引物设计原理.pptx

PCR引物设计原理PCRPCR反应一般由三个步骤组成反应一般由三个步骤组成：模板的热变性模板的热变性；引物复性到单链模板上引物复性到单链模板上；热稳定热稳定DNADNA聚合酶催化的聚合酶催化的延伸延伸变性变性p在应用在应用 Taq DNA Taq DNA 聚合酶进行聚合酶进行 PCR PCR 时，变性时，变性温度在温度在94-9594-95下进行，这也是下进行，这也是Taq DNATaq DNA聚合聚合酶进行酶进行3030个或个或3030个以上个以上PCRPCR循环而活力不受到循环而活力不受到过多损失时能耐受的最高温度。过多损失时能耐受的最高温度。p有时把变性时间设计为有时把变性时间设计为 5min5min，以便大分子模，以便大分子模板板 DNA DNA 彻底变性的概率。彻底变性的概率。p对于对于 GC GC 含量为含量为 55%55%或更低的线性或更低的线性 DNA DNA 模模板，推荐板，推荐 PCR PCR 的变性条件是的变性条件是 94-95 94-95 变性变性45s45s。复性温度（复性温度（退火温度退火温度）至关重要！）至关重要！退火温度太高，退火温度太高，引物不能与模板很好地复性，引物不能与模板很好地复性，扩增效率会非常低；扩增效率会非常低；退火温度太低，退火温度太低，引物将产生非特异性复性，从引物将产生非特异性复性，从而导致非特异性而导致非特异性DNADNA片段的扩增；片段的扩增；退火温度，通常比理论设计的引物和模板的退火温度，通常比理论设计的引物和模板的TmTm值值低低 3-5 3-5 下进行。下进行。最好通过对最好通过对复性温度复性温度比两条比两条引物的引物的Tm Tm 值低值低 2-2-10 10 内进行内进行PCRPCR预实验（梯度）来对复性条件预实验（梯度）来对复性条件的优化的优化。引物和模板引物和模板DNA 的复性的复性对对 Taq Taq DNA DNA 聚合酶来说，最适温度为聚合酶来说，最适温度为72-72-78 78，时间约为，时间约为1min1min。引物的延伸与循环数目引物的延伸与循环数目哺乳动物哺乳动物 DNA DNA 为模板时，至少进行为模板时，至少进行2525个循环个循环才能得到足够量的扩增产物。一般为才能得到足够量的扩增产物。一般为30-3330-33个个循环。循环。引物设计要点引物设计要点（1 1）碱基组成：）碱基组成：GCGC含量应在含量应在40%-60%40%-60%（45%-55%45%-55%）之间，）之间，4 4中中碱基在引物中分配均匀。没有多聚嘌呤或多碱基在引物中分配均匀。没有多聚嘌呤或多聚嘧啶序列，如聚嘧啶序列，如AAAAAAAAAA等，没有二核苷酸重复等，没有二核苷酸重复序列，如序列，如GCGCGCGCGCGC等；等；（2 2）引物长度：）引物长度：引物中与模板互补的区应为引物中与模板互补的区应为18-2518-25个个核苷酸长核苷酸长度，上下引物长度度，上下引物长度差别不能大于差别不能大于3bp3bp，如上游，如上游引物为引物为19bp19bp，下游引物为，下游引物为24bp24bp等。等。（3 3）重复或自身互补序列：）重复或自身互补序列：形成发夹结构，会阻止引物和模板之间的复形成发夹结构，会阻止引物和模板之间的复性。性。（4 4）上下引物的互补性：）上下引物的互补性：一个引物的一个引物的33末端序列不允许结合到另一个引物的任末端序列不允许结合到另一个引物的任何位点上，因为何位点上，因为PCRPCR中引物浓度较高，会形成引物二中引物浓度较高，会形成引物二聚体。聚体。当一个当一个PCRPCR有多对引物时，注意检查任何一个有多对引物时，注意检查任何一个33末端末端都不能和都不能和 其他任何引物互补。其他任何引物互补。（5 5）解链温度（）解链温度（Tm Tm 值）：值）：计算出来的两个引物的计算出来的两个引物的 Tm Tm 值相差不能大于值相差不能大于5 5，扩增产物的，扩增产物的 Tm Tm 值与引物的值与引物的 Tm Tm 值相差不值相差不能大于能大于10 10；引物的；引物的 Tm Tm 值一般为值一般为50-7050-70。这些特性保证了扩增产物在每一个这些特性保证了扩增产物在每一个 PCR PCR 循环循环可有效变性。可有效变性。（6 6）33末端末端3 3末端的性质非常关键。末端的性质非常关键。如果可能的话，每个引物的如果可能的话，每个引物的3 3末端碱基为末端碱基为G G或或C C；最；最好不要好不要A A，或，或AAAA等多聚等多聚A A；但不推荐但不推荐3 3末端有末端有.NNNCG.NNNCG或或.NNNGC.NNNGC序列的引物，序列的引物，GCGC高自由高自由能促进发夹及引物二聚体产生。能促进发夹及引物二聚体产生。当末端碱基为当末端碱基为 A A 时，错配时引发链合成的效率大大时，错配时引发链合成的效率大大降低；降低；当末端碱基为当末端碱基为T T时，错配情况下亦能引发链的合成，时，错配情况下亦能引发链的合成，所以一般所以一般 PCR PCR 反应中，引物反应中，引物3 3末端的碱基最好选末端的碱基最好选T T、C C、G G，而不选，而不选A A。引物引物33端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为差异，当末位的碱基为A A时，即使在错配的情况下，时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为也能有引发链的合成，而当末位链为T T时，错配的引时，错配的引发效率大大降低，发效率大大降低，G G、C C错配的引发效率介于错配的引发效率介于A A、T T之之间，所以间，所以33端最好选择端最好选择T T。？。？（7 7）5 5端序列添加限制性酶切位点：端序列添加限制性酶切位点：一些概念一些概念有意链（有意链（Sense strandSense strand），正义链（），正义链（positive positive strandstrand），编码链（），编码链（coding strandcoding strand）；无意链（）；无意链（anti-anti-sense strandsense strand），负义链（），负义链（negative strandnegative strand），模板），模板链（链（template strandtemplate strand）正向引物正向引物 （forward primerforward primer）：处于：处于DNADNA双链上游的引物。如用双链上游的引物。如用于测序，则从于测序，则从5 533方向读出方向读出 DNADNA正链的序列。正链的序列。反向引物反向引物 （Reverse primerReverse primer）：处于目的：处于目的DNADNA双链下游的引物。双链下游的引物。如用于测序，则读出如用于测序，则读出 DNADNA负链从下游到上游的反向序列。负链从下游到上游的反向序列。PrimerPremier 5.0 软件设计引物软件设计引物是由加拿大的是由加拿大的 Premier Premier 公司开发的专业用于公司开发的专业用于PCRPCR或测序引物以及杂交探针或测序引物以及杂交探针的设计、评估的的设计、评估的软件软件主要界面分为序列主要界面分为序列编辑窗口编辑窗口（genetankgenetank）、）、primer designprimer design、酶切分析酶切分析（restriction restriction sitesite）和）和 MotifMotif正向（正向（As isAs is）、反向（）、反向（reversedreversed）、互补（）、互补（complementedcomplemented）及反向互补（及反向互补（reverse complemented reverse complemented）。）。正向（正向（As isAs is）反向（反向（reversedreversed）互补（互补（complementedcomplemented）Enzyme软件默认以软件默认以表格方式表格方式显示酶切结果。单击显示酶切结果。单击SeqSeq 或或 MapMap，分别以，分别以序列或图示的方式显示结果。序列或图示的方式显示结果。缺点：缺点：不能以文本的形式保存结不能以文本的形式保存结果。果。MotifMotif Primer点击点击 SearchSearch，进行引物搜索，进行引物搜索Search criteriaSearch criteria 窗口：多种参数可以调整。窗口：多种参数可以调整。Primer LengthPrimer Length常设置在常设置在181830bp,30bp,短了特异性不好，长了没有必要。短了特异性不好，长了没有必要。当然有特殊要求的除外，如加个酶当然有特殊要求的除外，如加个酶切位点什么的。切位点什么的。PCR Product sizePCR Product size最好是最好是100100500bp500bp之间，小于之间，小于100bp100bp的的PCRPCR产产物琼脂糖凝胶电泳出来，条带很模物琼脂糖凝胶电泳出来，条带很模糊，不好看。至于上限倒也不必要糊，不好看。至于上限倒也不必要求苛刻。求苛刻。ManualManualSearch parameters Search parameters 人工搜索参数设置窗口。人工搜索参数设置窗口。Search stringencySearch stringency应选应选HighHigh。GCGC含量一般是含量一般是40406060。其它参数默认就可以。其它参数默认就可以。Search progress Search progress 窗口中显示窗口中显示Search CompletedOKSearch CompletedOK键键结果窗口结果窗口有三种显示形式，上游引物、下游引物和成对显示。有三种显示形式，上游引物、下游引物和成对显示。引物按优劣次序排列，满分为引物按优劣次序排列，满分为100100。选其中的一对引物，在主。选其中的一对引物，在主窗口显示结果。窗口显示结果。对于上述引物，如果其它各项指对于上述引物，如果其它各项指标还可以，可在引物末端去掉一标还可以，可在引物末端去掉一个不满意的或加上一个碱基，看个不满意的或加上一个碱基，看看引物的评估参数有没有变好点。看引物的评估参数有没有变好点。搜索出来的引物，按搜索出来的引物，按RatingRating排序，排序，逐个送逐个送OligoOligo软件里评估。软件里评估。当然，搜索出的引物，其扩增产当然，搜索出的引物，其扩增产物很短，你可以不选择它。物很短，你可以不选择它。引物引物3 3端端2 2个个A A或或T,T,或引物内部或引物内部连续的连续的G G或或C C太多，或引物太多，或引物3 3端端2 2个个G G或或C C，这样的引物应作，这样的引物应作为次选，没得选了就选它。为次选，没得选了就选它。该图分为四部分：最上面是图示模板及产物位置，该图分为四部分：最上面是图示模板及产物位置，“S”S”和和“A”A”可查看有义链可查看有义链或反义链的引物。右边是两个引物在模板上结合位置的直观图；第二层是模或反义链的引物。右边是两个引物在模板上结合位置的直观图；第二层是模板及引物序列的配对情况；第三层显示引物的各种参数。板及引物序列的配对情况；第三层显示引物的各种参数。注意：尾末给出该注意：尾末给出该引物的最佳退火温度引物的最佳退火温度！第四层：四种重要指标的分析！第四层：四种重要指标的分析引物长度：引物长度：控制着引物的特异性和在控制着引物的特异性和在PCR反应中的退火反应中的退火温度。长的温度。长的PCR引物能给扩增带来更好的特异性，可以引物能给扩增带来更好的特异性，可以通过降低退火温度提高反应的灵敏度，不过长引物易形通过降低退火温度提高反应的灵敏度，不过长引物易形成包括发夹结构二聚体自身互补等二级结构。适宜引物成包括发夹结构二聚体自身互补等二级结构。适宜引物长度为长度为18-27 nt。Tm 融链温度融链温度：根据相：根据相邻二碱基对作用原理来邻二碱基对作用原理来计算融链温度。计算融链温度。PCR 反反应的合适应的合适 Tm 范围为范围为56-63（50-70）GC%含量含量：对于：对于PCR 反应来说反应来说 GC含量在含量在50%左右比左右比较合适。较合适。（40-60%,45-55%）Degeneracy多义性多义性，尽量减少，尽量减少引物多义性，这样会带来更好引物多义性，这样会带来更好的特异性，尽量避免的特异性，尽量避免3末端的末端的多义性，因为这个位置即使一多义性，因为这个位置即使一个碱基的错配都能阻止引物延个碱基的错配都能阻止引物延伸。伸。BLAST 验证引物验证引物进入进入http:/www.ncbi.nlm.nil.gov/BLAST/,点击点击Basic BLAST中的中的 nucleotide blast 选项选项在在Enter Query SequenceEnter Query Sequence栏中输入引物序列：栏中输入引物序列：例：例：引物为引物为5 5-CTGAGATCCTGAGCCTTTGG-3-CTGAGATCCTGAGCCTTTGG-3;5 5-TGCCCATCACAACATCATCT-3-TGCCCATCACAACATCATCT-3同时输入上下游引物。输入上下游引物都从同时输入上下游引物。输入上下游引物都从5 5 3 3。输入上游引物后，加上。输入上游引物后，加上2020个字母个字母n n，再输入下游，再输入下游引物。引物。在在Choose Search SetChoose Search Set栏中：栏中：DatabaseDatabase根据预操作基根据预操作基因的种属定了，可选因的种属定了，可选Human genomic+transcriptHuman genomic+transcript或或OthersOthers在在Program SelectionProgram Selection中：选择中：选择Somewhat similar Somewhat similar sequences(blastn)sequences(blastn)项，如下图：项，如下图：在此界面最下面关键要点击在此界面最下面关键要点击Algorithm parametersAlgorithm parameters参参数设置，进入参数设置界面。数设置，进入参数设置界面。在在General ParametersGeneral Parameters中：中：Expect thressholdExpect thresshold期望阈值须改为期望阈值须改为10001000，大于，大于10001000也可以；在也可以；在Word sizeWord size的下拉框将数字改为的下拉框将数字改为7 7。图中图中：序列与引物匹配的得分值小于：序列与引物匹配的得分值小于4040分、分、40405050分、分、50-8050-80分、分、80-20080-200分等分等，分值越高，特异性越好；，分值越高，特异性越好；线段代表上或下游引物线段代表上或下游引物，其颜色和上面对照后就可得出该条引物的分值。两线段间没有其颜色和上面对照后就可得出该条引物的分值。两线段间没有连线的，表示单条引物与该基因一致。有连线的代表这些序列连线的，表示单条引物与该基因一致。有连线的代表这些序列与上游引物匹配（与上游引物匹配（Strand=Plus/PlusStrand=Plus/Plus）、并与下游引物互补）、并与下游引物互补（Strand=Plus/MinusStrand=Plus/Minus），），理论上可以扩增出基因片断。点击线理论上可以扩增出基因片断。点击线段，就能跳转到该基因的结果信息概要。段，就能跳转到该基因的结果信息概要。Accession，数据库数据库系列的身份证：点系列的身份证：点击之后可以获得该击之后可以获得该序列的信息序列的信息Desscription序序列列的简单描述的简单描述高的就是有两线段间高的就是有两线段间有连线的有连线的代表随机匹配的可代表随机匹配的可能性能性。E值值接近零时接近零时最有意义，也就是最有意义，也就是说序列完全匹配了。说序列完全匹配了。比对到的序列长度比对到的序列长度E值越小为好！值越小为好！匹配上的碱基数占总匹配上的碱基数占总序列长度的比例序列长度的比例缺失或插入，用缺失或插入，用“-”来表来表示示Query1、2表示输入表示输入的两对引物，的两对引物，Sbjct表表示在库里比对的序列示在库里比对的序列Primer BLAST的详细结果的详细结果ncbi 在线在线 primer 设计设计默认的参数实际上是从默认的参数实际上是从100到到1000，这个你得自己改，如果你希望产，这个你得自己改，如果你希望产物的大小符合你的预期，尽可能把物的大小符合你的预期，尽可能把范围改小，比如范围改小，比如480-500 至于至于RT-PCR所用的引物，最好是所用的引物，最好是使得产物跨过内含子，这样避免潜使得产物跨过内含子，这样避免潜在在DNA对对RT-PCR的干扰。的干扰。用用OligoOligo软件设计软件设计/评估评估PCRPCR引物引物启动启动OligoOligo，选择，选择FileFileopenopen，打开要进行引物分析，打开要进行引物分析的序列。的序列。图中显示的三个指标：图中显示的三个指标：TmTm值、值、GG和和 Frequencies Frequencies。退火温度窗口是设计引物退火温度窗口是设计引物的的主窗口主窗口，其他两个具有，其他两个具有辅助辅助作用。作用。因为分析要涉及多个指标，启动窗口的因为分析要涉及多个指标，启动窗口的Cascade Cascade 排列排列方式不太方便，可从方式不太方便，可从windowswindows菜单改为菜单改为TileTile方式。方式。用用TileTile方式方式显示窗口显示窗口TmTm，退火温度窗口，退火温度窗口TmTm值曲线以选取值曲线以选取7272附近为佳；附近为佳；5 5到到33端的下降性状也有利于引物引发聚合反应。端的下降性状也有利于引物引发聚合反应。圈出来的序列部分及黄色的圈出来的序列部分及黄色的barbar即即代表当前分析的代表当前分析的2121个碱基的个碱基的TmTm值值 可点击窗口的左下角的可点击窗口的左下角的UpperUpper、LowerLower按钮选择上游引物、下游引物。按钮选择上游引物、下游引物。TmTm值似乎太低了值似乎太低了TmTm值似乎太高了值似乎太高了显示了装载的整个序列的显示了装载的整个序列的 6-7 mers6-7 mers寡核苷酸顺序寡核苷酸顺序的相对频率。寡核苷酸的的相对频率。寡核苷酸的3 3端如果在一个特定端如果在一个特定的数据库（的数据库（GenBankGenBank的子数据库）更普遍（即的子数据库）更普遍（即出现的频率更高），那么更容易导致错误引发。出现的频率更高），那么更容易导致错误引发。FrequenciesFrequencies，碱基频率窗口，碱基频率窗口如果选择出现频率较低的位点作为如果选择出现频率较低的位点作为3 3末端，那么就减少了在末端，那么就减少了在复杂的底物（比如整个复杂的底物（比如整个基因组基因组DNADNA）内的许多位点结合、）内的许多位点结合、引发的几率，从而减少了非特异性引发的几率，从而减少了非特异性PCRPCR产物的形成。产物的形成。平均频率为平均频率为10001000的话，的话，CTTGGCCTTGGC的频率为的频率为15001500以上，而以上，而TTGGCGTTGGCG德频率很低，约德频率很低，约300300。GG，序列内部碱基稳定性窗口，序列内部碱基稳定性窗口显示了寡核苷酸的内部稳定显示了寡核苷酸的内部稳定性性(五聚体的自有能五聚体的自有能)。-1.9-1.9值值=-=-（3.1+3.1+3.1+1.63.1+3.1+3.1+1.6）GG值反应了序列与模板的结合强度；值反应了序列与模板的结合强度；最好引物的最好引物的GG值在值在55端和中间值比较高，而端和中间值比较高，而在在33端相对低。端相对低。在一个双链结构中，碱基对的相对稳定性是由其邻在一个双链结构中，碱基对的相对稳定性是由其邻近碱基决定的，以自由能近碱基决定的，以自由能GG表示。表示。dAdCdGdTdA-1.9-1.3-1.6-1.5dC-1.9-3.1-3.6-1.6dG-1.6-3.1-3.1-1.3dT-1.0-1.6-1.9-1.9第二个核苷酸第二个核苷酸第一个（第一个（55）核苷酸）核苷酸例子：例子：双链双链d d（ACGG/CCGTACGG/CCGT）的）的GG是：是：GG（ACGGACGG）=G=G（ACAC）+GG（CGCG）+GG（G GG G）=-=-（1.3+3.6+3.11.3+3.6+3.1）=-8.0kcol/mol=-8.0kcol/mol显示了显示了3 3末端序列末端序列GG值较值较低，适合引发。低，适合引发。3 3末端序末端序列列GG太太高。高。你可以在三个窗口你可以在三个窗口中自行设计引物。中自行设计引物。选择了自己认为顺眼选择了自己认为顺眼的位置，此时，的位置，此时，点击点击UperUper，上游，上游引物即可显示。引物即可显示。同时在序列下游寻找同时在序列下游寻找下游引物，点击下游引物，点击LowerLower，即可显示，即可显示下游引物。下游引物。对你设计的引物对你设计的引物质量进一步分析。质量进一步分析。同时在序列下游寻找同时在序列下游寻找下游引物，点击下游引物，点击LowerLower，即可显示，即可显示下游引物。下游引物。参数设置与搜索选择参数设置与搜索选择searchfor primers and probessearchfor primers and probes，进行如右图设置。，进行如右图设置。点击点击search rangessearch ranges，设置引物范围和，设置引物范围和 PCR PCR产物的大小产物的大小点击点击parametersparameters，进行参数设置。，进行参数设置。因为设计的是一对引物，正、负链的复选框因为设计的是一对引物，正、负链的复选框都要选上。同时选都要选上。同时选compatible pairscompatible pairs默认下，默认下，对引物的要求对引物的要求：无二：无二聚体、聚体、33高度特异、高度特异、GC%GC%含量有限定、去除错误引发含量有限定、去除错误引发引物等。引物等。引物的长度及产物的长度设置。引物的长度及产物的长度设置。Primer LengthPrimer Length设置设置在在181830bp,30bp,短了短了特异性不好，长特异性不好，长了没有必要了没有必要;PCR Product sizePCR Product size最好是最好是100100500bp500bp之间，小于之间，小于100bp100bp的的PCRPCR产产物琼脂糖凝胶电泳出来，条带很物琼脂糖凝胶电泳出来，条带很模糊。上限没有太多的限定。模糊。上限没有太多的限定。普通设置、参数及更多参数普通设置、参数及更多参数从高到低六个等级的设从高到低六个等级的设定，最后有一个用户定定，最后有一个用户定制选项。当对软件功能制选项。当对软件功能不了解时，应选不了解时，应选very very high/Highhigh/High。选选automatically change automatically change string string 后，搜索引物时，如后，搜索引物时，如果在高等级设定中无法搜索果在高等级设定中无法搜索到引物对时自动降级一个等到引物对时自动降级一个等级来搜索，直到找到为止。级来搜索，直到找到为止。反向引物时用反向引物时用让引物的长度可以改变，让引物的长度可以改变，以适应设定的以适应设定的TmTm值或值或PEPE（prime Efficeinceprime Efficeince）值（引发效率）。值（引发效率）。可以限定所选引物对的最可以限定所选引物对的最大数目。大数目。实际上需要我们改动的只实际上需要我们改动的只有有引物的长度引物的长度，根据实，根据实验需求做相应改动。验需求做相应改动。其他的参数就使用其他的参数就使用OligoOligo默认值，一般无需改动。默认值，一般无需改动。直接使用直接使用OligoOligo默认值，默认值，一般也无需改变。一般也无需改变。参数设置完毕后，点击确认参数设置完毕后，点击确认OKOK，程序即进行引物搜，程序即进行引物搜索。索。引物搜索结果如入：引物搜索结果如入：OligoOligo提供了按引物位提供了按引物位置、产物大小、退火温置、产物大小、退火温度、度、GCGC含量等的排列含量等的排列方式。方式。OligoOligo最突出的功能不在于引物搜索最突出的功能不在于引物搜索而在于引物分析而在于引物分析。它提供了多种分析方法并以不同的形式展现出来。它提供了多种分析方法并以不同的形式展现出来。选择其中的一对引物，这时程序自动弹出一个选择其中的一对引物，这时程序自动弹出一个PCRPCR分分析窗口。析窗口。PCRPCRoptimal annealing temperature optimal annealing temperature（最佳（最佳退火温度）数值得参考。在退火温度）数值得参考。在PCRPCR摸索条摸索条件的时候，退火温度为其数值加减件的时候，退火温度为其数值加减2 2的的范围就可以了。范围就可以了。产物产物TmTm值与引值与引物物TmTm值（低的那个）值（低的那个）的差异，一般控制在的差异，一般控制在2020度以内。度以内。引引物间物间TmTm值的差异，一般值的差异，一般控制在控制在5-65-6度以内。度以内。引发效率：上（下）引物对引发效率：上（下）引物对于正、负链正确引发效率比。于正、负链正确引发效率比。最佳引物浓度最佳引物浓度在在Analyze Analyze 菜单中，菜单中，Oligo Oligo 提供了众多分提供了众多分析功能。选择相应的析功能。选择相应的功能，分析结果。功能，分析结果。点击点击Selected primersSelected primers，会给，会给出两条引物的概括性信息出两条引物的概括性信息;其中包括引物的其中包括引物的TmTm值值，此，此值值OligoOligo是采用是采用nearest nearest neighbor methodneighbor method计算，会计算，会比比Primer5Primer5中引物的中引物的TmTm值略值略高高;引物的引物的Delta GDelta G和和33端的端的Delta GDelta G:3:3端的端的Delta GDelta G过过高，会在错配位点形成双链高，会在错配位点形成双链结构并引起结构并引起DNADNA聚合反应，聚合反应，因此此项绝对值应该小一些，因此此项绝对值应该小一些，最好不要超过最好不要超过9 9。Key InfoKey InfoDuplex formation Duplex formation，引物二聚体，引物二聚体引物二聚体是影响引物二聚体是影响PCRPCR反应异常的重要因素反应异常的重要因素应避免，至少也要使应避免，至少也要使设计的引物形成的二聚体是不稳定的，即其设计的引物形成的二聚体是不稳定的，即其GG值应该偏低值应该偏低由由退退火温度火温度决定，决定，5050的退火温度和的退火温度和6565对二聚体的影响肯定不一样。对二聚体的影响肯定不一样。The most stable 3-Dimer The most stable 3-Dimer Delta GDelta G绝对值一般不要超绝对值一般不要超过过4.5kcal/mol4.5kcal/mol。GG绝对值绝对值越大结构越稳定。越大结构越稳定。结合碱基对不要超过结合碱基对不要超过3 3个。个。the most stable Dimer overallthe most stable Dimer overall绝对值一般应小于多少绝对值一般应小于多少kcal/molkcal/mol跟跟PCRPCR退火温度有关。退火温度有关。实验表明在实验表明在PCRPCR退火温度退火温度6565时，时，6.7kcal/mol6.7kcal/mol没有问题。没有问题。Hairpin formation Hairpin formation，引物发夹结构，引物发夹结构Delta GDelta G绝对值一般不要绝对值一般不要超过超过4.5kcal/mol4.5kcal/mol。结合碱基对不要超过结合碱基对不要超过3 3个。个。特定的发夹如果没有显示特定的发夹如果没有显示TmTm值，值，那么发夹结构就不容易形成那么发夹结构就不容易形成 。结合碱基对已经超过结合碱基对已经超过3 3个。个。在在3 3形成发夹会引发形成发夹会引发引物内部的延伸反应，引物内部的延伸反应，减少了参加正式反应减少了参加正式反应引物的数量引物的数量。Composition and TmComposition and Tm上下游引物的上下游引物的GCGC控制在控制在40406060。最后一种是最后一种是Primer5Primer5所采用所采用的方法。的方法。Td is a normalized Tm in Td is a normalized Tm in 1M salt conditions1M salt conditionsthe Tm is a variable value,that the Tm is a variable value,that depends on salt and DNA depends on salt and DNA concentration set in the Search concentration set in the Search Parameters windowParameters windowTmTm值高时错配很少，值高时错配很少，特异性强。特异性强。False priming sitesFalse priming sites，错误引发位点，错误引发位点oligooligo会给会给正确引发效率正确引发效率和和错错误引发效率误引发效率。一般的原则：使误引发效率一般的原则：使误引发效率控制在控制在100100以下。以下。有时候有时候正确位点的引发效率正确位点的引发效率很很高的话，比如达到高的话，比如达到400400500500，错误引发效率超过错误引发效率超过100100幅度若不幅度若不大的话，也可以接受。大的话，也可以接受。PrimerPrimer的的priming efficiencypriming efficiency应该应该是错配地方的是错配地方的4 4倍左右，更多当倍左右，更多当然更好。然更好。下游引物对下游引物对于负链，没于负链，没有发现错误有发现错误引发。引发。Selected OligoSelected OligoPrimer pairsPrimer pairs系统设计出的所有引物对。系统设计出的所有引物对。internal stabilityinternal stabilityInternal stabilityInternal stability很重要：我们希望引物的内部稳定性是中很重要：我们希望引物的内部稳定性是中间高、两边低的弧形，最起码保证间高、两边低的弧形，最起码保证3 3端不要过于稳定。端不要过于稳定。引物引物3 3端过于稳定，很端过于稳定，很容易导致不适当扩增。容易导致不适当扩增。上游引物的参数上游引物的参数注意：注意：必需把方框拉到上游引物处。必需把方框拉到上游引物处。对应的下游引物的对应的下游引物的参数参数注意：注意：必需把方框拉到下游引物处。必需把方框拉到下游引物处。Hybridization timeHybridization time，杂交时间，杂交时间该窗口显示了不同长度、不同浓度的该窗口显示了不同长度、不同浓度的寡核苷酸的杂交时间寡核苷酸的杂交时间 ConcentrationConcentration您只需点一下鼠标，就轻您只需点一下鼠标，就轻松地实现对你地引物、松地实现对你地引物、PCRPCR产物、产物、DNADNA模版链即模版链即时的浓度、体积、时的浓度、体积、ODOD值、值、分子量的转换。分子量的转换。该浓度窗口是一个强大的该浓度窗口是一个强大的时间保存计算器。时间保存计算器。OligoOligo不仅能以图表的方式将结果展示出来，还能以文不仅能以图表的方式将结果展示出来，还能以文本的形式保存。本的形式保存。在软件所出现的任何一个窗口，选择在软件所出现的任何一个窗口，选择Filedata AsFiledata As，把数据存为一个文本文件。把数据存为一个文本文件。文本保存的结果如下：文本保存的结果如下：最佳退火温度最佳引物浓度、盐浓度Primer premier 5Primer premier 5设计引物设计引物OligoOligo引物评估引物评估 举例说明：举例说明：ncbincbi里查找里查找基因基因 LIF LIF 的的mRNAmRNA序列，序列，用用FASTAFASTA格式直接保格式直接保存改基因的存改基因的CDSCDS区序列。区序列。上游引物上游引物下游引物下游引物可以看出，可以看出，OligoOligo对引物进行了非常全面的分析，为选择最佳的对引物进行了非常全面的分析，为选择最佳的引物提供了参考。引物提供了参考。OligoOligo不仅能对所搜索的引物进行全面分析，不仅能对所搜索的引物进行全面分析，还能对任意的寡核苷酸进行分析。还能对任意的寡核苷酸进行分析。选择选择Filenew sequenceFilenew sequence，在出现的窗口中输入要分析的寡核苷，在出现的窗口中输入要分析的寡核苷酸序列，完毕后按回车键或选择酸序列，完毕后按回车键或选择Accept/DiscardAcceptAccept/DiscardAccept。温馨小提示温馨小提示：当你验：当你验证引物时，不要如图证引物时，不要如图似的把引物序列直接似的把引物序列直接黏贴。此处，黏贴。此处，应该应该把把模板序列输进去。模板序列输进去。edit new sequence 里用里用键盘输入上游引键盘输入上游引物的模板序列物的模板序列（A），），选择选择Accept/DiscardAccept。输入输入S或或dsDNA是错误的。是错误的。注意：看到的序列是模板，而不是需注意：看到的序列是模板，而不是需要验证的引物。要验证的引物。看：看：上游引物已经显示了！上游引物已经显示了！显示的是方框显示的是方框/当当前序列的位置前序列的位置也可以这样操作：方框定位到也可以这样操作：方框定位到288，点击，点击Upper，即可显示上游引物。，即可显示上游引物。错误！错误！当方框短于引物时，可改变当当方框短于引物时，可改变当前序列长度前序列长度下游引物也显示了！下游引物也显示了！引物序列长度不同于当前的引物，引物序列长度不同于当前的引物，从从“Change”菜单中改变当前的菜单中改变当前的引物长度！引物长度！引物输入完毕，接下引物输入完毕，接下来分析各个参数来分析各个参数上下引物上下引物3末端没有二聚体产生。末端没有二聚体产生。Primer premier 5Primer premier 5OligoOligo上下引物间产生的二聚体，上下引物间产生的二聚体，G绝对值应小于绝对值应小于4.5值值。Primer premier 5Primer premier 5OligoOligo上引物上引物内部形成的二聚体内部形成的二聚体。G绝对值大于绝对值大于9，有点不能，有点不能接受，而且核苷酸为接受，而且核苷酸为4个。个。Primer premier 5Primer premier 5OligoOligo下引物下引物内部形成的二聚体内部形成的二聚体。G绝对值小于绝对值小于4.5，可以接受，可以接受，最佳