miRNA-21的循环放大检测及成像.pdf

第4 4卷 第5期2 0 2 3年1 0月 青 岛 科 技 大 学 学 报(自然科学版)J o u r n a l o f Q i n g d a o U n i v e r s i t y o f S c i e n c e a n d T e c h n o l o g y(N a t u r a l S c i e n c e E d i t i o n)V o l.4 4 N o.5O c t.2 0 2 3 文章编号:1 6 7 2-6 9 8 7(2 0 2 3)0 5-0 0 1 6-1 0;D O I:1 0.1 6 3 5 1/j.1 6 7 2-6 9 8 7.2 0 2 3.0 5.0 0 2m i R N A-2 1的循环放大检测及成像孙鑫鑫,李家家,丁彩凤*(青岛科技大学 化学与分子工程学院,山东 青岛 2 6 6 0 4 2)摘 要:报道了一种m i R NA循环放大检测系统,该系统涉及红色发射碳量子点(C D s)以及聚多巴胺纳米球(P D AN S s)。通过纳米材料与D NA的自组装,在激发光源4 1 0、5 4 2 n m 的照射下,产生6 5 0、5 8 5 n m的荧光信号,通过荧光信号的关-开,可以实现对靶标m i R NA-2 1循环放大的双荧光检测与细胞成像,极大提高检测的灵敏度与准确性。关键词:碳量子点;聚多巴胺纳米球;m i R NA-2 1;循环放大检测;细胞成像中图分类号:O 6 5 7.3 8 文献标志码:A引用格式:孙鑫鑫,李家家,丁彩凤.m i R NA-2 1的循环放大检测及成像J.青岛科技大学学报(自然科学版),2 0 2 3,4 4(5):1 6-2 5.S UN X i n x i n,L I J i a j i a,D I NG C a i f e n g.C i r c u l a t i n g a m p l i f i c a t i o n d e t e c t i o n a n d i m a g i n g o f m i R NA-2 1J.J o u r n a l o f Q i n g d a o U n i v e r s i t y o f S c i e n c e a n d T e c h n o l o g y(N a t u r a l S c i e n c e E-d i t i o n),2 0 2 3,4 4(5):1 6-2 5.收稿日期:2 0 2 2-0 9-0 8基金项目:国家自然科学基金项目(2 2 0 7 4 0 7 4);山东省自然科学基金项目(Z R 2 0 2 0MB 0 6 5).作者简介:孙鑫鑫(1 9 9 6),女,硕士研究生.*通信联系人.C i r c u l a t i n g A m p l i f i c a t i o n D e t e c t i o n a n d I m a g i n g o f m i R N A-2 1S U N X i n x i n,L I J i a j i a,D I N G C a i f e n g(C o l l e g e o f C h e m i s t r y a n d M o l e c u l a r E n g i n e e r i n g,Q i n g d a o U n i v e r s i t y o f S c i e n c e a n d T e c h n o l o g y,Q i n g d a o 2 6 6 0 4 2,C h i n a)A b s t r a c t:T h i s p a p e r r e p o r t s s u c h a m i R NA c y c l e a m p l i f i c a t i o n d e t e c t i o n s y s t e m,w h i c h i n-v o l v e s r e d e m i t t i n g c a r b o n q u a n t u m d o t s(C D s)a n d p o l y d o p a m i n e n a n o s p h e r e s(P D AN S s).T h r o u g h t h e s e l f-a s s e m b l y o f n a n o m a t e r i a l s a n d D NA,6 5 0 n m a n d 5 8 5 n m f l u o r e s c e n c e s i g-n a l s a r e g e n e r a t e d u n d e r t h e i r r a d i a t i o n o f 4 1 0 n m a n d 5 4 0 n m e x c i t a t i o n l i g h t s o u r c e s.T h r o u g h t h e o f f-o n o f f l u o r e s c e n c e s i g n a l s,t h e d o u b l e f l u o r e s c e n c e d e t e c t i o n a n d c e l l i m a-g i n g o f c y c l i c a m p l i f i c a t i o n o f t a r g e t m i R NA-2 1 c a n b e r e a l i z e d,w h i c h g r e a t l y i m p r o v e s t h e s e n s i t i v i t y a n d a c c u r a c y o f d e t e c t i o n.K e y w o r d s:c a r b o n q u a n t u m d o t s;p o l y d o p a m i n e n a n o s p h e r e s;m i R NA-2 1;c y c l i c a m p l i f i c a-t i o n d e t e c t i o n;c e l l i m a g i n g 众所周知,m i R NA是一类非编码单链R NA,长度约为1 82 2个核苷酸1。m i R NA的类型有很多,比如m i R NA-2 11-2、m i R NA-3 0 b3、m i R NA-1 2 24等。有很多研究报道,单个的m i R NA具有调节和抑制癌基因表达能力,m i R NA的部分缺失还会导致癌症的发生5。因此,越来越多的学者对于m i R NA进行了相关的实验研究与理论探讨,期望通过对m i R NA的研究实现对人体癌症的早起诊断与预防6。纳米材料碳量子点,在2 0 0 4年被首次发现7,它类似球形,其直径小于1 0 n m,通常包括C、H、O、N 4种基本元素8-9,其表面含有氨基、羧基、羟基等 第5期 孙鑫鑫等:m i R NA-2 1的循环放大检测及成像官能团1 0。C D s具有普通纳米材料没有的荧光性能,可以用于构建荧光探针。同时,C D s的毒性更低、亲水性更好、光稳定性更好,使得C D s可用于细胞成像,且红色发射的C D s使得具有更高的成像深度,具有一定的体内检测优势1 1。聚多巴胺纳米球(P D AN S s)也是当前备受关注的新型仿生材料,主要是多巴胺(D A)在水溶液中通过自身的氧化-聚合形成的1 2。不仅可以用作生物相容的荧光传感器和生物成像1 3,而且还可以通过能量转移或电子转移过程对邻近的荧光团产生显著的荧光猝灭效应1 4。将多种多功能纳米材料进行联合使用,更有助于提高对肿瘤标志物的检测效率,对于癌症的早起诊断与预防具有深远意义。本研究通过合成两种多功能纳米材料,进而组装成为纳米探针,实现对肿瘤标志物m i R NA-2 1的相关检测及细胞成像。1 实验部分1.1 仪器与试剂高压釜,F C F-0.5型,郑州科达机械仪器设备有限公司;0.2 2 m的微孔滤膜过滤器,河南泰斯特仪器有限公司;透射电子显微镜,J EM-F 2 0 0型,日本电子株式会社;扫描电子显微镜,R e g u l u s 8 1 0 0型,锐力科技 股份有限公 司;紫外可见 分光光度计,UH 5 3 0 0型,日本日立高新技术公司;荧光分光光度计,F-4 6 0 0型,日本日立高新技术公司;激光粒度分布仪,WT N a n o Z s型,英国马尔文仪器有限公司。柠檬酸钠(N a3C6H5O72 H2O)、盐酸多巴胺(C8H1 2C l NO2)、无水乙醇(C2H6O)、三羟甲基氨基甲烷(T r i s)、异 丙 醇(C3H8O)、4-二 甲 氨 基 吡 啶(DMA P)。D NA、m i R NA及多肽具体序列见表1所示。新鲜菠菜购自本地超市。表1 D N A、m i R N A和多肽的序列信息T a b l e 1 S e q u e n c e i n f o r m a t i o n o f D NA,m i R NA a n d p o l y p e p t i d e名称序列(5 -3)C OOH-s u bT T T T T T T T T T T C AA C A T C A G T C T GA T AA G C T A(B HQ 2)A C T C A C T A T r A G GAA GA GA T G G C GA G T T TT C T C G C C T T T T T T T T T T T T T G T GA G T(T AMR A-N)z y m eC T T A T C A GA C T GA T G T T GA(NH2)C T C G C C AT C T C T T C T C C GA G C C GA T C G G T C GAAA T A G T GA G Tm i RNA-2 1UA G C UUAU C A GA C UGAUGUUGAm i R NA-1 4 1UAA C A C UGU C UG GUAAA GAUG Gm i R NA-1 5 5UUAAUG C UAAU C GUGAUA G G GUm i R NA-1 2 2UG GA GUGUGA C AAUG GUGUUUGm i RNA-l e t-7 aUGA G GUA GUA G GUUGUAUAGUUp o l y p e p t i d eA c p-P P P P E K E K E K E K1.2 实验过程1.2.1 红色发射C D s的合成及表征以新鲜菠菜叶为碳源,合成了具有红色发射的C D s。取0.5 g去除茎脉的新鲜菠菜叶,加入5 m L 0.1 gm L-1的柠檬酸钠溶液,2 0 m L无水乙醇,水热法1 5 0 反应1 2 h后经0.2 2 m滤膜过滤,再经透析、纯化、冷冻干燥一系列过程,最终得到固体C D s。1.2.2 P D AN S s的合成及表征1 0 0 m L T r i s缓冲液(1 0 mm o lL-1)和4 0 m L异丙醇的混合物中加入0.1 g盐酸多巴胺,在黑暗中连续搅拌1 2 h,最终得到的溶液进行离心,水洗重复3次,最后对沉淀进行干燥后重新分散,之后进行P D AN S s的S EM、T EM、F T-I R、紫外、R a m a n、抗污染等一系列表征。1.2.3 纳米探针的自组装过程等物质的量z y m e链与s u b链淬火(9 5 加热5 m i n,之后缓慢降至室温)后与C D s及连接抗污染多肽的P D AN S s进行混合,然后加入适量的DMA P(0.1 mm o lL-1)作为高效的酰化反应催化剂用于氨基与羧基的连接,静止1 2 h后离心去除未连接的D NA z y m e、C D s、P D AN S s及偶联剂。1.2.4 m i R NA-2 1的检测与细胞成像将自 组 装 的 纳 米 探 针 与 靶 标m i R NA-2 1及M g2+体外反应一段时间后,分别测不同浓度、不同时间下的荧光强度变化,之后进行细胞成像。1.3 实验原理体内外检测过程原理见图1,首先合成了C D s和P D AN S s两种纳米材料,其中P D AN S s既可以作为C D s的荧光猝灭剂,又可作为材料载体,保证纳米复合材料可以顺利进入到细胞中。同时表面连接的抗污染多肽,可以提高纳米材料在检测过程的抗污染效果,避免受到其他蛋白的干扰,影响实验测71青 岛 科 技 大 学 学 报(自然科学版)第4 4卷图1 体内外检测过程原理图F i g.1 S c h e m a t i c d i a g r a m o f i n v i v o a n d i n v i t r o d e t e c t i o n p r o c e s s定。C D s与P D AN S s、D NA通过酰胺键进行连接,此时C D s与T AMR A-N的荧光通过荧光共振能量转移分别被P D AN S s及B HQ 2猝灭,并无荧光信号。在m i R NA-2 1存在的情况下,D NA s u b链与m i R NA-2 1链进行配对的碱基数更多、结合力更强,可实现与m i R NA-2 1链的特异性结合,导致D NA s u b-z y m e链解离,实现C D s 6 5 0 n m发射处的红色荧光恢复。游离的D NA z y m e链会在M g2+存在的条件 下 实 现 对D NA s u b链 的 特 异 性 切 割,导 致T AMR A-N 5 8 0 n m处 的 橙 色 荧 光 恢 复。之 后D NA z y m e链进一步进行游离,实现另外D NA s u b链的切割,从而达到信号检测的循环放大效果,提高检测的灵敏度,而且双荧光检测可以提高检测结果的准确性。2 结果与讨论2.1 C D s的相关表征2.1.1 C D s的形貌及拉曼表征通过水热法合成了具有红色发射的C D s,并对其进行了形貌、粒径、电位、官能团等一系列表征,见图2图5。以菠菜叶、乙醇、柠檬酸钠为原料,合成了C D s。图2 为C D s在 不 同 标 尺 下 的 透 射 电 子 显 微 镜(T EM)图像。由图2可以看出,所制备的纳米材料C D s为分散均匀的球形结构,粒径在27 n m。插图为C D s的高分辨率透射电子显微镜(HR T EM)。可以看出,所制备的C D s具有分辨率良好的晶格条纹,平面间距为0.2 3 n m。图3为C D s的动态光散射水合半径分布图。结果显示粒度分布主要集中在1 0 n m左右的范围内,相比较干燥后的样品所进行的透射电镜成像来说,水合粒径因其表面电荷对溶液中H+、OH-的吸附,使得所测得的粒径结果较透射电镜显示的粒子半径大些。然后对C D s的合成进行了拉曼光谱表征,以验证C D s的成功制备见图4。如图4所示,在1 3 6 9,1 5 6 3 c m-1处显示出了C D s的典型拉曼峰,其中1 3 6 9 c m-1属于D带,归因于无定形碳,表示C原子的晶格缺陷,而1 5 6 3 c m-1属于G带,归因于石墨碳,表示C原子s p2杂化的面内伸缩振动。图4拉曼光谱显示了C D s在D带与G带的典型拉曼峰,表明了所制备的C D s含有两种类型的碳物种,证明了C D s的成功合成。81 第5期 孙鑫鑫等:m i R NA-2 1的循环放大检测及成像图2 C D s的T EM照片F i g.2 T EM i m a g e s o f C D s图3 C D s的D L S粒度表征F i g.3 S i z e d i s t r i b u t i o n o f C D s图4 C D s的R a m a n光谱表征F i g.4 R a m a n i m a g e s o f C D s2.1.2 C D s的红外光谱表征利用红外光谱对C D s的化学组成和成键进行了进一步的表征,见图5。从图5可以看出C D s的主要成键组成,其表面含有多种官能团。其中,在3 4 2 7 c m-1的吸收带对应于NH的 伸 缩 振 动,2 9 7 5,2 9 2 5,2 8 6 5和1 4 6 0 c m-1处比较宽的吸收带归因于CH、CH2、CH3的伸缩和弯曲振动,1 6 1 6 c m-1处比较尖锐的吸收 带 被 指 定 为CC/CN的 伸 缩 振 动,而1 3 8 6,1 3 7 5 c m-1处的宽吸收带及1 2 2 7 c m-1处的吸收带归因于CN的伸缩振动,1 0 8 0 c m-1处的吸收带是由COC的伸缩振动引起的。以上的红外数据表明,C D s表面含有大量的氨基,便于后面对纳米材料进行表面修饰。图5 C D s的红外光谱表征F i g.5 F T-I R s p e c t r u m o f C D s2.1.3 C D s的相对荧光量子产率测定对于C D s的相对荧光量子产率进行了测定与计算,选择以硫酸奎宁为标准,通过测定硫酸奎宁与C D s的荧光与紫外吸收,对C D s的相对荧光量子产率进行计算。硫酸奎宁的紫外吸收光谱和荧光光谱见图6和图7。C D s的紫外吸收光谱和C D s的荧光光谱见图8和图9。图6 硫酸奎宁的紫外吸收光谱F i g.6 U l t r a v i o l e t a b s o r p t i o n s p e c t r u m o f q u i n i n e s u l f a t e91青 岛 科 技 大 学 学 报(自然科学版)第4 4卷通过公式Yu=YsFu/FsAs/Au计算出,C D s红色发射的相对荧光量子产率为1 3.3%。图7 硫酸奎宁的荧光光谱F i g.7 F l u o r e s c e n c e s p e c t r u m o f q u i n i n e s u l f a t e图8 C D s的紫外吸收光谱F i g.8 U l t r a v i o l e t a b s o r p t i o n s p e c t r u m o f C D s图9 C D s的荧光光谱F i g.9 F l u o r e s c e n c e s p e c t r u m o f C D s2.2 P D A N S s的相关表征2.2.1 P D AN S s的形貌表征以盐酸多巴胺为原料进行P D AN S s的制备,然后对其进行了材料表征。图1 0为P D AN S s的T EM照 片。图1 1为P D AN S s的S EM照片。由图1 0、图1 1两图可以看出,制备的P D AN S s纳米材料的粒径在2 0 0 n m左右。而图1 2的动态光散射粒度分布直方图的数据也 可 以 更 加 直 观 地 说 明,所 制 备 的 纳 米 材 料P D AN S s的平均粒径在2 0 0 n m左右。图1 0 P D A N S s 的T EM照片F i g.1 0 T EM i m a g e o f P D AN S s图1 1 P D A N S s 的S EM照片F i g.1 1 S EM i m a g e o f P D AN S s图1 2 P D A N S s的D L S粒径表征F i g.1 2 S i z e d i s t r i b u t i o n o f P D AN S s2.2.2 P D AN S s的紫外及荧光表征根据本课题设计原理,需要P D A N S s具有比较宽泛的紫外吸收,从而达到可以猝灭C D s荧光的效果。图1 3为P D AN S s的紫外吸收光谱。图1 3 P D A N S s的紫外吸收光谱F i g.1 3 UV-V i s a b s o r p t i o n s p e c t r u m o f P D AN S s02 第5期 孙鑫鑫等:m i R NA-2 1的循环放大检测及成像由图1 3可以发现,P D AN S s的紫外吸收光谱与所预想的相一致,具有比较宽的紫外吸收,可以实现对C D s的荧光 猝灭。不同浓度的P D AN S s对C D s的荧光猝灭效果见图1 4。可以看出,P D AN S s对C D s的荧光猝灭效果比较明显。图1 4 P D A N S s对C D s的荧光猝灭效果F i g.1 4 F l u o r e s c e n c e q u e n c h i n g e f f e c t o f P D AN S s o n C D s2.2.3 P D AN S s的拉曼及红外光谱表征通过拉曼及红外光谱对P D AN S s进行了表征,来验证P D AN S s的成功合成。图1 5为D A、P D AN S s的拉曼光谱表征,与单体多巴胺相比较,P D AN S s在1 4 0 0、1 5 5 0 c m-1处出现了明显的拉曼特征峰,证明了P D AN S s的成功合 成。同时从(图1 6)D A、P D AN S s的红外光谱可图1 5 D A与P D A N S s的拉曼光谱表征F i g.1 5 R a m a n s p e c t r o s c o p i c c h a r a c t e r i z a t i o n o f D A a n d P D AN S s图1 6 D A与P D A N S s的红外光谱表征F i g.1 6 F T-I R s p e c t r u m o f D A a n d P D AN S s以看出,单体多巴胺在5 0 01 7 0 0 c m-1处有很多密集的峰,但聚合成P D AN S s后该范围的峰几乎消失,证明了P D AN S s的成功合成。2.3 复合纳米探针的构建及表征2.3.1 D NA组装结构软件模拟及电泳表征对组装的D NA结构进行了软件模拟,如图1 7所示。在对制备的C D s和P D AN S s进行各种表征后,将两种纳米材料与设计的D NA链进行了整体连接,然后对构建成功的纳米探针进行了凝胶电泳表征,见图1 8。图1 7 D N A z y m e结构图F i g.1 7 S t r u c t u r e d i a g r a m o f D NA z y m e泳道a:D NA m a r k e r;泳道b:m i R NA-2 1;泳道c:z y m e;泳道d:s u b;泳道e:z y m e+s u b;泳道f:z y m e+s u b+m i R NA-2 1+M g2+。图1 8 D N A z y m e的凝胶电泳图F i g.1 8 G e l e l e c t r o p h o r e s i s d i a g r a m o f D NA z y m e 图1 8中,泳道a为D NA m a r k e r,泳道b为m i R NA-2 1,泳道c为z y m e链,泳道d为s u b链,泳道e为z y m e+s u b,泳道f为 z y m e+s u b+m i R NA-2 1+M g2+。从图1 8看出,泳道b、c、d 3条单链条带清晰,不含杂质;泳道e是z y m e链和s u b链的结合,条 带 明 显 上 移;泳 道f是 加 入m i R NA-2 1和M g2+后组装的D NA结构被切割,条带实现分离,证明了在本次实验中D N A结构的成功构建与切割。12青 岛 科 技 大 学 学 报(自然科学版)第4 4卷2.3.2 复合纳米探针的抗污染效果及亲水性测定P D AN S s的表面黏着性较高,容易吸附一些其他干扰物质,影响m i R NA-2 1的测定。基于此,设计在P D AN S s表面连接一段抗污染多肽,用来提高P D AN S s的抗污染性能。图1 9是通过P D AN S s包裹多肽前后对于修饰F I T C的B S A的吸附能力进行验证,来证明包裹多肽后的P D AN S s的抗污染效果。图1 9 P D A N S s包裹多肽前后的抗污染效果F i g.1 9 A n t i-p o l l u t i o n e f f e c t o f P D AN S s b e f o r e a n d a f t e r w r a p p i n g p o l y p e p t i d e 由图1 9可以看出,在未包裹多肽时,随着混合时间的延长,B S A被吸附的量增多,则上清液的荧光降低;而包裹多肽后与修饰F I T C的B S A进行混合后发现,混合相同的时间,上清液的荧光明显增强,这说明包裹多肽后的P D AN S s对B S A的吸附量是明显低于包裹多肽前的。证明了包裹多肽对于P D AN S s是有一定的抗污染效果的。之后对于材料的构建进行了亲水性验证实验,如图2 0所示。图2 0(a)为二次水空白对照,接触角为5 8.3 3,图2 0(b)为P D AN S s,表面含有丰富的官能团导致亲水性较好,接触角较小,为3 6.1 6,图2 0(c)为P D AN S s包裹一层多肽,因为多肽具有良好的亲水性,导致接触角进一步减小至1 8.3 3,图2 0(d)为纳米材料与D NA连接后的接触角,D NA良好的亲水性导致接触角很小,低至9.9 0,图2 0(e)是指包裹多肽后的纳米材料与D NA连接后的接触角测定,由于多肽与D NA本身的亲水特性,导致接触角进一步减小至8.3 4。由此可见,该纳米探针的亲水性非常好,表明具有良好的抗污染效果。图2 0 复合纳米材料的亲水性测定F i g.2 0 C o n t a c t a n g l e s i m a g e s o f d i f f e r e n t s a m p l e s2.3.3 m i R NA-2 1的体外检测2.3.3.1 时间优化为了验证实验设计合成的纳米探针对于癌细胞中标志物m i R NA-2 1的响应能力,首先在体外分别对不同反应时间及不同浓度的m i R NA-2 1进行了荧光强度的测定。图2 1所示为反应时间与C D s及T AMR A-N的荧光强度关系,而图2 2是其更直观的线性关系。从中可以看出,随着反应时间的不断增加,其荧光强度刚开始迅速增强,随后增强速度减缓,之后在5 0 m i n左右可以达到荧光强度比较稳定的状态,所以最终选择5 0 m i n作为最佳反应时间。2.3.3.2 工作曲线以5 0 m i n作为最佳反应时间,对不同浓度的m i R NA-2 1进行了荧光强度测定,见图2 3。由图2 3可以发现,随着m i R NA-2 1浓度的不断增加,C D s及T AMR A-N的荧光逐渐恢复,且呈现良好的线性相关性,见图2 4,线性相关系数R2为0.9 9 5,计算的最低检测限达3 0 p m o lL-1,远低于大部分报道的m i R NA-2 1检测限,说明此次设计合成的纳米探针对于癌细胞标志物m i R NA-2 1的检测是十分灵敏和有效的。2.3.3.3 选择性测定与此 同 时,还 选 择 了m i R NA-2 1的 同 源 性m i R NA进行选择性实验,见图2 5。22 第5期 孙鑫鑫等:m i R NA-2 1的循环放大检测及成像图2 1 m i R N A检测的反应时间与C D s及T AMR A-N的荧光曲线F i g.2 1 R e a c t i o n t i m e f l u o r e s c e n c e c u r v e s(C D s a n d T AMR A-N)o f m i R NA d e t e c t i o n图2 2 m i R N A检测的反应时间与荧光强度的线性曲线F i g.2 2 L i n e a r i t i e s(C D s a n d T AMR A-N)o f m i R NA d e t e c t i o n图2 3 m i R N A检测的荧光恢复曲线F i g.2 3 O p t i m i z a t i o n o f r e a c t i o n t i m e f o r m i R NA d e t e c t i o n如图2 5所示,发现本次实验设计合成的纳米探针对于其余的同源性m i R NA并没有明显的荧光响图2 4 以5 8 5 n m处的荧光值为纵坐标,浓度的对数为横坐标绘制散点图及其拟合曲线(其中线性相关系数R2=0.9 9 5)F i g.2 4 D r a w a s c a t t e r p l o t w i t h t h e f l u o r e s c e n c e a t 5 8 5 n m a s t h e o r d i n a t e a n d t h e l o g a r i t h m o f t h e c o n c e n t r a t i o n a s t h e a b s c i s s a.(A n d d r a w a f i t t i n g c u r v e(t h e l i n e a r c o r r e l a t i o n c o e f f i c i e n t R2=0.9 9 5)图2 5 m i R N A检测的选择性优化F i g.2 5 S e l e c t i v e o p t i m i z a t i o n o f m i R NA d e t e c t i o n 32青 岛 科 技 大 学 学 报(自然科学版)第4 4卷应,证明该纳米探针对于m i R NA-2 1的检测具有良好的特异性,可以用于癌细胞中m i R N A-2 1的检测。2.3.4 m i R NA-2 1检测的细胞成像实验2.3.4.1 细胞毒性该纳米探针在体外对m i R NA-2 1优异的检测性能促使进行细胞内m i R NA-2 1成像。首先选择了m i R NA-2 1高表达的H e p G 2细胞对其进行了细胞毒性验证,发现无论是C D s、P D AN S s、纳米探针还是在不同浓度、不同时间条件下进行的细胞实验,均没有发现明显的细胞毒性(图2 6图2 8)。图2 6 纳米材料对细胞活力的影响F i g.2 6 C e l l v i a b i l i t i e s o f d i f f e r e n t n a n o m a t e r i a l s 图2 7 不同浓度纳米探针对细胞活力的影响F i g.2 7 C e l l v i a b i l i t i e s o f d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s o f c o m p o s i t e n a n o p r o b e s 图2 8 纳米探针孵育时间对细胞活力的影响F i g.2 8 C e l l v i a b i l i t i e s o f d i f f e r e n t n a n o p r o b e s i n c u b a t e d f o r d i f f e r e n t t i m e s 2.3.4.2 复合纳米探针浓度及细胞孵育时间条件优化验证纳米探针对H e p G 2细胞存活率没有明显影响后,对其进行了细胞成像实验,见图2 9。图2 9 关于浓度筛选的细胞成像F i g.2 9 C e l l i m a g i n g f o r c o n c e n t r a t i o n s c r e e n i n g 首先图2 9中对细胞成像所用的纳米探针浓度进行了筛选,发现在2 0 gm L-1时可以达到比较稳定的荧光强度。接下来以2 0 gm L-1纳米探针进行了时间优化成像,发现随着孵育时间的延长,其荧光强度逐渐增强,在与细胞共同孵育6 h后可以达到比较稳定的成像状态(图3 0)。图3 0 细胞内纳米探针孵育不同时间的荧光成像 F i g.3 0 V e r i f i c a t i o n o f i n t r a c e l l u l a r d o u b l e f l u o r e s c e n c e i m a g i n g2.3.4.3 细胞内双荧光成像验证基于 本实验涉及 到双荧光 检 测,以2 0 g42 第5期 孙鑫鑫等:m i R NA-2 1的循环放大检测及成像m L-1纳米探针与细胞共孵育6 h后,对于两个不同通道的荧光同时进行了细胞成像,见图3 1。如图3 1所示,可以发现在4 1 0 n m及5 4 3 n m通道的激光照射下,纳米探针与细胞共孵育后会发现明显的红色、橙色双通道荧光成像,说明双通道荧光可同时用于癌细胞的m i R NA-2 1检测成像。图3 1 细胞内双荧光成像验证 F i g.3 1 F l u o r e s c e n c e i m a g i n g o f i n t r a c e l l u l a r n a n o p r o b e i n c u b a t e d f o r d i f f e r e n t t i m e s2.3.4.4 加入模拟物与抑制剂后的成像实验图3 2验证了在加入抑制剂与模拟物后的细胞成像效果,加入抑制剂后荧光信号明显减弱,而加入模拟物后荧光信号明显增强,说明该系统可以成功地用于检测预刺激后m i R NA表达水平的波动。图3 2 分别加入模拟物和抑制剂的细胞成像 F i g.3 2 C e l l i m a g i n g w i t h m i m i c s a n d i n h i b i t o r r e s p e c t i v e l y4 结 语为进一步帮助解决癌症标志物m i R NA-2 1的检测灵敏度与准确性这一难题,本课题组设计了这样一种循环放大检测纳米系统。将两种具有良好生物相容性及低细胞毒性的纳米材料C D s、P D AN S s与D NA进行组装,形成对m i R NA-2 1具有特异性检测的纳米探针。该纳米探针不仅具有双荧光检测信号,而且具有循环放大功能,大大降低检测限,且对其它同源性m i R NA并无明显响应,可实现靶标m i R NA-2 1的循环放大检测,进而大大提高检测的灵敏度及准确性。而且C D s的红色发射具有更高的 成 像 深 度,使 其 具 有 一 定 的 体 内 检 测 优 势。P D AN S s表面连接的多肽既提高了纳米探针的亲水性,又大大减少了其他蛋白的干扰,具有良好的抗污染特性。该纳米探针优异的检测性能对于m i R-NA的功能进行深入研究具有重要意义,而且有望扩展到其他生物分子的放大检测,对于早起癌症的诊断与预防具有深远影响。参 考 文 献1 ME N G X,WAN G H,YANG M,e t a l.T a r g e t-c e l l-s p e c i f i c b i o o r t h o g o n a l a n d e n d o g e n o u s A T P c o n t r o l o f s i g n a l a m p l i f i c a-t i o n f o r i n t r a c e l l u l a r m i c r o R NA I m a g i n gJ.A n a l y t i c a l C h e m-i s t r y,2 0 2 1,9 3(3):1 6 9 3-1 7 0 1.2 Z HANG Y,C HE N W,F AN G Y,e t a l.A c t i v a t i n g a D NA n a n o m a c h i n e v i a c o m p u t a t i o