NY∕T 2916-2016 棉铃虫抗药性监测技术规程(农业).pdf

ICS 65.020 B 15 NY 中华人民共和国农业行业标准NY/ T 2916一2016棉铃虫抗药性监测技术规程Code of practice of insecticide resistance monitoring of Helicoverpa armigera (Hbner) 2016-10-26发布2017 -04-01实施中华人民共和国农业部发布目。吕本标准按照GB/T 1. 1-2009给出的规则起草。本标准由农业部种植业管理司提出井归口。NY/ T 2916-2016 本标准起草单位:全国农业技术推广服务中心、南京农业大学、江苏省植物保护站、山东省植物保护总站。本标准主要起草人:张帅、吴益东、张浩男、杨亦桦、武淑文、鞠国钢、宋妹娥。I NY/ T 2916-2016 棉铃虫抗药性监测技术规程范围本标准规定了棉铃虫Helico1Jer户aan1ger(Hbner)抗药性监测的基本方法。本标准适用于棉铃虫对常用杀虫药剂及苏云金芽抱杆菌Bacillusthuringie11川杀虫晶体蛋白Cry1Ac的抗性监测。2 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。2. 1 浸叶接虫法leaf-dipping bioassay 将浸过药液并晾干的常规棉花叶片放在底部平铺琼脂凝胶的24孔培养板内，使棉铃虫2龄初幼虫接触和取食带药叶片的生物测定方法。2. 2 毒素涂表法surface contamination bioassay 将经磷酸缓冲液溶解的Cry1Ac蛋白均匀涂布到底部平铺棉铃虫人工饲料的24孔培养板表面，使棉铃虫2龄初幼虫取食饲料表面杀虫蛋白的生物测定方法。3 仪器设备3.1 电子天平(感量0.1mg)。3.2 打孔器(直径与24孔组织培养板孔径相同)。3. 3 诱虫灯。3. 4 24孔培养板(内径15.6mm)。3. 5 微波炉。3. 6 电磁炉。3. 7 移液器(5mL、1mL)。3.8 连续分液器(5mL)。3. 9 量筒(500mL)。3.10 烧杯(lOmL、25mL、100mL、500mL)。3.门人工气候箱:温度(26:1:1).C、相对湿度(RH)(60:1:10) %、光照周期16h : 8 h(L : D)。4 试剂与材料4. 1 生物试材4. 1. 1 试虫棉铃虫2龄初幼虫(初孵幼虫完成第一次蜕皮后12h以内，虫体为黑色，体重范围为1.0 mg1. 5 mg)。4. 1.2 供试植物常规棉花(不含Bt基因或其他抗虫基肉)。l NYj T 2916-2016 4. 1.3 试验人工饲料配方参见附录A。4. 2 试验药剂4.2. 1 杀虫剂原药4.2.2 CrylAc原毒素及CrylAc活化毒素Cry1Ac原毒素制备自苏云金芽抱杆菌库斯塔克亚种HD-73菌株;Cry1Ac原毒素与膜蛋白酶(Sigma, T -8642)按照蛋白含量20: 1比例于3 7C水浴2h，1M备Cry1Ac活化毒素。制备不同批次的Cry1Ac原毒素与活化毒素均需通过SDS-理且画-困山始测毒素的纯度(原毒素分子量为130ku，活化毒素分子量为65ku)，并应99%) 。5 试验步骤5. 1 试虫采集与饲利用诱虫灯随机采集棉铃将Cry15. 3 处理方5. 3. 1 浸叶列浓度，把圆 叶组织培养板内(面向上放置，每孔虫逃逸。5.3.2 毒素涂表法移取60.C左右的人粘结饲料，室温下自然凝结;比梯度稀释成5个7个浓度梯室温下晾干;在24孔培养板中每任何药剂的0.01mol/L、pH7.4的磷酸盐缓后再盖上培养板盖以防止试虫逃逸。5. 4 结果检查内敏感品系的杀虫效果v)用量的用。.4的磷酸盐缓冲液按等毒素榕液到饲料表面，置于。每个浓度处理48头，并设不含对照;接虫后的培养板用两层黑色棉布覆盖接虫后的培养板置于恒温光照培养箱(26士1) .C,RH(60+10)%,16 h : 8 h(L: O)J饲养。对于化学杀虫剂，需根据药剂作用特点来确定处理后检查死亡虫数的时间，如拟除虫菊醋类、有机磷类、氨基甲酸醋类、双目先胶类等杀虫剂处理48h后检查结果;对于杀虫作用较慢的药剂如甲氨基阿维菌素苯甲酸盐、多杀菌素、氟院腮等杀虫剂处理72h后检查结果。用毛笔轻触虫体，试虫不能正常爬行即视为死亡。对于Cry1Ac原毒素和活化毒素，处理120 h后检查结果。完全死亡或生长发育受到严重抑制(体2 NY/ T 2916-2016 重小于5mg)即视为死亡。6 数据统计与分析6. 1 死亡率计算方法根据检查数据，计算各处理的校正死亡率。按式(1)和式(2)计算，计算结果均保留到小数点后两位。式中:式中:Pz P/ P。对式中:S 一一敏感品系的7. 3 抗药性水平的评估根据抗性倍数的计算结果，按照表1评估。P1=主XI00(1)(2) (3) 平的分级标准，对测试种群的抗药性水平做出表1抗药性水平的分级标准抗药性水平分级低水平抗性巾等水平抗性高水平抗性抗性倍数(R酌，俏5. ORR,;10. 0 1O. O lOO.O 3 NY/T 2916-2016 附录A(资料性附录)棉铃虫人工饲料配方A. 1 麦胚粉1200g，大豆粉400g, :1107.K 4 000 mL，放人灭菌锅煮熟(第一次上汽后30min即可，断电后放汽使气压回到正常值)。A.2 山梨酸10g，酵母粉120g，青霉素2g(lOO万单位/g)，对是基苯甲酸甲醋20g，维生素C40g，肌醇2g，微量元素组合342.9mg，混人凉开水中搅拌均匀待用(约200mL)。微量元素混合物(342.9mg) 盐酸硫胶素(Thiaminehydrochloride) 盐酸毗多辛(Pyridoxinehydrochloride) 泛酸钙(Calciumpantothenate) 烟酌胶(Nicotinamide) 钻胶素(Cobalamin，vitaminB12) 核黄素(Riboflavin)26. 2 mg 26.2 mg 104. 3 mg 104. 3 mg 0.6 mg 52. 5 mg 叶酸(Folicacid) 26. 2 mg 生物素(Biotin)2. 6 mg A.3 琼脂100g，:11o水2000mL，微波30min至完全融化。A.4 将饲料拿出后，稍放凉，加人琼脂搅匀，放凉至600C左右即可加入A.2配好的榕液及16mL甲醒，搅拌均匀后倒入相应的容器内。A.5 待饲料冷却后盖上保鲜膜，置于40C冰箱保存。A.6 若制备的饲料用于生物测定，完成步骤A.1A. 4，将搅拌均匀的饲料放在加热器上加热，可根据需要加入适量开水。移取饲料至24孔培养板孔底，每孔900L，轻轻摇晃至液面平整，孔壁、孔口不粘结饲料，室温自然凝结备用。4 NY/ T 2916-2016 附录B(资料性附录)棉铃虫对部分杀虫剂及Cry1Ac毒素的敏感性基线B.1 棉铃虫对部分杀虫剂的敏感性基线见表B.l。表B.1棉铃虫对部分杀虫剂的敏感性基线药剂名称章斗3较标准误氯氨菊酶1. 64:1:0. 19 氯氮氧菊醋1. 07士0.16辛硫磷2. 07士0.33丙澳磷1. 95士O.21 多杀菌素1. 78:1:0. 19 澳虫脂1. 98士O.21 布虫威.64土O.21 氯虫苯甲毗胶1. 40:1:0. 16 甲氨基阿维菌素苯甲酸盐1. 37士0.15氟院H尿1.6:1:0.17 LC:o (mg/ L) (95 %置信限)3. 52(1. 636. 71) 1. 38(0. 672. 23) 3. 5H2. 4 4. 64) 7. 62(6. 946.48) 1. 27(0. 971. 68) 2. 77(2. 153. 59) 1. 71 (1. 222. 30) O . 7(0. 110. 24) 0.00051 (0. 000 360. 000 69) 4. 54(1. 9010.02) 注:敏感品系于20世纪70年代采集自非洲科特迪瓦，由拜耳作物科学公司提供。从2001年至今在南尽农业大学饲养未接触任何药剂。B.2 棉铃虫对Cry1Ac毒素的敏感性基线见表B.2。表8.2棉铃虫对Cry1Ac毒素的敏感性基线药剂名称斜率土标准误Cry1Ac原毒素2. 56土O.41 CryAc活化毒素2. 4:1:0. 25 LCso(95%置信限，g/cm2) 0.033(0.0240.042) O. 028(0. 020. 035) 注，:敏感品系于20世纪70年代采集自非洲科特迪瓦，由拜耳作物科学公司提供。从2001年至今在南厅、农业大学|饲养未接触任何药剂。注2:数据引自文献:Zhang el al. ,2011. Early warning of colton bollworm rcsislance associated wilh intensive plaming I of BI cotton in ChinaJ. PLoS ONE,6(8) :e22874. 5