临床常见病原体检查专家讲座.pptx

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第九章 临床病原体检测,临床常见病原体检查,第1页,提 纲,第一节：标本采集运输、试验室评价和检验方法,第二节：病原体耐药性检测,第三节：临床感染常见病原体检测,第四节：病毒性肝炎检测,第五节：性传输疾病病原体检测,第六节：医院感染常见病原体检测,病原体检测,药敏检测,临床常见病原体检查,第2页,教学目标与要求：,了解掌握临床病原体检验,主要内容,（标本采集、标本验收、药敏检验、耐药性检测、临床常见病原体、病毒性肝炎、性传输疾病、医院感染）,、,检测原理,以及,临床实际应用主要意义。,临床常见病原体检查,第3页,重点与难点,标本采集标准及各种检验方法适用范围及其优缺点,药品敏感惯用试验方法及其特点,耐药菌检测试验,各种类型临床常见病原体检验,甲、乙、丙型肝炎检测方法,各种性传输疾病病原体检测方法、筛选试验、确诊试验及金标准,院内感染定义,临床常见病原体检查,第4页,提 纲,第一节：标本采集运输、试验室评价和检验方法,第二节：病原体耐药性检测,第三节：临床感染常见病原体检测,第四节：病毒性肝炎检测,第五节：性传输疾病病原体检测,第六节：医院感染常见病原体检测,临床常见病原体检查,第5页,临床细菌学检验特殊性,依赖于细菌生长,采集时间 （发烧？）,运输方式 （密闭是否，保温是否？）,感染细菌种类及生长特征 （苛养菌）,病人是否使用抗生素 （抗生素影响）,其它：消毒剂，白细胞吞噬等,轻易受环境中细菌污染,采集方法 （无菌操作，防止污染）,放置时间 （及时运输，防止细菌死亡）,临床常见病原体检查,第6页,基本标准,1：正确标本类型和采集部位以反应有效病程,2：采集和运输应无菌操作，防止污染,3：尽快送检,4：视全部标本为传染品，高度污染标本要有显著标识,5：注意生物安全，标本用后要做消毒处理,一、标本采集和运输,临床常见病原体检查,第7页,（一）血液标本采集,适应症：疑似菌血症、败血症或脓毒血症病人,酒精棉球消毒，预防污染。静脉采血后，将血液注入培养瓶内。,采集时间：普通在抗生素使用前，于发烧早期或高峰期采血。,采集频率：24小时内采血23次可提升阳性率，且在不一样部位。,采血量：血液与培养基百分比为1：5-10，普通成人血量510ml，婴儿1-5ml。,临床常见病原体检查,第8页,（二）尿液标本采集,首次晨尿，无菌采集中段尿10-20ml。,排尿困难者考虑导尿采集标本。,如考虑厌氧菌感染，采取膀胱穿刺法采集标本,。,临床常见病原体检查,第9页,（三）粪便标本采集,自然排便者：挑取脓、血或粘液部分于清洁容器中送检。,排便困难者：采取直肠拭子采集。,怀疑霍乱弧菌感染引发腹泻，马上接种或将标本置于碱性蛋白胨水或卡-布运输培养液送检。,传染性腹泻应连续送检3次。,临床常见病原体检查,第10页,（四）呼吸道标本采集,类型：鼻咽拭、痰和经气管采集标本。,采集时间：晨痰，且在取痰前用清水重复漱口。,方法：（1）自然咳痰法：（2）气管镜下采集法；（3）气管穿刺法。,WBC 25/lp,上皮10/lp。,上呼吸道存在正常菌群，在采集标本与结果分析时应予考虑。,临床常见病原体检查,第11页,（五）脑脊液与其它无菌体液采集,临床医生采取腰椎穿刺，抽取2-3ml，置于无菌容器中马上送检，不得保留于冰箱中。,脑膜炎主要病原体：脑膜炎奈瑟菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌。,临床常见病原体检查,第12页,（六）眼、耳标本采集,临床常见病原体检查,第13页,（七）泌尿生殖道标本采集,性传输性疾病取尿道口分泌物、外阴糜烂面病灶边缘分泌物、阴道宫颈口分泌物和前列腺液等。,生殖道疱疹常穿刺抽取疱疹液。,盆腔脓肿患者则于直肠子宫凹陷处穿刺取脓液。,全部标本搜集后于4保留直至培养,临床常见病原体检查,第14页,（八）创伤、组织和脓肿标本,损伤范围较大创伤，从不一样部位采集多份标本.去除污物，以碘酒、酒精消毒皮肤.,开放性脓肿：无菌棉拭子采集脓液及病灶深部分泌物。,封闭性脓肿：无菌干燥注射器抽取。,疑为厌氧菌感染，取脓液后马上排净注射器内空气，针头插入无菌橡皮塞送检。,临床常见病原体检查,第15页,标本送检,标本要求尽快送检，不然影响阳性率。,烈性传染病标本需专员护送。,临床常见病原体检查,第16页,二、标本试验室质量评定标准,1标本必须注明姓名、年纪、性别、采集日期、临床诊疗、检验项目等基本信自。,2仔细查对标本采集日期和送检日期。延误标本，普通情况下不接收。通惯用于细菌学检验标本存放不要超出24h。而病毒检测标本可于4存放23天。,3检验送检容器是否完整，有没有破损或渗漏等情况，若有则不予接收。,4标本储存、运输方式不妥，不予接收。,5显著被污染标本不予接收。6标本量显著不足标本，不予接收。,7同一天申请做同一试验重复送检标本(血培养除外)，不予接收。,8对于烈性传染病标本采集和运输应严格执行相关要求，要有完善防护办法，按要求包裹及冷藏，附有详细采样及送检纪录，由专员护送。,标本是否合格，以确保检测结果准确性！,临床常见病原体检查,第17页,三、检验方法,（一）直接显微镜检验,（二）病原体特异性抗原检验,（三）病原体核酸检验,（四）病原体分离培养和判定,（五）血清学试验,临床常见病原体检查,第18页,（一）直接显微镜检验不染色标本,不染色标本：,适合用于检验生活状态下病原体动力及运动情况,。,方法：,压滴法、悬滴法,。,意义：在不染色状态下借助暗视野显微镜或相差显微镜观察病原菌动力、活动方式。部分病原体可借此初步诊疗，如梅毒螺旋体。,临床常见病原体检查,第19页,（一）直接显微镜检验染色标本,染色标本目标：,了解细菌形态、染色性或观察宿主细胞内包涵体。,方法：,革兰染色、墨汁染色、抗酸染色、荧光染色,临床常见病原体检查,第20页,革兰染色,细菌形态、染色性特征,阳性球菌（GS）,阴性杆菌G-R,真菌孢子,临床常见病原体检查,第21页,革兰染色,临床常见病原体检查,第22页,墨汁染色,荚膜抗吞噬,30%-50%患者伴有免疫功效低下等疾病，8%左右AIDS患者伴有隐球菌性脑膜炎，预后极差。,中枢神经系统存活与脑脊液中缺乏抗体和补体激活系统相关,抗真菌治疗:两性霉素B,氟康唑,宽厚荚膜,临床常见病原体检查,第23页,抗酸染色,荧光显微镜用于标本经荧光染色后直接检出一些病原微生物，,用形态学和免疫学相结合可特异地家侧一些病原微生物存在。,临床常见病原体检查,第24页,荧光显微镜用于标本经荧光染色,后直接检出一些病原微生物,荧光染色,临床常见病原体检查,第25页,SARS（severe acute respiratory syndrome）病原体确实定。,直接显微镜检验电镜检验,电镜检验不常规用于临床，对一些病毒感染却有确诊价值,临床常见病原体检查,第26页,电子显微镜发觉为某种冠状病毒,电镜检验不常规用于临床，对一些病毒感染却有确诊价值,临床常见病原体检查,第27页,意义,无菌体液直接镜检对病原体诊疗含有一定意义。,对正常菌群借居腔道分泌物图片镜检可提醒深入检验步骤、采取方法和确定分离判定病原体所需培养基。,临床常见病原体检查,第28页,意义,3.因为临床标本中常含有一定抗菌物质，以致分离培养可为阴性，此时镜检往往可能在诊疗是起作用。,4.荧光显微镜用于标本经荧光染色后直接检出一些病原微生物,5.电镜检验不常规用于临床，对一些病毒感染却有确诊价值。,临床常见病原体检查,第29页,(二)病原体特异性抗原检验,利用抗原抗体之间特异性反应，用已知抗体检测患者血清及其它体液中待测抗原,，借助免疫荧光技术、酶联免疫技术、化学发光技术、胶乳凝集试验、对流免疫电泳等技术检测标本中未知病原体抗原，其诊疗价值常以标本不一样而各异。,标本中假如存在各种正常借居微生物，可因交叉抗原存在而不能必定诊疗。,检测细菌不一样抗原结构，还可分析细菌菌群和血清型，如沙门菌属、志贺菌属和霍乱菌属等,临床常见病原体检查,第30页,O1群霍乱弧菌血清分型,型别,别名,O抗原成份,原型,稻叶型,A、C,异型,小川型,A、B,中间型,彦岛型,A、B、C,细菌血清分型：,O1群霍乱弧菌菌体抗原由A、B、C三个抗原成份组成,利用抗原抗体之间特异性反应，用已知抗体检测患者血清及其它体液中待测抗原,颗粒凝集,检测细菌不一样抗原结构，,还可分析细菌菌群和血清型，,如沙门菌属、志贺菌属和霍乱菌属,临床常见病原体检查,第31页,（三）病原体核酸检测,惯用试验方法有：,PCR。polymerase chain reaction聚合酶链式反应，简称PCR技术。,核酸探针杂交技术,Realtime PCR,基因芯片等,临床常见病原体检查,第32页,PCR技术简史,DNA复制,核酸体外扩增构想,聚合酶链反应创造,1985年，美国PE-Cetus企业Mullis等人创造了聚合酶链反应（PCR）,基本原理是在试管中模拟细胞内DNA复制,最初采取E-coli DNA聚合酶进行PCR，因为该酶不耐热，使这一过程耗时，费劲，且易犯错,耐热DNA聚合酶应用使得PCR能高效率进行，随即PE-Cetus企业推出了第一台PCR自动化热循环仪,1993年，Mullis等所以项技术获诺贝尔化学奖,临床常见病原体检查,第33页,基因组DNA,获取特定DNA片段,扩增特定DNA片段,临床常见病原体检查,第34页,PCR基本原理,PCR反应条件,PCR过程,PCR特点,标准PCR反应体系,4种dNTP混合物 各200umol/L,引物 各10100pmol,模板DNA 0,.,12ug,Taq DNA聚合酶 2,.,5u,Mg,2+,1,.,5mmol/L,临床常见病原体检查,第35页,1,2,3,4,5,22,55,72,94,时间（min）,温度,（）,PCR基本原理,PCR反应条件,PCR过程,PCR特点,适温延伸,3,高温变性,1,低温退火,2,重复13步,2530轮,目标DNA片段,扩增100万倍以上,DNA双螺旋,DNA单链,与引物复性,DNA变性,形成2条单链,子链延伸,DNA加倍,临床常见病原体检查,第36页,PCR基本原理,PCR反应条件,PCR过程,PCR特点,1,2,3,4,5,22,55,72,94,时间（min）,温度,（）,适温延伸,3,高温变性,1,低温退火,2,重复13步,2530轮,目标DNA片段,扩增100万倍以上,DNA双螺旋,DNA单链,与引物复性,子链延伸,DNA加倍,DNA变性,形成2条单链,模板DNA,95,临床常见病原体检查,第37页,PCR基本原理,PCR反应条件,PCR过程,PCR特点,95,50,引物1,引物2,DNA引物,临床常见病原体检查,第38页,PCR基本原理,PCR反应条件,PCR过程,PCR特点,50,引物1,引物2,DNA引物,72,Taq酶,Taq酶,临床常见病原体检查,第39页,PCR基本原理,PCR反应条件,PCR过程,PCR特点,72,第1轮结束,95,第2轮开始,临床常见病原体检查,第40页,PCR基本原理,PCR反应条件,PCR过程,PCR特点,95,50,72,Taq,Taq,Taq,Taq,临床常见病原体检查,第41页,PCR基本原理,PCR反应条件,PCR过程,PCR特点,72,第2轮结束,临床常见病原体检查,第42页,PCR基本原理,PCR反应条件,PCR过程,PCR特点,模板DNA,第1轮扩增,第2轮扩增,第3轮扩增,第4轮扩增,第5轮扩增,第6轮扩增,临床常见病原体检查,第43页,PCR扩增产物电泳,临床常见病原体检查,第44页,PCR基本原理,PCR反应条件,PCR过程,PCR特点,灵敏度高,皮克(pg=10,-12,)量级扩增到微克(ug=10,-6,)水平,能从100万个细胞中检出一个靶细胞,病毒检测灵敏度可达3个RFU,细菌检测最小检出率为3个细菌,简便、快速,一次性加好反应液，24 小时完成扩增,扩增产物普通用电泳分析,对标本纯度要求低,血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织粗提DNA,临床常见病原体检查,第45页,PCR技术特点,1）高度灵敏性,30轮循环,扩增量达2,30,个拷贝（10,9,拷贝）,PCR产物每轮循环增加一倍,皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水平,能从100万个细胞中检出一个靶细胞,病毒检测灵敏度可达3个RFU,细菌检测最小检出率为3个细菌,临床常见病原体检查,第46页,2）特异性,引物,引物,引物序列及其与模板结合特异性是决定PCR反应结果关键。,引物设计最大标准是最大程度地提升扩增效率和特异性；同时尽可能降低非特异性扩增。,临床常见病原体检查,第47页,PCR类型和应用,研究,基因克隆，DNA测序，分析突变,诊疗,细菌、病毒、寄生虫检测，诊疗,人类基因组工程,遗传图谱构建，DNA测序，表示图谱,法医,犯罪现场标本分析,肿瘤,各种肿瘤检测,其它,临床常见病原体检查,第48页,（三）病原体核酸检测PCR,PCR：一个体外基因扩增技术，对目标基因组DNA信号进行放大。,临床常见病原体检查,第49页,（三）病原体核酸检测,Realtime PCR,实时荧光定量PCR：经过起始点定量和荧光检测系统实时监测,累积荧光强度,而,实现核酸定量,一个技术。,广泛应用于结核和麻风分枝杆菌、乙型肝炎病毒、丙型和戊型肝炎病毒、HIV、巨细胞病毒检验,临床常见病原体检查,第50页,（三）病原体核酸检测Realtime PCR,临床常见病原体检查,第51页,将大量核酸片段(寡核苷酸、PNA、cDNA、基因组DNA)以预先设计方式固定在载玻片、尼龙膜和纤维素膜等载体上组成密集分子阵列，与荧光素或其它方式标识样品进行杂交，经过检测杂交信号强弱进而判断样品中靶分子有没有和数量。该技术含有高通量、自动化程度高、快速、样品用量少、灵敏度高、特异性强、污染少等特点。病原微生物16S rDNA及23S rDNA序列近几年被作为一个较理想基因分类靶序列，其在进化压力下保持了高度保守性，同时又含有一定变异性，基因芯片技术通常利用病原微生物这一分子生物学特征，实现多样本多病原微生物同时检测。,（三）病原体核酸检测基因芯片,临床常见病原体检查,第52页,意义,灵敏度高，是检测病原体微生物最灵敏方法，但含有一定假阳性与假阴性。,特异性强，阳性只表明存在某种病原体核酸，是否正被感染应结合临床详细分析。,尤其适合用于当前尚不能分离培养或极难分离培养微生物。,适合用于核酸变异病原微生物，如病毒,临床常见病原体检查,第53页,（四）病原体分离培养和判定,明确感染病原体,提供体外抗微生物药品敏感试验结果,临床常见病原体检查,第54页,1.细菌感染性疾病病原体分离培养,分离培养是微生物学检验中确诊关键步骤,依据临床症状、体征和镜下检验特征做出病原学初步诊疗，选择最适当培养方法，主要是选择适当培养基、接种前标本处理和确定孵育条件，然后依据菌落性状(大小、色泽、气味、边缘、光滑度、色素、溶血情况等)和细菌形态、染色性，检测细菌生化反应结果和血清学试验、动物接种试验(白喉杆菌)，对分离菌作出判定，也可借助于微量判定系统快速简便判定分离菌,（四）病原体分离培养和判定,临床常见病原体检查,第55页,细菌分离培养与判定结果评价：,正常人群无菌体液中检测到细菌，应考虑细菌为感染病原体。,存在正常菌群标本检测到细菌，应结合细菌量考虑是否为致病菌。,如临床表现支持感染，但培养阴性，应考虑为标本不合格、培养不恰当等原因。,直接镜检找到病原体，而培养阴性，应考虑有L细菌、厌氧菌或苛氧菌感染。,临床常见病原体检查,第56页,2.不能人工培养病原体感染性疾病,将标本接种易感动物、鸡胚或行细胞培养,（四）病原体分离培养和判定,临床常见病原体检查,第57页,病毒分离培养与判定结果评价：,从组织、血液以及脑脊液中分离到病毒可明确诊疗。,从呼吸道、肠道等分离到病毒，如该病毒人体不能长久携带，有诊疗价值，如麻疹病毒、流感病毒等。反之需对应临床表现，才有病原学意义，如巨细胞病毒，肠道病毒等。,阴性不能排除病毒感染。,必须结合流行病学资料、临床表现、标本起源及病毒种类加以分析。,临床常见病原体检查,第58页,（五）血清学试验,用已知病原体抗原检测患者血清中对应抗体以诊疗感染性疾病。,人体感染病原体后经过一定时间产生特异性抗体，在体内可维持数月或更长时间。,临床常见病原体检查,第59页,双份血清检验：病程早期和晚期分别采血清2-3份检验，双份血清滴度呈4倍或4倍以上升高，考虑病原体感染,单份血清检验：特异性 IgM可作为感染性疾病早期诊疗指标，且可区分原发与复发感染。,方法有：凝集试验、沉淀试验、补体结合试验、间接免疫荧光、放射免疫、酶联免疫吸附试验。,临床常见病原体检查,第60页,适用范围,血清学诊疗可用于现症诊疗，还能够用于疾病追溯调查。,血清学诊疗对于一些病原体不能培养或难以培养疾病，能够提供诊疗依据，,临床常见病原体检查,第61页,血清学诊疗肥达反应,临床常见病原体检查,第62页,抗原结构,O抗原,：化学成份为脂多糖；耐热；是沙门菌分群依据；对应抗体为IgM抗体；与对应抗体结合出现颗粒状凝集；。,H抗原,：化学成份为蛋白质；不耐热；有双相鞭毛；沙门菌分型依据；与对应抗体结合出现絮状凝集；对应抗体为IgG抗体。,Vi抗原：不耐热；能阻止O抗原与对应抗体结合,临床常见病原体检查,第63页,血清学诊疗肥达反应,原理,：用已知伤寒沙门菌O、H抗原和甲、,乙、丙型副伤寒沙门菌H抗原与病人血清,作半定量凝集试验，以测定受检血清中有,无对应抗体及其效价。,意义,：帮助诊疗肠热症（伤寒与副伤寒）,临床常见病原体检查,第64页,几个沙门菌抗原结构,组,型,O抗原,H抗原,第1相,第2相,A组,甲型副伤寒沙门菌,1，2，12,a,-,B组,乙型副伤寒沙门菌,1，4，5，12,b,1，2,鼠伤寒沙门菌,1，4，5，12,i,1，2,C组,丙型副伤寒沙门菌,Vi,6，7，,c,1，5,猪霍乱沙门菌,6，7，,c,1，5,D组,伤寒沙门菌,Vi,9，12，,d,-,肠炎沙门菌,1，9，12,g.m,-,临床常见病原体检查,第65页,肠热症病人血清抗体出现情况,100,90,80,70,60,50,40,30,20,10,阳性检出率,1 2 3 4 5 6 7 8,发病周数,临床常见病原体检查,第66页,肥达反应正常值,O凝集效价1：80,H凝集效价1：160,副伤寒H凝集效价1：80,大于正常值含有诊疗意义,临床常见病原体检查,第67页,O与H抗体诊疗意义：,O、H效价均升高,：已感染伤寒,O、H效价均低于正常值,：未感染沙门菌或免,疫力低下,临床常见病原体检查,第68页,生理盐水,待检血清,诊疗抗原,伤寒O,伤寒H,甲型副伤寒H,肖沙门菌H,反应6小时,45,观察结果,1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640,伤寒O效价 1:320,伤寒H效价 1:640,甲型副伤寒H效价 1:20,肖沙门菌H效价 1:20,诊疗意义：感染伤寒沙门菌,1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280,最终稀释,倍数,临床常见病原体检查,第69页,伤寒带菌者检测,从标本中分离出病原菌,血清中检出Vi抗体，效价1：10,临床常见病原体检查,第70页,第二节：病原体耐药性检测,1922年他发觉了一个叫“溶菌酶”物质，发表了皮肤组织和分泌物中所发觉奇特细菌汇报。,但他自己无法创造一个提纯青霉素技术，致使此药十几年一直未得以使用。,1939年，瓦尔特弗洛和鲍利斯钱恩，重复了弗莱明工作，证实了他结果，然后提纯了青霉素,1945年，弗莱明、弗洛里和钱恩共获诺贝尔生理学及医学奖。,临床常见病原体检查,第71页,第二节：病原体耐药性检测,抗菌药品是当前临床使用最为广泛药品，它发觉、研制和临床应用是当代医学史上主要里程碑，使绝大多数微生物感染，尤其是细菌感染成为可治性疾病,临床常见病原体检查,第72页,抗生素压力,耐药菌株极少,x,x,耐药菌株为主,抗生素暴露,x,x,x,x,x,x,x,x,x,x,临床常见病原体检查,第73页,体外抗菌药品敏感试验目标,临床分离菌株，如不能反抗生素敏感性进行预测，必须常规进行药敏试验。,临床治疗效果差而考虑调整抗菌药品时。,了解细菌耐药流行病学情况。,评价新抗菌药品抗菌谱和抗菌活性等。,临床常见病原体检查,第74页,抗微生物药品敏感试验(antimicrobial susceptibility test,AST)对敏感性不能预测临床分离株进行药敏试验，以指导临床选择治疗药品。,临床常见病原体检查,第75页,体外抗菌药品敏感试验方法,惯用检验细菌是否对药品耐药方法有定性测定纸片扩散法、定量测定稀释法和E试验法。对一些特定耐药菌株检测除药品敏感试验外还要附加特殊酶检测试验、基因检测等方法。惯用方法有:,纸片扩散法（Kirby-Bauer test）,稀释法（dilution test）,E试验法（E test）,耐药筛选试验,折点敏感试验,临床常见病原体检查,第76页,原理：,含有定量抗菌药品纸片贴在已接种测试菌琼脂平板上，纸片中所含药品吸收琼脂中水分溶解后便不停地,向纸片周围区域扩散，形成递减浓度梯度。,在纸片周围抑菌浓度范围内细菌生长被抑制，形成透明,抑菌圈,。抑菌圈大小反应测试菌对测定药品敏感程度。,KB纸片琼脂扩散法,临床常见病原体检查,第77页,试验程序,临床常见病原体检查,第78页,临床常见病原体检查,第79页,按敏感(susceptible，S)、中度敏感(intermediate，I)、耐药(resistant，R)汇报。,S：测试菌能被测定药品常规剂量给药后在体内到达血药浓度所抑制或杀灭。,I：测试菌能被测定药品大剂量给药后在体内到达血药浓度所抑制，或在测定药品浓集部位体液(如尿)中被抑制。,R：测试菌不能被在体内感染部位可能到达抗菌药品浓度所抑制。,临床常见病原体检查,第80页,细菌药敏试验-液体稀释法,Minimal inhibitory concentration(MIC)，最低抑菌浓度,：能够抑制检测菌肉眼可见生长最低药品浓度称为最低抑菌浓度。,临床常见病原体检查,第81页,移液管2,接种,抗,菌,药品,对,倍稀释,抗生素,移液管1,先以水解酪蛋白液体培养基将抗生素作不一样浓度稀释，再种入待检菌，,临床常见病原体检查,第82页,培养,置35,温箱，培养24h。,临床常见病原体检查,第83页,结果判读,结果判读：肉眼观察，以不出现肉眼可见生长（混浊现象）最低药品浓度为该药对测试菌MIC。,抗生素,移液管1,浑浊,浑浊,浑浊,浑浊,浑浊,浑浊,M I C,临床常见病原体检查,第84页,细菌药敏试验-E-test法,1.结合稀释法和扩散法原理和特点而设计一个操作简便(如同扩散法)、准确测定MIC(如同稀释法)一个方法。,2.在涂布有待测试菌平板上放置1条内含干化、稳定、浓度由高到低呈指数梯度分布商品化抗菌药品塑料试条。35孵育1618h。,3.抑菌圈和试条横向相交处读数刻度即是待测菌MIC，参考CLSI标准判断,临床常见病原体检查,第85页,细菌药敏试验-E-test法,青霉素MIC,解释标准,S,2,R,8,结论：,MIC:1.0,该肺炎链球菌对青霉素敏感,临床常见病原体检查,第86页,缺点,Etest试条价格昂贵，当前还未广泛使用,临床常见病原体检查,第87页,药敏试验结果解释（1）,敏感（susceptible）：表示测试菌能被测定药品常规剂量给药后在体内到达血药浓度所抑制或杀灭。,耐药（resistant）：表示测试菌不能被测定药品常规剂量给药后在体内到达血药浓度所抑制或杀灭，治疗无效。,临床常见病原体检查,第88页,药敏试验结果解释（2）,中介(intermediate):测试菌能被测定药品大剂量给药后在体内到达血药浓度所抑制，或在测定药品浓集部位体液(如尿)中被抑制,该范围作为敏感与耐药之间缓冲区，防止因为微小技术误差影响试验结果。,临床常见病原体检查,第89页,（二）特殊耐药菌监测特殊试验,因为细菌存在一个或几个耐药机制，造成了细菌多重耐药性。单一药敏试验已不能完全表示细菌耐药性，必须进行一些特殊耐药性监测试验。,1.耐甲氧西林葡萄球菌筛选测定,2.氨基糖苷类抗生素高耐药肠球菌筛选测定,3.耐青霉素肺炎链球菌筛选测定,4.-内酰胺酶检测,5.超广谱-内酰胺酶检测,临床常见病原体检查,第90页,1.耐甲氧西林葡萄球菌筛选测定（methecillin resistance staphylococcus，MRS）,包含耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌,是当前造成医院感染主要病原菌。,这类葡萄球菌含有多重耐药性，即对全部一内酰胺类抗菌药品，包含青霉素族和头孢菌素族以及临床惯用其它各种抗菌药品均耐药。所以，这类葡萄球菌早期检出和确定含有主要临床意义,临床常见病原体检查,第91页,1.耐甲氧西林葡萄球菌筛选测定（methecillin resistance staphylococcus，MRS）,1g苯唑西林纸片抑菌圈直径10mm，或MIC4g/ml金黄色葡萄球菌,1g苯唑西林纸片抑菌圈直径17mm，或MIC0.5g/ml凝固酶阴性葡萄球菌称耐甲氧西林葡萄球菌,。,临床常见病原体检查,第92页,临床意义,对全部-内酰胺类药品均无效，并对氨基糖甙类、大环内脂类、克林霉素和四环素等抗生素多重耐药。,治疗首选药品为万古霉素。,临床常见病原体检查,第93页,2.氨基糖苷类抗生素高耐药肠球菌筛选测定,对各种抗菌药品包含氨基糖苷类呈固有耐药是肠球菌特点，故单用氨基糖苷类治疗肠球菌感染无效。,但如与一个作用于细胞壁抗菌药品如青霉素类适用，则可发生协同作用而增强杀菌效力。,假如肠球菌对氨基糖苷类产生了高耐药性，这种联合应用就会无效。所以及时筛选出肠球菌中氨基糖苷类高耐药株，有利于临床调整和重新确定治疗方案。,临床常见病原体检查,第94页,2.氨基糖苷类抗生素高耐药肠球菌筛选测定,定义:对30g万古霉素纸片抑菌圈直径19mm，或MIC32g/ml应视为耐万古霉素肠球菌（vancomycin resistant enteroccoccus，VRE）。,临床常见病原体检查,第95页,临床意义,耐万古霉素肠球菌当前尚无有效治疗方法，不过对青霉素敏感VRE可用青霉素和庆大霉素联合治疗，若对青霉素耐药而不是高水平耐氨基糖苷类可用壁霉素和庆大霉素。另外氯霉素、红霉素、四环素（或多西环素、或米诺环素）及利福平可用于VRE株。,临床常见病原体检查,第96页,3.耐青霉素肺炎链球菌筛选测定,定义：1g苯唑西林纸片抑菌圈直径2g/ml应视为耐青霉素肺炎链球菌。,临床常见病原体检查,第97页,临床意义,耐青霉素肺炎链球菌对氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦、头孢克肟、头孢唑啉临床治疗疗效很差，治疗时参考药敏结果选择药品，经验治疗重症感染时，可用头孢曲松或头孢噻肟联合万古霉素用药。,临床常见病原体检查,第98页,4.-内酰胺酶检测,青霉素族和头孢菌素族抗生素基本结构一内酰胺环,临床常见病原体检查,第99页,一内酰胺酶能裂解青霉素族和头孢菌素族抗生素基本结构一内酰胺环，从而使其丧失抗菌活性。,临床常见病原体检查,第100页,快速检测-内酰胺酶,阳性,临床常见病原体检查,第101页,-内酰胺酶检测意义,-内酰胺酶：可水解-内酰胺类抗生素。,临床意义：（1）流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌以及卡拉莫拉汉菌等阳性，表示对青霉素、氨卞西林以及阿莫西林耐药。（2）葡萄球菌属以及肠球菌属等，阳性表示对青霉素、氨基组青霉素、羧基组青霉素以及脲基组青霉素耐药,临床常见病原体检查,第102页,5.超广谱-内酰胺酶(extend spectum-lactamase,ESBL)检测,超广谱-内酰胺酶是由质粒介导基因所编码，可水解青霉素类、头孢菌素和氨曲南，主要见于,大肠埃希菌、肺炎克雷伯克、产酸雷伯菌及奇异变形杆菌,。,筛选方法：双纸片扩散法、三相试验和E试验,双纸片协同试验操作简便、结果可靠、成本不高，是临床上较常开展项目。,临床常见病原体检查,第103页,双纸片扩散法,药品：,头孢他啶30 ug头孢他啶/克拉维酸 30/10 ug以及头孢噻肟30 ug头孢噻肟/克拉维酸30/10 ug,结果判读：,对两组中任何一个药品，在加克拉维酸后，抑菌圈与不加克拉维酸相比，增加值 5mm 时，判定为产ESBL（如，头孢他啶抑菌圈直径16；头孢他啶/克拉维酸抑菌圈22）。,临床常见病原体检查,第104页,临床意义,产ESBL细菌,不论体外药品敏感试验结果怎样,对青霉素类、1-3代头孢菌素类和氨曲南治疗均无效，药敏也全部修改成耐药。,临床常见病原体检查,第105页,提 纲,第一节：标本采集运输、试验室评价和检验方法,第二节：病原体耐药性检测,第三节：临床感染常见病原体检测,第四节：病毒性肝炎检测,第五节：性传输疾病病原体检测,第六节：医院感染常见病原体检测,临床常见病原体检查,第106页,临床常见病原体为：细菌、病毒、真菌、寄生虫、支原体、衣原体以及立克次体等。,临床常见病原体检查,第107页,（一）细菌感染检验项目标选择,细菌感染性疾病普通均,需进行细菌学诊疗以明确病因。,三个方面着手：检测细菌或其抗原-主要包含直接涂片显微镜检验、培养、抗原检测与分析。检测抗体。检测细菌遗传物质-主要包含基因探针技术和PCR技术。,难培养或培养要求高细菌：综合利用免疫学或分子生物学检测，如结核分枝杆菌感染以及幽门螺杆菌感染等。,细菌培养是最主要确实诊方法。,临床常见病原体检查,第108页,（二）病毒感染检验项目标选择,在易感细胞内以复制方式进行增殖非细胞型微生物,病毒感染试验室检验包含,病毒分离与判定,、,病毒核酸与抗原直接检出,，以及,特异性抗体检测,。,病毒分离与判定：细胞培养。,早期诊疗伎俩：多检测病毒抗原、特异性抗体或核酸。,临床常见病原体检查,第109页,（三）真菌感染检验项目标选择与应用评价,真菌是以腐生或寄生方式摄取养料真核细胞型微生物。,真菌微生物学诊疗伎俩主要包含直接检验、培养检验、免疫学试验和动物试验,临床常见病原体检查,第110页,直接显微镜检验：初步明确真菌感染,临床常见病原体检查,第111页,分离培养：明确何种真菌感染,大多数真菌营养要求不高，惯用沙保氏培养基（SDA）培养。,浅部病原性真菌最适温度为2228，生长迟缓，大多于14周出现经典菌落。,深部病原性真菌培养在37中生长最好，生长较快，经3-4天即长出菌落。,临床常见病原体检查,第112页,真菌感染检验项目标选择与应用评价,真菌抗原检测：只适合于血清与脑脊液中隐球菌、念珠菌以及荚膜组织胞浆菌等。,真菌抗体检测：深部真菌检测。,临床常见病原体检查,第113页,（四）寄生虫感染检验项目标选择与应用评价,直接显微镜检验：观察寄生虫生活史各阶段，是寄生虫感染主要诊疗依据。,寄生虫抗体检测：辅助诊疗。,临床常见病原体检查,第114页,支原体感染检验项目标选择与评价,支原体是一群介于细菌与病毒之间，可经过滤菌器、,无细胞壁,，能在无生命培养基中生长繁殖最小原核微生物。,与人类疾病相关是肺炎支原体、唾液支原体、口腔支原体、人型支原体、发酵支原体和微小株支原体。,临床常见病原体检查,第115页,支原体感染检验项目标选择与评价,直接显微镜检验：无价值。,分离培养：阳性可明确诊疗。,当前临床多检测支原体抗原与核酸，用于早期快速诊疗。,临床常见病原体检查,第116页,螺旋体感染检验项目标选择与评价,暗视野显微镜检验：是诊疗早期梅毒唯一快速、可靠方法，尤其对已出现硬下疳而梅毒血清反应仍呈阴性者意义更大,临床常见病原体检查,第117页,梅毒血清学试验,（1）过筛试验：RPR、VDRL、TRUST,（2）确诊试验：FTA-ABS、MHA-TP、TPPA,螺旋体感染检验项目标选择与评价,TPHA,试验,临床常见病原体检查,第118页,螺旋体感染检验项目标选择与评价,脑脊液检验：VDRL试验阳性等有诊疗价值。脑脊液PCR检测，能够快速准确诊疗神经性梅毒。,TP-PCR：TPPCR检测梅毒螺旋体DNA，特异性很强，敏感性很高，是当前诊疗梅毒螺旋体先进方法。PCR检测梅毒螺旋体DNA，其敏感性、特异性均优于血清学方法,临床常见病原体检查,第119页,Howard Taylor Ricketts,立克次体检测,临床常见病原体检查,第120页,斑疹伤寒群,立克次体目,立克次体属,东方体属,埃立克体属,巴通体属,柯克斯体属,恙虫病群,斑点热群,犬埃立克体群,腺热埃立克体群,嗜吞噬细胞埃立克体群,立克次体目标类别,临床常见病原体检查,第121页,柯克斯体,临床常见病原体检查,第122页,培养特征,专性细胞内生长原核细胞性微生物,对各种抗生素敏感,引发自然疫源性疾病，且为人畜共患,临床常见病原体检查,第123页,病原体,所致疾病,立克次体属,斑疹伤寒,（流行性斑疹伤寒、地方性斑疹伤寒、,加拿大斑疹伤寒）,斑点热,（洛矶山斑点热、纽扣热、昆士兰热、,立克次体痘、北亚蜱传斑疹伤寒）,柯克斯体属,Q热,东方体属 恙虫病群（,恙虫病,）,埃立克体属 犬埃立克体群（人单核细胞埃立克体病）,腺热埃立克体群（腺热埃立克体）,嗜吞噬细胞埃立克体群（人粒细胞埃立克体病）,巴通体属 战壕热、猫抓病、Oroya热、秘鲁疣、杆菌性血管瘤、,心内膜炎,临床常见病原体检查,第124页,外斐试验为非特异性血清学诊疗试验，用于斑疹伤寒、斑点热和恙虫病确实诊,特异性血清学试验有免疫荧光试验、酶联免疫吸附试验和补体结合试验等,临床常见病原体检查,第125页,衣原体,衣原体是一类严格在细胞内寄生，有独特发育周期，能经过细菌滤器原核细胞型微生物。,衣原体属分为四个种,沙眼衣原体,肺炎衣原体,鹦鹉热衣原体,兽类衣原体,临床常见病原体检查,第126页,衣原体感染检验项目标选择与评价,直接显微镜检验：检验衣原体包涵体可提供早期初步诊疗。,分离培养：阳性可明确诊疗。,当前临床多检测衣原体抗原与核酸，用于早期快速诊疗。,临床常见病原体检查,第127页,第一节：标本采集运输、试验室评价和检验方法,第二节：病原体耐药性检测,第三节：临床感染常见病原体检测,第四节：病毒性肝炎检测,第五节：性传输疾病病原体检测,第六节：医院感染常见病原体检测,临床常见病原体检查,第128页,甲型肝炎病毒标志物检测乙型肝炎病毒标志物检测丙型肝炎病毒标志物检测,病毒性肝炎主要有7型，即甲型(HA)、乙型(HB)、丙型(HC)、丁型(HD)、戊型(HE)、庚型(HG)、输血传输病毒肝炎,它们分别由肝炎病毒甲型(HAV)、乙型(HBV)、丙型(HCV)、丁型(HDV)和戊型(HEV)、庚型(HGV)、输血传输病毒(TTV)所引发。,临床常见病原体检查,第129页,一、甲型肝炎病毒标志物检测,甲型肝炎病毒（Hepatitis A virus、HAV）属微小RNA病毒科，无包膜，关键为单股正链RNA。,临床常见病原体检查,第130页,0 1 2 3 4 5 6 7 8 26 52,粪中HAV,ALT,Anti-HAV,IgG,Anti-HAV,IgM,Weeks,HAV infection,HAV为甲型病毒性肝炎病原体，主要经过粪口路径传输。,临床常见病原体检查,第131页,临床表现为急性黄疸肝炎。,临床常见病原体检查,第132页,0 1 2 3 4 5 6 7 8 26 52,粪中HAV,ALT,Anti-HAV,IgG,Anti-HAV,IgM,Weeks,HAV infection,Graph showing the course of Hepatitis-A virus infection,临床常见病原体检查,第133页,标志物名称 检测方法 参考值,抗HAV-IgM ELISA 阴性,抗HAV-IgG ELISA 阴性,抗HAV-IgA ELISA 阴性,HAVAg ELISA 阴性,HAV-RNA RT-PCR 阴性,检测方法与参考值,临床常见病原体检查,第134页,临床意义,抗HAV IgM，说明机