miR-139-5p增强二甲双胍抑制正常糖培养下人胰腺癌细胞系PANC-1增殖.pdf

年 月第 卷 第 期基础医学与临床 收稿日期：修回日期：基金项目：国家自然科学基金（）；中国医学科学院医学与健康科技创新工程（）通信作者（）：对本文有相同贡献文章编号：（）研究论文 增强二甲双胍抑制正常糖培养下人胰腺癌细胞系 增殖余 洁，马明磊，张化冰，平 凡，李 伟，许岭翎，李玉秀 中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院 内分泌科 国家卫生健康委员会内分泌重点实验室，北京；首都医科大学附属北京世纪坛医院 内分泌科，北京 摘要：目的 研究不同葡萄糖浓度培养条件下，二甲双胍（）对人胰腺癌细胞系 增殖的影响，并确定 是否参与此过程。方法 采用梯度浓度的二甲双胍（、）分别在 葡萄糖高糖（）组或 葡萄糖正常糖（）组培养条件下处理 细胞。培养 后，检测细胞的增殖、凋亡、迁移及细胞周期。通过 检测 的表达情况，同时将 模拟物转染到 细胞中以明确其作用。结果 无论是在，还是 培养条件下，二甲双胍均可抑制 细胞的增殖、促进细胞凋亡（），并诱导细胞周期阻滞在 期和 期（）。在 培养条件下，二甲双胍的抗增殖和促凋亡作用更显著（）。此外，仅在 培养条件下，二甲双胍使 的表达上调（），且模拟物可以抑制该培养条件下无二甲双胍干预下 细胞的增殖（），并增强 二甲双胍的抗增殖作用和 二甲双胍的促凋亡作用（）。结论 在正常糖培养条件下，二甲双胍对 细胞增殖的抑制、对细胞凋亡的诱导以及细胞周期阻滞作用均较高糖培养条件下更为显著。这些作用部分可能与上调 有关。关键词：胰腺癌；二甲双胍；葡萄糖；微；中图分类号：文献标志码：，；，：（），（）（，）（，），余洁 增强二甲双胍抑制正常糖培养下人胰腺癌细胞系 增殖 ，：；胰腺癌（）是一种高度恶性的肿瘤，的患者在被发现时已经发生了转移。转移主要发生在胰周和腹腔脏器，导致中晚期病情较为严重，预后非常不好。据流行病学研究显示，与非糖尿病患者相比，糖尿病患者的肿瘤发生更为普遍。在糖尿病或糖尿病前期人群中，患胰腺癌的相对风险在 至 之间。一项荟萃分析表明，空腹血糖每升高 ，患胰腺癌的风险就会增加。二甲双胍（，）作为一种降糖药物，近年来越来越多的研究证明它还具有抗肿瘤的潜能，然而，不同的葡萄糖水平是否会影响其抗肿瘤作用，结论尚不统一。此外，研究发现二甲双胍可能通过调控微（，）表达抑制胰腺癌细胞增殖，而一些研究发现 具有抑制细胞增殖的作用。但是，二甲双胍的抗肿瘤作用是否与 相关目前尚无研究报道。材料与方法 材料 细胞系：人胰腺癌细胞系（中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库）。试剂（盒）：细胞增殖检测试剂盒、试剂盒、染色液（广州锐博生物技术有限公司）；反转录试剂盒、荧光定量 试剂盒（公司）。实验方法 培养细胞：将细胞置于含有 葡萄糖高糖（，）组或 葡萄糖正常糖（，）组胎牛血清的 培养基中，并在含有 的 恒温培养箱中培养。分别加入不同浓度的二甲双胍（、）处理细胞 ，对细胞的增殖、凋亡、迁移及细胞周期进行检测。重复样本数。转染：使用 对细胞进行 模拟物和阴性对照转染。法检测细胞增殖：取对数生长期的 细胞，以 个 细胞的浓度接种于 孔板中。后，分别加入不同浓度的二甲双胍（、）处理细胞 。接着，使用 细胞增殖检测试剂盒来检测细胞的增殖情况。通过使用 细胞仪进行图像采集，并且用增殖细胞数除以总细胞数计算出细胞增殖率。检测细胞凋亡：取对数期的 细胞，以个 的浓度在 孔板中接种。后，分别加或不加二甲双胍（）处理 。采用 试剂盒鉴定凋亡细胞中的 片段。用 细胞仪进行图像采集，用凋亡细胞数除以总细胞数计算细胞凋亡率。划痕实验检测细胞迁移：将对数生长的 细胞以浓度 个 接种在带有 细胞接种限位塞的 孔板（）中。利用 塞子工具谨慎移除硅胶塞子，在板中心创建了一个大约 直径的无细胞区。经过 的二甲双胍（浓度为 ）处理，使用 染色，细胞仪进行检测。中基础医学与临床 （）心的无细胞区域将被从周边区域迁移过来的细胞所填充，体现细胞的迁移能力。细胞周期的检测：将对数期的 细胞用胰蛋白酶进行消化，调整到浓度为 个，接种在 孔板中。进行二甲双胍处理（浓度分别为 ），持续 。使用 染色法来检测细胞的周期，并通过 细胞仪来分析并计算出处于各个细胞周期的细胞的比例。定量检测 的表达：使用反转录试剂盒进行 合成，利用荧光定量 试剂盒进行 检测。选择小 作为内参，引物序列如下：（）：，（）：。统计学分析数据表示为平均值标准差（）。为比较组间的差异，使用了双向方差分析，联合 或 事后检验。所有绘图和统计分析在 软件完成。结果 二甲双胍可抑制 细胞增殖、促进细胞凋亡、抑制细胞迁移，诱导 期和 期阻滞 细 胞 在 和 培 养 环 境 下，及以上浓度的二甲双胍均能抑制其生长（）（图），及以上浓度的二甲双胍均能促进其凋亡（）（图），这种作用在 培养条件下更为显著，高剂量的二甲双胍（或 ）几乎能完全抑制 细胞的生长，并能导致 的细胞凋亡（）（图 ，）。然而，仅在 培养条件下中，及以上浓度的二甲双胍可抑制 细胞的迁移（）（图，）。在 组中，及以上浓度的二甲双胍能降低 期细胞的比例，提高 期和 期细胞的比例（）（图）；在 组中，及以上浓度的二甲双胍能降低 期细胞的 比 例，提 高 期 和 期 细 胞 的 比 例（）（图）。二甲双胍对 细胞周期的作用在 组比 组更为显著（）（图）。正常糖培养条件下，二甲双胍 干 预 上 调 细胞中 表达在无二甲双胍处理下，高糖组和正常糖组中的 表达量差异无统计学意义。在二甲双胍处理后，正常糖组中的 表达量上调，高糖组中的变化则无统计学意义，其中 和 的二甲双胍处理分别使正常糖培养条件下的 细胞中 表达量增加了 倍和 倍（图，）。正常糖培养条件下，可增强二甲双胍的抗肿瘤作用在无二甲双胍干预且处于正常糖培养条件下，相较于 组，模拟物组的 细胞增殖下降，凋亡增加但未达统计学差异，细胞周期无影响。高糖培养条件下，两组之间的上述指标差异均无统计学意义（图，；图，）。二甲双胍干预正常糖培养条件下，模拟物组与 组相比，二甲双胍抑制增殖作用增强，二甲双胍促进凋亡作用增强，二甲双胍对细胞 期阻滞的作用减弱（），而在高糖组 模拟物对二甲双胍的作用影响无统计学意义（图，；图，）。无论是否存在二甲双胍的干预，相较于高糖组，模拟物在正常糖组中对细胞的凋亡诱导作用表现得更为显著，使正常糖组中的 细胞具有更低的 期比例和更高的 期以及 期比例（图，；，）。讨论该研究发现二甲双胍可以抑制 细胞的增殖，诱导其凋亡，并促使细胞周期阻滞在 期和 期。在正常糖培养条件下，这些作用更为显著。另外，只有在正常糖培养条件下，二甲双胍处理的 细 胞 中 的 表 达 增 加，模拟物可增强二甲双胍的抗肿瘤作用。既往研究已证实二甲双胍具有抗肿瘤作用，且在多种肿瘤相关研究中得到证实。然而，关于不同的葡萄糖培养浓度对二甲双胍作用的影响，研究结论仍不一致。部分研究发现，二甲双胍仅在正常葡萄糖培养条件下抑制肿瘤细胞增殖；另一研究则余洁 增强二甲双胍抑制正常糖培养下人胰腺癌细胞系 增殖，；，；，；：，；，；图 二甲双胍对人胰腺癌细胞系 细胞增殖、凋亡、迁移的影响 ，（，）发现，在高葡萄糖培养条件下，二甲双胍能抑制甲状腺癌细胞增殖，但在正常葡萄糖培养条件下，二甲双胍能够促进甲状腺癌细胞的凋亡，部分支持该研究结果。可能的机制是仅在正常糖培养条件下，二甲双胍可以诱导内质网应激和自噬，并可通过抑制肿瘤细胞产生 进而诱导细胞凋亡。此外，该基础医学与临床 （）（）；（）；，图 二甲双胍对 细胞周期的影响 （，）研究发现二甲双胍仅在正常糖培养条件下诱导 细胞中 表达上调，且 可增强二甲双胍的抗肿瘤作用，提示表达上调可能也是二甲双胍在正常糖培养条件下抗肿瘤作用更强的重要机制之一。因此，相对较低的血糖水平可能可以提高肿瘤细胞对二甲双胍抗肿瘤作用的敏感性，提示糖尿病合并胰腺癌患者应积极进行降血糖治疗。其次，既往的研究显示二甲双胍可以使某些肿瘤细胞停滞在 期，但本研究发现，二甲双胍导致细胞停滞在 期和 期，这与之前的一些研究结果不一致。这种差异可能与二甲双胍的干预时长有关，在此前的研究中，二甲双胍的使用时间从 到 不等。另外，吉西他滨是一种通过诱导细胞周期 期阻滞来发挥抗肿瘤作用的药物，被视为胰腺癌的一线化疗药物。体内外的研究显示，二甲双胍与吉西他滨联合可增强吉西他滨单独使用的效果。因此，二甲双胍与吉西他滨或其他针对细胞周期 期或 期的药物联合使用可能具有协同增强的抗肿瘤效果，有望给患者带来更多的获益。余洁 增强二甲双胍抑制正常糖培养下人胰腺癌细胞系 增殖 ；：；图 不同葡萄糖培养条件下 在二甲双胍干预前后的表达差异 （，），；，；，；，图 模拟物对高糖或正常糖条件下培养的 细胞增殖和凋亡的影响 （，）基础医学与临床 （），；，；，；，；图 模拟物对高糖和正常糖条件下培养的 细胞周期的影响 （，）本研究存在一些局限性，包括：）未通过沉默 来进行反向验证，以双向确认其作用；）未进行有或无糖尿病的肿瘤诱导小鼠实验。综上，在正常糖培养条件下，二甲双胍抑制 细胞增殖、诱导凋亡和细胞周期阻滞的作用较高糖培养条件下更显著，部分可能与上调有关。未来还需进行更多的基础与临床研究进一步证实。余洁 增强二甲双胍抑制正常糖培养下人胰腺癌细胞系 增殖参考文献：，：，：，：，：，：，：，：，：，：，：，：，：，：，：，：，：，：，：，：