动物行为生态学 实验申请.doc

国家大学生创新性实验计划项目申请书

项　目　名　称：三种猪I型干扰素基因的克隆与序列分析

姓 名：某某某

学 院：生 命 科 学 学 院

专 业：某某某某

学 号：…………

一、 申请理由（包括前期工作基础及项目成员具备的知识、兴趣、已取得的成绩及相关科研经历等）

干扰素(interferon，IFN)是由干扰素诱生剂诱导生物细胞后所产生的一类高活性多功能的糖蛋白。它是由Issaacs等于1957年利用鸡胚绒毛尿囊膜研究流感病毒干扰现象时发现的[1]。干扰素自从被发现以来，由于其广谱抗病毒、抗肿瘤活性及其强大的免疫调节作用而受到研究者们的重视。其中猪干扰素分为I型和II型，其中猪I型干扰素又分为a、B、(I)、6类型，而猪干扰素∞又称为猪干扰素Q 2，I型干扰素具有广谱抗病毒作用。为了研究和开发猪重组干扰素细胞因子类生物治疗制剂来控制猪的病毒性疾病.

二、选题依据（包括项目的学术价值、应用价值、国内外研究现状分析，并列出主要参考文献）
干扰素是一类重要的细胞因子，是由生物体细胞受到病毒或其它诱生剂的作用而产生的分泌性糖蛋白，具有抗病毒、抗细胞增殖、免疫调节等多种生物学活性。动物的干扰素在动物疾病的防治方面具有重要作用。它们不仅具有抗病毒、细菌和寄生虫等功能，还具有作为免疫调节剂调节免疫反应、促进增重等功能。根据IFN蛋白质的氨基酸结构、抗原性和细胞来源，可将其分为两类，即I型和II型。哺乳动物I型IFN又包括a、B、(I)、．c、6，前三个由病毒诱导合成；猪怀孕时滋养层细胞分泌的IFN一6为猪所特有，未在其它物种中发现嘲。IFN—a由17个以上不同的基因编码，IFN．B和IFN—Y的基因都只有一个。猪干扰素对生产中多种具重大威胁的病毒传染病，如猪繁殖与呼吸综合征、口蹄疫、猪瘟、猪伪狂犬等均具有很好的抑制和杀灭作用。Chinsan—gar锄等【3]的研究证实口蹄疫病毒对IFN—Q高度敏感，Moraes等‘4]用表达猪IFN一Ⅱ的重组腺病毒和表达FMDv A24 P1蛋白重组腺病毒联合免疫可以使猪体获得保护，抵抗口蹄疫病毒攻击。一系列体外试验表明【5．6】：用IFN—Y或重组IFN—Y处理感染繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的猪巨噬细胞，可抑制PRRSV增殖。猪白细胞干扰素预防乳猪疾病田间试验临床治疗试验发现‘7t8J，用猪自细胞干扰素给7日龄乳猪预防用药，连续注射2天，可减少发病率52。2％，减少死亡率12．9％。发病乳猪临床治愈率96．6％；用猪白细胞干扰素治疗自然发病猪疾病总有效率达95．4％，治愈率94％。目前，由于食品安的原因，许多人用抗病毒药物都已经禁止在动物上使用，如金刚烷胺、病毒唑和利巴韦林等，猪干扰素抗病毒制剂无疑是一个很好的替代品。中国作为为养猪大国，而病毒性疾病是影响养猪业的主要因素，具有良好抗病毒作用的猪干扰素有非常广阔的市场前景。本研究运用RT—PCR技术从长白猪外周血淋巴细胞中成功克隆到了三种猪I型干扰素基因，为进一步研究和开发利用猪干扰素制剂奠定了基础。
参考文献：
[1]Isaacs A，Lindenmann J．Virus Interference I．The Inter—
feron[J]．Proc R Soc Lond B Bi01 Sci，1957，147(927)：258—267．
[2]Domeika K．Porcine i衄unoregulatory cytokines wi th
specialreference to their induction by CpG contain—ing DNA[M]．In Department of Veterinary Microbiolo—gy，Section fOr I舳unoiogy．Uppsala：Swedish Universi—ty of Agricultural Sciences．2003
[3]chinsangaram J，Koster Mt Grub眦n M J．Inhibition of L—
deleted foot—and—mouth d=【sease virus replication byalpha／beta interferon involves double—stranded NA—dependent protein kinase[J]．J Vir01，200l，75(12)：498—5503．
[4]Moraes M P，Chinsangar锄J，Brum M c S，et a1．I啪ediate
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[5]Batista L，Pijoan C，Dee S，et a1．Virological and i唧u—
nological responses to porcine reprocluctiVe and res—piratory syndrome virus in a 1argepopulation of gilts[J]．C卸J Vet Res。2004，(68)：267—273．
L6]Bautista E鸭M01itor T．IFN g锄ma inhibits porcine rep—
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[7]郑永波，王加力，李克荣，等．猪白细胞干扰素在兽医临床上
的应用试验研究[J]．甘肃畜牧兽医，2003，(2)：23—25．
[8]秦耀明．猪白细胞干扰素的作用机理及临床应用[J]．当代畜
禽养殖业，2003，(10)：3卜33．
三、 研究方案（包括研究目标、研究内容、研究方法、实验方案和技术路线、可行性分析等）

根据6enBank中收录的三种猪I型干扰素(porcine interferon，pIFN)基因序列，设计了3对特异性引物。运用RT—PcR技术从长白猪外周血淋巴细胞总RNA中扩增得到了种猪干扰素基因，并将其克隆至pGEM—T Easy载体上。序列测定结果显示，获得的猪干扰素0【1基因序列全长570bp，编码189个氨基酸，获得的猪干扰素o【2基因序列全长540 bp，编码179个氨基酸，获得的猪干扰素D基因序列全长563 bp，编码186个氨基酸。三种猪I型干扰素基因与已知猪I型干扰素核苷酸序列和氨基酸序列的相似性最高可达99％～1 00％.
干扰素(interferon，IFN)是由干扰素诱生剂诱导生物细胞后所产生的一类高活性多功能的糖蛋白。它是由Issaacs等于1957年利用鸡胚绒毛尿囊膜研究流感病毒干扰现象时发现的[1]。干扰素自从被发现以来，由于其广谱抗病毒、抗肿瘤活性及其强大的免疫调节作用而受到研究者们的重视。其中猪干扰素分为I型和II型，其中猪I型干扰素又分为a、B、(I)、6类型，而猪干扰素∞又称为猪干扰素Q 2，I型干扰素具有广谱抗病毒作用。为了研究和开发猪重组干扰素细胞因子类生物治疗制剂来控制猪的病毒性疾病.
1.1 菌种、表达载体和试剂
1.2 引物的设计与合成
1.3 猪干扰素基因的RT-PCR扩增
1.4 猪干扰素基因倒的克隆与测序
1.5 猪干扰素基因的序列分析
2.1猪干扰素基因的RT-PCR扩增
2.2猪干扰素基因的克隆、鉴定于序列分析
当然这些步骤，有些学校条件可以满足。一些不能满足的，可以采取网上寻找条件弥补。
五、 项目进度安排（查阅资料、选题、设计项目研究方案、开题报告、实验研究、数据统计、处理与分析、研制开发、撰写研究论文和总结报告和成果推广等）

1. 首先查阅了一些资料，了解到目前的情况，并对研究的科研价值及市场价值作了评估

2. 确定研究猪干扰素的基因序列

3. 根据所学的知识和相关资料的掌握，设计研究的方案

4. 对实验目的，方案等作相应的报告，取得老师等的指导和建议，再对方案作出修改和改进

5. 准备好材料器材等开始进行实验研究观察，大概需要2年的时间实验研究

6. 记录现象和统计数据并作出分析得出结论

7.最后便是后期的论文的编写和总结报
六、 拟利用资源（科研教学设施、仪器设备、资料等）
pGEM—T Easy。反转录酶PrimeScriptTM、T4 DNA连接酶、DNA Marker、Ex Taq DNA聚合酶和dNTPs 大肠杆菌DH5 Q

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