miR-141-3p通过靶向生长分化因子-6对RANKL诱导RAW264.7破骨分化的影响.pdf

基金项目：武汉市卫健委中医类科研重大项目（）；武汉市卫健委中医类科研指导项目（）作者单位：武汉，武汉市中医医院骨伤科通信作者：鲁铭，：基础研究 通过靶向生长分化因子 对 诱导 破骨分化的影响戴燚，范彦博，胡丽娟，唐光平，刘静，徐平，鲁铭摘要 目的研究 通过靶向生长分化因子（，）对 诱导的 细胞在破骨分化中的调控作用。方法 细胞使用 处理，诱导分化为破骨细胞，通过 和 法检测 及抗酒石酸酸性磷酸酶（，）、组织蛋白酶 （，）的表达水平，同时 检测 的表达。实验分为未诱导组、诱导并转染载体对照组（）和 诱导并转染 过表达载体组（），对各组细胞进行 染色，和 法检测破骨相关指标、金属蛋白酶 （，）、金属蛋白酶 （，）及 的表达水平，同时 检测 的表达水平。实验分为过表达对照组（）、过表达 组（）、敲低对照组（）、敲低 组（）及过表达 转染过表达 载体组（），检测方法同上，对各组细胞进行 染色，和 法检测破骨相关指标、及 的表达水平，同时 检测 的表达水平。通过双荧光酶实验检测 和 的靶向关系。结果 与未诱导组相比，诱导分化 后细胞内、表达水平升高（），同时 表达水平降低（）。转染载体后，向破骨细胞的分化受到抑制，、表达降低（），染色阳性的破骨细胞数目减少。转 染 后，向破骨细胞分化受到促进，染色阳性的破骨细胞数量增多，破骨相关标志物、表达升高（），表达降低（）。转染 抑制剂后，上述实验结果与模拟物组相反，向破骨细胞分化受到抑制。与 模拟物组相比，转染细胞后，可以在一定程度上拮抗 模拟物对破骨细胞分化的促进作用。双荧光素酶实验结果表明 可以与结合，抑制荧光素酶活性。结论 促进 诱导 向破骨细胞分化，其可能是通过靶向抑制 完成对破骨细胞分化的调控。关键词 破骨细胞；细胞分化；生长分化因子；中图分类号：文献标志码：，中华骨质疏松和骨矿盐疾病杂志 年 月第 卷第 期 ，（）（）（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），；骨质疏松症（，）是一种常见的骨代谢疾病，主要以骨强度下降、骨量减少、骨微结构损伤为特征。骨质疏松症常发生于绝经后妇女和老年人，对人类健康危害极大。随着人口老龄化加剧，骨质疏松症对人类健康和社会经济的影响将进一步增加。骨质疏松的发生与破骨细胞（，）介导的骨吸收有密切关联，破骨细胞起源于造血干细胞，与单核细胞和巨噬细胞密切相关，是介导骨吸收发生的主要功能细胞，。破骨细胞介导的骨吸收与成骨细胞介导的骨生成共同维持着骨微环境的稳态。因此，了解破骨细胞的分化形成，对于骨质疏松的诊断、治疗和预防至关重要。是一种小的内源性 分子，通过在转录后水平上靶向 控制基因的表达。近年来很多研究发现，许多 参与破骨细胞与成骨细胞的分化调控，进而参与骨质疏松的发生与发展。在 等的研究中，可以通过抑制 的翻译抑制 诱导的成骨细胞分化。而 对破骨细胞的分化是否具有调控作用尚未见报道。骨形态发生蛋白（，）是转化生长 因 子（，）超家族的成员，研究发现它们具有诱导软骨形成的能力，并且在骨重塑和再生以及骨形成过程中发挥着重要的调节作用。生长分化因子（，）是骨形态发生蛋白（，）的成员之一，也称为。最初发现于牛的软骨组织中，其主要在关节及软中华骨质疏松和骨矿盐疾病杂志 年 月第 卷第 期 ，骨中表达，参与调节骨和软骨的生长及分化，在早期胚胎发育的成骨和软骨形成之间的平衡中起着重要的调节作用。研究表明体内 突变及失活可以导致一些颈椎、关节韧带和软骨形成缺陷相关的疾病。目前关于 的研究多集中在软骨形成和成骨诱导分化，其在破骨细胞分化相关的研究同 一 样 并 不 多 见，同 时，本 研 究 在网站上预测到 为 的靶基因之一。本研究，选择用核因子 活化因子受体配体（，）诱导 分化为破骨细胞系，采用细胞转染 模拟物及抑制剂，细胞转染过表达 质粒的方法，探究 及 对 细胞向破骨分化的影响，采用双荧光素酶实验进一步验证与 的靶向互作关系，为研究具有调节破骨细胞分化潜力的 提供更多重要信息。材料与方法实验材料实验细胞：细胞购自广州吉妮欧。试剂：购自 公司（货号：）；模拟物、模拟物、抑制剂、抑制剂、过表达 质粒、野生型（）报告质粒及 突变型（）报告质粒均购自上海吉玛生物有限公司；购自武汉普诺赛公司（货号：）；反转录试剂盒、均购自诺唯赞公司（货号：、）；购自美国 公司（货号：）；兔多抗抗酒石酸酸性磷酸酶（，）、（）、购自 公司（货号：、）；兔多抗金属蛋白酶 （，）、金属蛋白酶 （，）购自武汉三鹰公司（货号：、）；染液试剂盒购自 （货号：）；双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自碧云天生物公司（货号：）。仪器：实时荧光定量 仪购自美国 公司；垂直电泳仪及电转仪购自北京六一仪器厂；光学显微镜购自日本尼康；化学发光免疫分析仪购自石家庄康普生科技有限公司。破骨细胞诱导 细胞使用含 和 青霉素和链霉素的 培养，在 ，培养箱中培养过夜；然后换含 的完全培养基继续培养，隔天换液 次，培养 后光镜下看到大片细胞融合即破骨细胞。细胞转染将 个对数期生长的 细胞接种于 孔培养板中，等密度约为 时，根据脂质体 转染说明书分别转染 模拟物、模拟物对照、抑制剂、抑制剂对照。细胞处理及分组 细胞用 诱导分化 ，按实验分组进行细胞处理。细胞分组：未诱导组；组；组。细胞分组：模拟物对照；模拟物；抑制剂对照；抑制剂；抑制剂。检测 诱导处理 细胞 后收集各组细胞样本，法提取细胞内总，然后使用反转录试剂盒将 反转录成，利用 检测各组细胞 表达水平。反应 体 系：的 ，正向引物（），反 向 引 物（），最后加 至总体积为 。为两步法检测，扩增程序如下：预变性 ；，个循环，在每一循环的退火阶段收集荧光。荧光定量 结束后，中华骨质疏松和骨矿盐疾病杂志 年 月第 卷第 期 ，收集熔解曲线。以 作为内参基因，每个样本设置 个重复，采用 法计算并分析目的基因的表达水平，目的基因引物序列参见表。法检测 诱导处理 细胞 后，按细胞分组收集各组细胞，用 蛋白提取试剂盒提取细胞总蛋白，操作步骤参考说明书。提取的总蛋白进行 电泳，然后转移至 膜上，用含 脱脂奶粉的 室温封闭 ，分别加入 一抗（稀释）、一抗（稀释）、一抗（稀释）、一抗（稀释）、一抗（稀释），孵育过夜，清 洗 次，加 入 标 记 的 二 抗（稀释），室温下孵育 ，清洗 次，利用 化学发光法进行显色，压片后扫描胶片，用 分析胶片灰度值。染色各组细胞爬片室温固定后，按 染色试剂盒说明书进行 染色，染色完成后，常规脱水，透明，中性树胶封片，显微拍照。双荧光素酶实验实验分为 组，野生型模拟表 目的基因的引物序列 基因引物序列（）正向：反向：正向：反向：正向：反向：正向：反向：正向：反向：正向：反向：物对 照 组：细 胞 共 转 野生型报告质粒和模拟物对照；野生型 模拟物组：细胞 共 转 野 生 型 报 告 质 粒 和 模拟物；突变型抑制剂对照 组：细胞共转 突变型报告质粒和抑制剂对照；突变型 抑制剂组：细胞共转 突变型报告质粒和 抑制剂。转染 后参照双荧光素酶报告基因检测试剂盒说明书操作步骤进行检测。统计学方法采用 统计学软件对数据进行处理分析，实验数据以均数标准差（）表示，组间比较用 ，为差异有统计学意义。结 果 诱导后 细胞相关基因和蛋白的表达将 细胞用 的 诱导处理 ，诱导组 细胞出现多个体积增大的多核细胞（破骨细胞），细胞呈球形膨大 状。与 未 诱 导 组 相 比，诱 导 后 细胞中 和 在 和蛋白水平表达均上调（），在 和蛋白水平表达下调（），表达上调（）（图）。过表达 抑制破骨细胞分化与未诱导组相比，组细胞 表达上调（）；与 组相比，过表达 后，表达没有显著变化（）；与未诱导组相比，组细胞中、表达均上调（），表达下调（）；与 组相比，过表达 后，细胞中、表达均下调（），细胞中 表达上调（）（图）。过表达 可以显著抑制破骨细胞相关标志物、的表达。中华骨质疏松和骨矿盐疾病杂志 年 月第 卷第 期 ，图 诱导后 细胞相关基因和蛋白的表达 ：生长分化因子；：抗酒石酸酸性磷酸酶；：组织蛋白酶；：核因子 活化因子受体配体；与 比较，图 和 法检测破骨细胞相关基因和蛋白的表达 ：生长分化因子；：抗酒石酸酸性磷酸酶；：组织蛋白酶；：金属蛋白酶；：核因子 活化因子受体配体；与 比较，；与 比较，染色实验结果显示，处理促进 细胞向破骨细胞分化，破骨细胞经 染色呈阳性。与未诱导组相比，组 中 阳 性 细 胞 数 明 显 增 多；组相比，组 阳性多核细胞数量显著降低（图）。促进破骨细胞分化 和 实验结果表明，与模中华骨质疏松和骨矿盐疾病杂志 年 月第 卷第 期 ，图 染色结果（）（）染色阳性细胞胞质为酒红色，胞核着蓝紫色，多个核聚集在一个细胞中，整个细胞呈紫红色膨大球状，该种形态的细胞即为破骨细胞拟物对照 组相比，模拟物组 表 达 下 调（），、表达均上调（）；与 抑 制 剂 对 照 组 相 比，抑制剂组 表达上调（），、表达均下调（）；与 模拟物组相比，模拟物组 基因表达上调（），表达无明显变化（），、表达均下调（）（图）。与 模拟物对照 组相比，模拟物组破骨细胞数量增多；与 抑制剂对照 组相比，抑制剂组破骨细胞数量减少；与 模拟物组相比，模拟物 组破骨细胞数量减少。双荧光素酶实验检测 对 的靶向作用本实验显示与 模拟物 组相比，模拟物组荧光素酶活性下降（），而 模拟物 组与 模拟物组荧光素酶活性无显著变化（）（图）。讨 论破骨细胞属于高度分化的多核细胞，其本身不能增生传代，目前也不存在永生化的破骨细胞系。破骨细胞的分化主要依赖于巨噬细胞集落刺激 因 子（，）、骨 保 护 素（，）等因子的调控作用。细胞是小鼠破骨前体细胞，诱导分化后，可大量表达、降钙素受体（，）等。破骨细胞中，呈特异性高表达，与骨吸收活性正相关；的分泌也可以诱导破骨细胞生成，故 和 也可作为破骨细胞分化增强标志物。处理 细胞后，于光镜下观察发现多核细胞出现，同时破骨细胞相关分子 和 表达均升高，表明细胞向破骨分化，同时在破骨分化过程中，表达升高，表达降低。目前很多研究表明 在骨形成中具有抑制作用，可以延缓或者抑制骨的形成。等研究发现，培养基中添加，人骨髓间充质干细胞（，）成骨分化能力显著降低，其标志基因 相关转录因子 （，）、碱性磷酸酶（，）等表达降低，活性受到抑制，这些都表明 可以抑制 的成骨分化。在早期颅骨发育中，抑制冠状动脉缝合线间质的成骨分化，但不抑制边界形成；基因缺陷小鼠的颅骨骨缝结合区域表达出更高的成骨标记基因 和，。在破骨中华骨质疏松和骨矿盐疾病杂志 年 月第 卷第 期 ，图 和 检测破骨细胞相关基因和蛋白的表达量 ：生长分化因子；：抗酒石酸酸性磷酸酶；：组织蛋白酶；：核因子 活化因子受体配体；与 比较，；与 模拟物比较，图 双荧光素酶实验验证 与 靶向关系 ：生长分化因子；与模拟物 比较，细胞分化中的相关研究尚未见报道，本研究 实验结果表明，过表达 可在一定程度上 降 低 诱 导 的 破 骨 细 胞 数 量。过表达也显著抑制、和 在 和蛋白水平的表达，表明过表达 可以抑制 诱导的破骨细胞分化。是 近 几 年 发 现 的 一 类 非 编 码 小，其通过与靶基因 或者编码区结合，抑制靶基因 翻译或者促进 降解，从而起到转录后调控作用，其具有一对多和多对一的特征。随着对 研究的不断深入，针对其在破骨分化中的研究也逐步展开，越来越中华骨质疏松和骨矿盐疾病杂志 年 月第 卷第 期 ，多的 参与破骨细胞的分化调控。等通过生物信息学和双荧光素酶报告基因分析证实，在破骨细胞生成过程中上调，可能通过靶向 激活 信号通路促进破骨细胞生成和骨吸收。作为 通过海绵化 促进 的表达，促进 诱导的 细胞增生、迁移和分化。等研究表明，通过抑制 的表达促进破骨细胞分化，是 的直接靶标。酮胆固醇诱导的 通过靶向 增加破骨细胞的数量和活性。研究 与其与靶基因的作用模式十分重要。选择用脂质体转染 模拟物及抑制剂分别增加和敲低 在破骨细胞的表达，综合各个实验结果表明，细胞水平过表达 可以促进破骨细胞分化，抑制 表达可以抑制破骨细胞分化，而过表达 可以在一定程度上抑制 模拟物诱导的破骨细胞分化。在 诱导 向破骨细胞 分 化 过 程 中，对 基 因和蛋白水平表达的影响，符合 与靶基因的作用规律。本研究预测并验证了 是 的靶基因，其结合位点位于 的 区。在转录水平和蛋白水平上直接影响 的表达。综上 所 述，对 诱 导 的 细胞的破骨分化具有促进作用，该促进作用是通过靶向抑制 基因表达实现。因此，可能是骨质疏松症治疗的一个潜在靶点，这为骨质疏松的研究提供了新的切入点和有效信息。参 考 文 献王云龙 杨梅苷对破骨细胞的抑制作用及其机制研究 兰州：甘肃中医药大学，：？，：，：，：，：，：周灿权，古芳 重视卵巢储备功能减退与卵巢早衰对女性健康的影响 中国实用妇科与产科杂志，：，：轩诗杰 甲状旁腺激素对去势大鼠骨髓间充质干细胞生物学特性影响的研究 中国人民解放军空军军医大学：第四军医大学，：，：，（），：汪艳，黄慧 微小核糖核酸在骨重建中的作用 国际口腔医学杂志，：，：，：张昊，张长春，朱坤，等 生长分化因子 研究进展 安徽医学，：，：许丹，律颖，朱小语，等 小鼠单核巨噬细胞白血病细胞（）的培养及其在诱导破骨细胞中的应用 中国骨质疏松杂志，：，：中华骨质疏松和骨矿盐疾病杂志 年 月第 卷第 期 ，：，：，：，：孟加弘 梓醇调控破骨细胞分化和骨吸收功能的机制研究及其治疗应用 杭州：浙江大学，：谢亘青 调控破骨细胞分化及其在绝经后骨质疏松症中作用机制 长沙：中南大学，：，：，：，：，：陈泽策，龙茜，管晓燕，等 调控破骨和成骨分化作用在正畸治疗中的研究进展 口腔疾病防治，：，：，：，：（收稿日期：）中华骨质疏松和骨矿盐疾病杂志 年 月第 卷第 期 ，