／L二硫苏糖醇DTT)，匀浆3次，每次5秒，间隙15秒。
(3)离心：匀浆液以105，000×g超速离心1小时(或7000×g低温高速离心15分钟)，得上清液备用。
(三)雌激素受体测定
1． 方法与步骤
(1)两列试管分别加入一系列不同浓度的[3H]E2 50μ1，使反应终浓达0.032，0.063，0.125，0.25，0.5，1.0，2.0nmol／L共7个浓度，分4组。
(2)第一列试管(共2组)为结合管，分别加入50μ1TED缓冲液，以测定其总结合量；第二列试管(共2组)为对照管，分别加入200倍于[3H]E2浓度的己烯雌酚(DES)溶液，抑制[3H]E2与ER结合，以测定其非特异性结合量。
(3)每管各加入150μ1乳腺癌上清液，每管均设重复管。
(4)各试管均置0～4℃冰箱18～20小时。
(5)每管加500 μlDCC液(含0.25％活性炭，0.025％葡聚糖和含10％甘油的0.0lmol／LTris-HCl、pH8.0的缓冲液)，将分离游离的[3H]E2、DCC液用电磁搅拌器搅拌，吸取混匀的试管内容物，静置15～30分钟后3000r／min离心10分钟。
(6)取上清液0.5μl置计数瓶内，加6μl甲苯闪烁液(4g的PPO和0.59的POPOP溶于1000μl甲苯)，2小时后以液体闪烁计数器测定其每分钟计数。
2． 结果处理：以各管的总结合量减去相应管内的非特异结合量，即为各管的特异结合量，以Scatchard法作图，便可求出Kd值和受体含量(图10-1，2)。求得ER量为105fmol／mg蛋白，Kd值为3.4×10-10mol／L，将直线延伸达X轴，其交点即为其结合量。计算时应考虑到机器效率、[3H]E2比活性及衰变等因素。结合量以fmol表示。用Lowry或考马斯亮蓝法测定上清液内蛋白质含量，最终各乳腺癌组织内ER含量以fmol／mg蛋白表示之。
3．DCC单点饱和法测定ER：由于用常规七点DCC法所需组织量多，操作、计算费时，如同时测定ER及PR量，所需标本量更多，易受标本量限制而不能完整测定。单点DCC饱和法比较省时，节约试剂，易被临床接受作为常规测定方法。通常用[3H]E2反应终浓度为5nmol／L即饱和浓度，测定方法同前。一般作4个重复管，即测4管总结合量及4管非特异结合量，总结合量的平均值减去非特异结合管的平均值即得特异结合量。
4． DCC法测定ER的注意事项：DCC法建立较早，已作为常规应用方法，但其技术与设备要求较高，标本量需1克以上，故对测定非切除标本或肿块较小的早期乳腺癌难以满足需要。影响测定结果的因素有以下几方面，应予注意。
(1)受体对温热极不稳定，标本必需新鲜，离体后立即贮于液氮罐或短期存于干冰中，整个过程应低温操作。
(2)受体对酸碱度敏感，于pH7～9时稳定。
(3)脂肪组织易导致假阳性；活性炭浓度过高，吸附过强，易致假阴性，必须严格处理
(4)肿瘤组织中受体分布不均匀，边缘部位含量较中央部位高，故宜混合取材。
(四)孕激素受体测定 测定方法、步骤与ER测定相似，以[3H]R5020或[3H]ORG2058为配体。总结合管中加入胞浆液和含有一系列不同浓度的[3H]R5020(终浓度达0.06～4nmol／L)。各管加入10倍浓度的氢化可的松(DHT)，以消除[3H]R5020和糖皮质激素受体(GR)和皮质激素结合球蛋白(CBG)的结合。对照管加入200倍于[3H]R5020浓度的R5020，抑制[3H]R5020与PR的结合，以测其非特异性结合，计算方法与ER相同。如采用DCC单点饱和分析法测定PR，则采用[3H]R5020的终浓度10nmol／L为饱和浓度。
(五)诊断标准 ER及PR下限值10fmol／mg蛋白时为受体阳性，小于此值时为ER或PR阴性。
二、 蔗糖密度梯度超速离心法（SDG法）
ER或PR复合物在蔗糖密度梯度管中超速离心条件下，因沉降系数不同而分布于固定的区带，利用这种原理定量测定特异性ER复合物和非特异性结合物的量。
操作与计算：取制备好的胞浆与[3H]E2一起保温，另外一份与[3H]E2E2和多于200倍的非标记的竞争物(DES)一起保温，然后加DCC混悬液(NoritA0.75％，Dertron-700.075％混悬于TES缓冲液中)，去掉未结合的[3H]E2，3000r／min离心，取上清液200μ1铺加于已准备好的蔗糖密度液管的液面上(5～20％蔗糖)，用水平转头在4℃下105000×g离心20小时，然后用管底打孔或插管法分段收集30～40管，加闪烁液后在闪烁计数器上读DPM。以收集的管数为横座标，DPM为纵座标绘出两条曲线(总结合与非特异结合)。另外两个梯度管分别铺加两种已知沉降系数的标准蛋白BSA和IgG，同时离心后同样收集，测定其蛋白量作为定S的标志：

第二节 形态学方法
一、 17-FE细胞化学法
17–FE可进入细胞内或细胞核内与ER结合，然后通过荧光显微镜观察细胞内荧光的强弱与定位，决定该细胞的ER状况。在用荧光显微镜观察的同时，用相差显微镜观察细胞，可排除非癌细胞的干扰。
(一)测定过程 本法用细胞悬液标本。取新鲜癌标本，剪碎并。召RPMI细胞培养基1640稀释后，通过双层尼龙滤网，滤液离心，再用1640液调成105～106／m1细胞悬液，然后加入17–FE配体，17–FE应用浓度为2×10-7mol／L。细胞与配体在37℃水浴中保温60分钟，然后用pH7.2的PBS洗两次，弃去上清后即刻滴片计数。本法亦可用针吸液标本测定。
17–FE法测定ER需在落射荧光透射相差双光显微镜下同步观察计数。按细胞分型计数，每例须读两张片，每片计数500个细胞，ER阳性百分比按以下公式计算；
(二)结果分类 根据荧光在细胞内的强弱与定位可将细胞分为五类；
A型 全细胞均有荧光。
B型 仅见细胞核有荧光。
c型 仅见胞浆有荧光。
D型 仅见核仁有荧光。
E型 全细胞均无荧光。
五型细胞中A、B、C型因所含ER量较多，被人为地划分为ER阳性细胞；D、E细胞所含ER量极少或没有，被划为ER阴性细胞。在整个癌细胞群体中，如ER阳性细胞百分比等于或大于10％，该肿瘤则可被认为是ER阳性肿瘤。
此法与DCC法有较高符合率(80％以上)，且可对微量组织进行测定，可用于非切除标本及针吸标本的测定，需特定试剂及荧光显微镜，不宜作为临床常规测定。
二、 ER和PR直接荧光组织化学法
(一)试剂 所用试剂有三种：(1)17–β–雌二醇、牛血清白蛋白、异硫氰荧光素结合物；(2)11–α–羟基孕酮、半琥珀酸盐、牛血清白蛋白、异硫氰四甲基硷性蕊香红结合物；(3)上述二试剂的结合物。
（二）制备 应用恒温冷冻切片机及荧光显微镜。
（三）操作
连续切4张7～10μm厚的组织切片，贴于常温清洁载玻片上，一张作HE染色。其余3张切片放2～5℃冰箱内阴干1小时。取出切片滴2％牛血清白蛋白PBS，分别用上述三种试剂1～2滴均匀覆盖组织片。平放载玻片于湿盒中。在22～24℃条件下静置2小时，使荧光标记物与细胞内的相应受体充分结合。浸泡于新鲜PBS中30分钟，共2次，除去多余荧光素。加1～2滴1：9PBS甘油于玻片上，加盖玻片，置4℃保存，观察。
(四)结果评定 荧光显微镜下，ER阳性呈苹果绿荧光，PR阳性呈桔红色荧光。荧光主要位于胞浆内，偶见胞核或核仁阳性细胞。受体阳性强度可分4级，以正常乳腺或增生乳腺导管上皮细胞内所显荧光强度为评定阳性的标准：(1)乳腺癌细胞荧光强度与之相似者为阳性（++)；(2)超过者为(+++)；(3)不及者为弱阳性(+)；(4)不显荧光者为阴性。ER阳性是指(++)和(+++)者。荧光标记的切片与HE染色片中，全片内癌细胞的百分数分为10％，20％，30％……90％各级，作为半定量的计数表明受体阳性细胞的多少。
三 免疫组化染色基本方法
免疫组化染色方法主要原理是利用标记抗体和抗原抗体特异性反应，借助不同的染色方法，对细胞或组织内的相应抗原进行定性、定位或定量检测。目前免疫组化以辣根过氧化物酶(HRP)系统和DAB显色最为常用。根据其染色步骤可将免疫组化分为：直接法(酶标法)、间接法、IGS法(免疫金法)、IGSS法(免疫金银法)、SP二步法、PAP法、ABC法(卵白素—生物素—过氧化物酶连结法)、SP法(链霉菌抗生素蛋白—过氧化物酶连结法)等，在临床病理诊断中常用ABC法和SP法。链霉菌抗生物素蛋白—过氧化物酶连结法的基本操作步骤如下：
(一)试剂配制
1．0.01mol/L 磷酸盐酸缓冲液(PBS) pH7.2
磷酸二氢钠(NaH2P04·2H20) 9g
磷酸氢二钠(Na2HP04·12H20)64.54g
氯化钠 160g
蒸馏水 2000ml
2．0.05mol/L Tris-HCl缓冲液(TBS) pH7.6
(1)0.5mol/L Tris-HCl缓冲液 pH7.6(储备液)
Tris(三羟甲基氨基甲烷) 60.57g
1mol/LHCl 约 420ml
蒸馏水加至 1000ml
先以300—500m1蒸馏水溶解Tris，加入HCl后，用HCl（1mo1/L)或NaOH(1mo1/L)将pH值调至7.6，后加蒸馏水加至1000ml，4℃冰箱保存。
(2)0.05mol/L Tris-HCl缓冲液(TBS)
取0.5mol/LTris-HCl缓冲液lOml加入0.9％ NaCl90ml混合，pH应为7.6。
3．3％过氧化氢甲醇液
30％过氧化氢(H202) 10ml
甲醇 90ml
4．显色液DAB-H202液(此操作中戴手套，DAB有致癌作用)
TBS 50ml DAB(3，3’—四盐酸二氨基联苯胺) 25mg
30％H202 O.15ml(一滴即可)
先以TBS溶解DAB，完全溶解后过滤，显色前加H202。或用即用型DAB工作液。
(二) S—P免疫组化染色步骤
S-P免疫组化染色试剂盒采用生物素标记的第二抗体与链霉菌抗生物素蛋白连接的过氧化物酶及底物色素混合液来测定细胞和组织中的抗原。即用型试剂盒，省时，省力，广谱即用型试剂盒可以大大避免由抗体和检测试剂盒配对不符引起的假阴性反应。染色的主要过程如下：
1． 石蜡切片脱蜡和水化后，用PBS(pH7.4）冲洗三次，每次3分钟（3×3’，下同)。
2． 根据每一种抗体的要求，对组织抗原进行相应的修复（高温高压或微波抗原修复法）。
3． 每张切片加1滴或50ul氧化酶阻断溶液（试剂A)，以阻断内源性过氧化物酶的活性，室温下孵育10分钟。
4． PBS(PH7.4)冲洗（3×3’）。
5． 甩去PBS液后每张切片滴加1滴或50ul的非免疫性动物血清(试剂B)，室温下孵育10分钟。
6． 甩去血清后每张切片滴加1滴或50ul的第一抗体(待测抗原的单抗或多抗)，室温下孵育60分钟或4℃过夜。
7．PBS冲洗3×5’。
8．甩去PBS液，每张切片加1滴或50ul生物素标记的第二抗体{试剂C)，室温下孵育10分钟。
9．PBS冲洗3×3’。
10．甩去PBS液，每张切片加1滴或50ul链亲和素—过氧化物酶溶液（试剂D)，室温下孵育10分钟。
11．PBS冲洗 3×3分钟。
12．甩去PBS液，每张切片加2滴或100ul新鲜配制的DAB(或即用型DAB工作液)，显微镜下观察3～10分钟。
13．自来水充分水洗，蒸馏水洗5～10秒钟。
14．用淡苏木素复染细胞核，半分钟左右。
15．自来水洗5～10分钟。
16．80％、90％，无水酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。
(三) 结果评定：
阳性反应部位呈棕黄色，细胞核呈淡蓝色。评定阳性的标准同前荧光法。
（王晓稼 郑树），本实验进一步应用Western Blot及免疫组化的方法研究了乳腺癌细胞株中RARα蛋白表达情况，同时用免疫组化的方法检测了58例乳腺癌标本中RARα蛋白的表达情况，以及其与ER的关系。　　

材料与方法
　　1.乳腺癌细胞株及乳腺癌肿瘤标本　乳腺癌细胞株MCF-7(ER阳性)、ZR-75(ER阴性)、MDA-MB-231(ER阴性)由美国马利兰大学癌症中心Dr. Fontana馈赠。58例原发乳腺癌标本来自上海医科大学肿瘤医院手术标本，均经病理证实为乳腺癌，其中单纯癌14例，浸润性导管癌20例，硬癌4例，髓样癌3例，腺癌5例，粘液腺癌6例，导管内癌5例，小叶癌1例。制成5微米厚的石蜡切片进行免疫组化的检测。
　　2.试剂　DMEM/Ham' F12培养基购自Gibco公司；小牛血清购自杭州四季青生物工程材料研究所；HEPES、G418购自Sigma公司；32P dCTP［1.17×104 Bq/mmol(3000 Ci/mmol)］购自Amersham公司：BCA试剂盒购自Pierce公司；免疫组化试剂盒购自DAKO公司；RARα单抗及Actin单抗分别购自Gene公司及Oncogene公司。
　　3.细胞培养和细胞爬片制作　乳腺癌细胞在含10%小牛血清，25 mmol HEPES，50 μg/ml庆大霉素的DMEM/Ham′F 12(1：1)培养液中培养，每2天换培养液。含培养液的100 mm培养皿中放入4～5块盖玻片，滴加含一定细胞数的细胞悬液，培养数天，取出盖玻片，PBS洗，丙酮固定后，保存于4°冰箱待用。
　　4.cDNA探针、RNA分离和Northern Blot　RARα cDNA特异性片段经EcoR1限制性内切酶消化后，采用电泳分离法纯化600 bp片段，探针的制作采用Fienberg和Vogelstien方法［5］，RNA的分离采用Chromczynski和Sacchi的方法［5］。25 μg的RNA在1%琼脂凝胶上分离，然后转移到硝酸纤维素膜上，与32P特异性探针杂交，经放射自显影，曝光显色。
　　5.Western Blot　收集细胞后，裂解液裂解细胞，用BCA法测定蛋白浓度，以确保各泳道上样量相等。10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(100 V、2 h)，纤维素膜室温下用阻断剂处理1 h，RARα单抗(1：1000)温育过夜，HRP标记的二抗(1：5000)作用2 h后，用ECL荧光显色系统，曝光显色。
　　6.免疫组化　按DAKO公司ABC免疫组化试剂盒方法。石蜡切片经二甲苯、酒精常规脱腊、水化后，用PBS洗，经过氧化氢及阻断剂处理，消除内源性过氧化物酶及非特异性抗原，一抗RARα、ER(1：400)室温过夜，PBS洗，二抗、三抗分别作用半小时，用DAB显色5～10 min，镜下满意后，双蒸水中止反应，晾干，二甲苯透明，中性树胶封片。阴性对照切片不加一抗。细胞爬片的免疫组化检测，除了不需脱蜡，其余步骤同石蜡切片。显微镜检查判断表达情况，肿瘤细胞核及浆中有棕黄色颗粒出现的为阳性细胞，选取有代表性的区域(不小于5个高倍视野)，计数500个细胞中的阳性细胞数，以阳性细胞数占所计数的肿瘤细胞总数的百分比大于或等于25%的视为阳性，小于25%的为阴性。
　　7.乳腺癌标本中RARα蛋白的表达与ER表达的相关性比较用χ2检验。
结　　果
图2　Western Blot检测RARα蛋白在人乳腺癌细胞株中的表达情况。1、为MCF-7。2、为ZR-75。3、MDA-MB-231。可见ER阳性的乳腺癌细胞株中RARα蛋白的表达明显高于ER阴性的乳腺癌细胞株。RARα蛋白分子量大约在50 kD。下图为actin表达情况作为内对照。
　3.免疫组化检测RARα蛋白在乳腺癌细胞株中的表达　(见插页第2页图3)，RARα蛋白表达的ER阳性的MCF-7乳腺癌细胞株中明显高于ER阴性的MDA-MB-231细胞中的表达。
图3　免疫组化方法检测RAR α蛋白在人乳腺癌细胞株中的表达情况
MCF-7细胞(ER阳性)RAR α蛋白阳性着色在细胞膜
　　4、RARα蛋白、ER在乳腺癌组织标本中的表达及两者表达的相关性(见附表)：在58例乳腺癌标本中，ER阳性的为37例，阳性率为63.8%，RARα阳性的为36例，阳性率为62.1%，在ER阳性的37例中RARα阳性的为28例，占75.5%，ER阴性的21例中RARα阴性的为13例，两者表达的相关性经χ2检验有统计学意义(P＜0.01)(见附表)。
附表　58例乳腺癌组织ER和RARα表达情况
　 RARα阳性(%) RARα阴性 总数(%)
ER阳性 28 9 37(63.8)
ER阴性 8 13 21
总数 36(62.1) 22 58
讨　　论
　　维甲酸在乳腺癌的增殖和分化中起着重要的作用，其通过与维甲酸受体(RARs)及相关受体(RXRs)结合而起作用。研究发现维甲酸对乳腺癌细胞生长抑制作用与ER相关。ER阳性的乳腺癌细胞生长能被维甲酸抑制，而ER阴性的乳腺癌细胞对维甲酸耐受［6，7］。
Roman首先报道了在乳腺癌细胞中ER阳性细胞RARα mRNA的表达明显高于ER阴性的细胞，其他受体亚型的表达在两类细胞间无明显差别［4］。提示了RARα与ER以及维甲酸作用间存在一定的关系。Sheikh等应用基因转染技术，证明RARα mRNA的高表达与维甲酸抑制乳腺癌细胞生长有直接关系，说明在维甲酸抑制乳腺癌细胞生长中RARα起关键作用。提出RARα也许可作为指导临床上应用维甲酸治疗和预防乳腺癌的l

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