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Caspase与细胞凋亡
沈阳市第一人民医院神经内科 （110041）李莉

摘要：细胞凋亡，又称程序性细胞死亡（Programmed cell death, PCD）是机体生长发育、细胞分化和病理状态中细胞自主性死亡过程。是细胞内由基因编码调控的按严格程序执行的细胞自杀过程。细胞凋亡是细胞生长发育过程的重要生命现象，是目前生物医学领域中的一个重要研究课题。阐明细胞凋亡的分子机制可对一些疾病的防治（如肿瘤，神经退行性疾病等）产生积极影响。许多实验提示细胞凋亡涉及一个瀑布式（Cascade）基因表达过程。半胱氨酸蛋白酶（Caspase）在细胞凋亡中发挥始动和效应作用。本文就其生物学特性及其在凋亡中的作用机制作一综述。
关键词：Caspase；细胞凋亡

细胞凋亡的原词Apoptosis由两个拉丁字组成。Apo指离开，ptosis是落下，意思是细胞凋亡有如秋天落叶，到一定时候即失去生命力，遂即脱落，细胞凋亡，又称程序性细胞死亡（Programmed cell death，PCD）是机体生长发育、细胞分化和病理状态中细胞自主性死亡过程，是细胞内由基因编码调控的，按严格程序执行的细胞自杀过程。通常需要30到60分钟，细胞凋亡形态学上的变化主要有DNA破碎，染色质凝集，细胞皱缩，线粒体肿胀和凋亡小体形成，而整个过程的结束以凋亡小体被吞噬为标志。多数类型细胞在凋亡的最后阶段发生细胞核DNA的降解：DNA降解成180-200bp或其倍数的片段，因此在琼脂糖凝胶电泳上可见到有特征性的梯形图谱。目前对凋亡的研究深入到分子水平，发现多种半胱氨酸蛋白酶（Cysteine aspartase）在细胞凋亡之中发挥着重要作用。
1、什么是Caspase
通过对美丽线虫（nematode caenorhabditis elegans）的细胞死亡机制的研究发现，至少有3个基因直接参与了细胞凋亡的调节。ced-3、ced-4直接介导细胞死亡，为促凋亡基因，其编码的蛋白分别为CED-3、CED-4、ced-3在细胞中起关键作用，称为线虫自杀基因，CED-3则称为死亡蛋白酶；ced-9则拮抗其作用，为抗凋亡基因，其编码的蛋白质为CED-9。后来发现CED-3与哺乳动物的白介素-1β转换酶（Caspase-1，原名为interleukin-1β-converting enzyme，ICE）具有高度同源性，CED-4，CED-9则分别与Apaf-1（apoptosis protease-activating factor-1）、Bcl-2同源。Bcl-2基因家族产物包括促进及抑制凋亡的两个蛋白质亚群[1]。哺乳动物的ICE类蛋白是一组半胱氨酸蛋白酶[2]；且有以下共同特点：①和ICE有同源性；②有高度保守QACXG（X为R、Q或G）五肽序列[3]；③有发挥酶活性所必须的半胱氨酸；④特异地裂解天门冬氨酸位点；⑤前体蛋白均无活性，均需经蛋白水解后才产生活性；⑥转染不同细胞可诱导凋亡。因它们均具有半胱氨酸和天门冬氨酸裂解位点，Alnemri将其命名为Caspase，其基因用Casp表示[4]； “C”代表半胱氨酸蛋白酶机制，aspase表示其能特异切割底物中在天冬氨酸（asp）后的肽键能力。目前在哺乳动物中发现至少16种Caspase，按其发现的先后顺序命名为Caspase-1～Caspase-16[5]。
2、Caspase的生物学特性
2.1 Caspase的结构特点
Caspase家族有相似的氨基酸序列，结构和底物特异性，通常以无活性的蛋白酶原（procaspase）形式存在细胞内合成和分泌（30-50KD）。后者由4个亚区组成：NH2-末端区（Prodomain）、大亚基（P17-20）、小亚基（P10-12）及连接大小亚基的连接区；各亚区间经蛋白水解后释放出Prodomain及连接区，使大小亚基结合成一活性的异四聚体并暴露出底物识别，结合和催化所需的氨基酸残基，即形成了活性的Caspase；Procaspase可自我催化及催化其他Procaspase产生活性蛋白酶，其蛋白水解级联功能类似凝血因子活化的“瀑布效应”[6]。Caspase的作用特点是能识别底物裂解位点NH2末端最少4个氨基酸并在天门冬氨酸后裂解底物，从而使其蛋白裂解行为具有高选择性。不同的Caspase因所识别的4个氨基酸的不同而具有明显的底物特异性，从而发挥各自不同的生物学功能。
2.2 Caspase家族成员及分类
Caspase分类较为复杂，通常根据蛋白酶序列的相似性分为三个亚族：Caspase-1亚族（Caspase-1、4、5、13）；Caspase-2亚族（Caspase-2、9）和Caspase-3亚族（Caspase-3、6、7、8、10）。
在Caspase家族成员中，Caspase-1、2、4、5、8、9、10、11等为调控Caspase，参与打靶和激活调控；Caspase-3、6、7、12、14等为效应Caspase，即参与凋亡的效应物。Caspase-1（白介素-1β-转换酶，ICE）是该家族中第一个被鉴定的成员，但它在细胞凋亡中并无十分明显的作用，主要参与IL-1β的成熟和转运。Caspase-8是启动者Caspases的重要代表，可通过与连接分子FADD的结合而活化，将凋亡信号传递到下游的效应Caspases分子。Caspase-14是该家族中的最新成员，主要表达于胚胎细胞中，成年期缺乏表达，由于分子结构中没有NH2-末端域，因此又被称为MICE（mini-ICE）。功能研究发现它能直接诱导细胞凋亡，但具体的信号转导途径高不清楚[7]。并不是所有Caspase都参与细胞凋亡反应，如Caspase-1、4、5、12等的作用主要是参与炎症反应。Caspase-3是迄今为止研究比较透彻的一个，它是主要的效应者分子。1994年Femandes-Alnemri等在人Jurkat T细胞系，首先克隆出CPP32（Caspase-3）基因，分为CPP32α和CPP32β。两者的阅读框均由831个核苷酸组成，编码277个氨基酸，相对分子质量约为32×103（32KD）。人Caspase-3基因定位于染色体4q33-q35.1处。Caspase-3酶原与CED-3蛋白有35%的一致性，58%的相似性，是已知哺乳动物中与CED-3相似性最高的一种。目前推测，Caspase-3酶原上 有4个酶切位点Asp9、Asp28（亦称P3切割点）、Asp175（亦称P17切割）和Asp181，后两个位点的切割产生P20（1-175氨基酸）和P11（181-277氨基酸）大小亚基，大亚基进一步在Asp28处切割去掉N末端前肽，而Asp9处的切割产生P19大亚基，其与Caspase-3酶原的自身活化有关。被切割形成的大亚基、小亚基结合成α2β2四聚体，成为有活性的酶。在蛋白酶级联切割过程中，Caspase-3处于核心位置，不同的蛋白酶分别切割Caspase-3酶原，从而激活Caspase-3；活化的Caspase-3又进一步切割不同的底物，导致蛋白酶级联切割放大，最终使细胞走向死亡[8]。因此Caspase-3被称为死亡蛋白酶。
2.3 Caspase的活化
Caspase的活化有两条主要途径[6，9]。一条由DD（death domain）介导，将Caspase-8募集到Fas（即CD95）、TNFR-1、DR3等受体复合物途径。细胞膜上的Fas、TNFR-1、DR3等死亡受体均含有DD，Caspase-8、10等则含有DED（death-effector domain），而procaspase-1，2，4，5，9含CARD（caspase recruitment domain）。DD、DED、CARD结构极其相似，可相互作用，在Caspase的活化中起关键的接合作用，称为接合器（adaptor）。以Fas受体为例，Fas受体激活后，FADD与募集而来的procaspase-8的DED结合形成信号复合物，使procaspe-8自我水解、活化，形成活性Caspase-8，后者再激活Caspase3、6、7等。另一途径由细胞色素C（cyto-c）介导。细胞内外各种死亡信号可诱导线粒体释放cyto-C。cyto-C再与Apaf-1结合，使Apaf-1发生构象改变，继而寡聚化。然后，Apaf-1的CARD区与Procaspase-9的N-末端的CARD区结合，形成cyto-c-Apaf-1-Procaspase-9“凋亡体”（apoptosome），从而使Procaspase-9活化并激活下游其他Caspase。
2.4 Caspase活化的调节
Caspase的活化可引起细胞凋亡。那么机体是如何抑制Caspase的过度激活百不发生病理性凋亡的呢？已知有三大类蛋白质参与Caspase活化的调节。
2.4.1 FLIP与ARC
目前发现有两种蛋白参与Caspase初始活化的调节即FLIP（FADD样的ICE抑制蛋白）和ARC（含有CARD的凋亡抑制蛋白）。[4、10]从Caspase的激活途径可以看出：调节Procaspase与接合蛋白的相互作用可抑制Caspase的活化。研究发现FLIP除没有关键的催化残基外，其序列与Procaspase-8相似，可与Procaspase-8竞争FADD的结合位点，达到阻止Caspase活化的目的；ARC可直接与多种Procaspase结合而阻止其活化。
2.4.2 Bcl-2家族
Bcl-2家族可调节cyto-c的释放，从而调节cyto-c介导的Caspase的活化[6,11]。Bcl-2家族成员是一组通道蛋白。主要位于线粒体、内质网及细胞核的外膜。BAX通过协助线粒体释放cyto-c而促凋亡；Bcl-2和Bcl-xL则可拮抗Bax的作用而明显抑制凋亡。另外，Bcl-2家族成员还可能直接与CED-4/Apaf-1结合，抑制cyto-c-Apaf-1-procaspase-9复合物的形成而阻止Caspase-9的激活；而Bax等其他促凋亡的家族成员则拮抗此种作用，增强CED4/Apaf-1的活性。
2.4.3 IAP（inhibitors of apoptosis protein）家族
迄今，IAP家族是哺乳动物唯一的内源性Caspase抑制剂。[12]它包括神经元凋亡抑制蛋白（neuronal apoptosis inhibitory protein,NAIP）、X染色体凋亡抑制剂（X chromosome-linked inhibitor of apoptosis,XIAP）、人凋亡抑制剂（human inhibitor of apoptosis,HIAP）、Survivin等，可特异性地抑制Caspase-3、7、9的活性，使始动Caspase及效应Caspase均受抑制而达到抗凋亡目的。
3、Caspase在细胞凋亡中的作用
Caspase-3缺乏的小鼠脑袋是正常的2倍。研究表明这种Caspase-3缺陷小鼠在大脑发育中缺乏脑细胞凋亡。这种小鼠于出生后1-3周即死亡且表现出神经系统发育的极度异常。[13]但Caspase并不抑制由低K+引起的小脑神经元凋亡[14]。Caspase蛋白酶家族成员在哺乳动物细胞凋亡中起重要作用：①灭活阻止细胞凋亡的细胞内物质。②通过对细胞结构的直接酶解而促进凋亡。③通过对一些细胞骨架调节相关蛋白质的酶解而改变细胞结构而导致细胞凋亡。④Caspase发挥作用的起点是其凋节区与效应区的分离。
4、Caspase导致凋亡的机理
细胞凋亡有两条途径。一个为线粒体依赖途径，另一个为死亡受体介导途径。
4.1线粒体依赖途径
4.1.1 MPT孔
MPT（mitochondrial permeability transiton）孔[15、16]是由膜内、外蛋白组成。当通道开放时，分子量≤1.5KD的分子均能自由通过，使线粒体内膜两侧的离子达到平衡，H+梯度消失而中断呼吸链。同时高渗状态的基质发生肿胀，致使无嵴的外膜较有嵴的内膜先破裂。这样，线粒体内外膜间的凋亡诱导蛋白就可以被释放到胞浆中，包括cytoC、AIF（apoptosis-inducing factor,即一种DNA酶）和Procaspe-2、3、9。cytoC的释放也可不依赖于MPT孔的开放，甚至大线粒体内膜保持完整的离子梯度下也能进行。其中的Procaspase-2、9已被证明存在于五个不同的器官（肝、肾、心、脑、脾）和不同的细胞系的线粒体内外膜间。[17]最近又有报告提出，细胞10-90%的Procaspase-3也存在于线粒体内外膜间，它们释放后使通过蛋白水解作用而自身激活。
4.1.2. Bcl-2家族在凋亡中的作用
Bcl-2、Bcl-XL和Bax能在线粒体外膜上形成离子通道，通过控制其开放而调节MPT。MPT提高后，线粒体就可以释放凋亡诱导蛋白，正常情况下Bcl-XL与Apaf-1结合，使Apaf-1不参与激活Procaspase-9。当细胞受到死亡信号刺激时，Bax可与Bcl-XL相互作用，去除Bcl-XL对Apaf-1的抑制作用。在cyto C被释放后和ATP充足时，游离于胞浆中的Apaf-1可通过其CARD与Procaspase-9结合，使Procaspase-9自身水解激活。Caspase-9随后激活效应型Caspase-3，Caspase-3再激活DFF/CAD（一种DNA酶）引起细胞凋亡。
4.1.3线粒体与Caspase
Caspase可直接诱导细胞凋亡，也可被死亡信号激活后，再激活第二信使如神经酰胺，Ca2+，Ｂcl-2的修饰，细胞内氧化还原水平的改变，Bax、Bak和C-Myc的过分表达等作用于线粒体再诱导凋亡。只有这样死亡信号才能够突现级联放大，加快细胞凋亡。
4.2死亡受体介导途径
死亡受体是TNF受体家族的成员，位于细胞膜表面，为I型膜蛋白，具有相似的结构：细胞外为半胱氨酸富集区，细胞内为死亡区（DD，death domain）。死亡区虽是死亡受体引起凋亡的结构基础，但有时也能抑制凋亡。[9]只有死亡受体与配体形成复合体后才能起作用；死亡配体大多为II型膜蛋白，由三个亚基组成，可同时与三个受体形成寡聚体。不同的死亡受体所诱导的凋亡过程在信号传导上极为相似，即受体先与配体形成寡聚体，接着适配子通过DD与受体结合，另一方面再通过适配子的DED与邻近的Caspase前体结合，活化Caspase而诱导凋亡，但不同的受体/配体系统在传递信号时又各有特点。[9，18]
CD95是最典型的死亡受体（又称FAS或APO-1），它参与人体的重要生理凋亡过程。CD95的配体是CD95L，每个CD95L能聚合三个CD95分子。通过核磁共振分析结构和突变研究，发现死亡区常易聚集在一起。FADD是一种适配子蛋白，它常常通过它的死亡区使受体死亡区发生聚合，并通过受体的死亡效应区，与Caspase-8的前体结合。然后Caspase-8发生自身裂解而被激活，并继而激活下游的效应型Caspase如Caspase-9。
5、结语与展望
作为凋亡机制中重要的效应子成分，Caspase家族参与多种与凋亡有关的生理和病理过程。在诸如生长因子撤除、热休克、细胞因子和DNA损伤剂等刺激作用下，细胞内多种凋亡信号传导途径被活化，最终将会聚于Caspase家族蛋白酶这一共同的遗传保守机制。在免疫系统方面，Caspase的作用更为突出，参与自体免疫性胸腺细胞，T细胞和B细胞的阴性选择，促使其成熟；[19]参与T细胞介导的细胞毒作用，并下调免疫反应。[20]在神经元凋亡中，Caspase也起着关键作用，因此参与一些神经变性疾病的发生。现代观点认为，肿瘤的发生发展不仅是细胞增殖异常的结果，而且与细胞凋亡异常有关。因此对Caspase的结构、特性及其在凋亡中的作用不断深入的了解，将有助于人类对生命奥秘的了解和对肿瘤等疾病的诊断和最终治疗。
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