兔自身免疫性干眼模型.ppt

兔自身免疫性干眼模型兔自身免疫性干眼模型兔自身免疫性干眼模型兔自身免疫性干眼模型概要概要通通过体外分离、培养兔泪腺上皮体外分离、培养兔泪腺上皮细胞和自体外周血胞和自体外周血淋巴淋巴细胞，建立二者的共培养体系。将体外激活的胞，建立二者的共培养体系。将体外激活的自体外周血淋巴自体外周血淋巴细胞通胞通过耳耳缘静脉注射的方法静脉注射的方法诱发自身免疫性泪腺炎。从而建立自身免疫性泪腺炎。从而建立稳定的兔自身免疫性定的兔自身免疫性干眼模型，干眼模型，对干眼干眼临床指床指标及泪腺及泪腺细胞因子表达胞因子表达进行行检测。兔自身免疫性干眼模型兔自身免疫性干眼模型n n实验动实验动物物物物 ：成年雌性新西成年雌性新西成年雌性新西成年雌性新西兰兰白兔，体白兔，体白兔，体白兔，体质质量量量量2.62.63.53.5kgkg。实验实验前前前前进进行兔子行兔子行兔子行兔子临临床眼科床眼科床眼科床眼科检查检查,排除已患有眼部炎症和其他疾病的排除已患有眼部炎症和其他疾病的排除已患有眼部炎症和其他疾病的排除已患有眼部炎症和其他疾病的动动物，建立物，建立物，建立物，建立正常兔眼的正常兔眼的正常兔眼的正常兔眼的临临床床床床检查检查指指指指标标的基的基的基的基线线水平。水平。水平。水平。饲饲养养养养环环境符合医学境符合医学境符合医学境符合医学实验动实验动物物物物环环境的要求，境的要求，境的要求，境的要求，动动物物物物饲饲养房温度养房温度养房温度养房温度为为 252 252，相，相，相，相对对湿湿湿湿度度度度 50%50%75%75%，12 12 小小小小时时光照昼夜循光照昼夜循光照昼夜循光照昼夜循环环，通，通，通，通风风状况好。状况好。状况好。状况好。兔自身免疫性干眼模型兔自身免疫性干眼模型n n实验实验所用的主要所用的主要所用的主要所用的主要仪仪器、器、器、器、设备设备及材料及材料及材料及材料 ：生物超生物超净工作台工作台CO2恒温恒温细胞培养箱胞培养箱移液移液枪-80超低温超低温冰箱冰箱倒置相差显微镜倒置相差显微镜台式离心机台式离心机裂隙灯显微镜摄像系统裂隙灯显微镜摄像系统离心管、枪头离心管、枪头PCR仪仪实时定量实时定量PCR仪仪流式细胞仪流式细胞仪流式管流式管超纯水装置超纯水装置低温水箱低温水箱裂隙灯显微镜裂隙灯显微镜恒温水浴锅恒温水浴锅眼科手术器械眼科手术器械祸旋仪祸旋仪高压蒸汽消毒器高压蒸汽消毒器电子天平电子天平鼓风式干燥箱鼓风式干燥箱磁力搅拌器磁力搅拌器PH测量计测量计荧光显微镜荧光显微镜SY-600恒温水箱恒温水箱Nylon细胞滤网细胞滤网兔自身免疫性干眼模型兔自身免疫性干眼模型n n主要主要主要主要试剂试剂及溶液配制及溶液配制及溶液配制及溶液配制 ：淋巴淋巴淋巴淋巴细细胞培养基（胞培养基（胞培养基（胞培养基（CMCM）RPMI1640RPMI1640细胞培养基细胞培养基细胞培养基细胞培养基 450ml450ml 胎牛血清（胎牛血清（胎牛血清（胎牛血清（FBSFBS）10%10%青链霉素青链霉素青链霉素青链霉素 100U/ml100U/ml L-L-谷氨酰胺谷氨酰胺谷氨酰胺谷氨酰胺 2mM2mM 2-mercaptoethano 0.5ml2-mercaptoethano 0.5ml泪腺上皮泪腺上皮泪腺上皮泪腺上皮细细胞培养基（胞培养基（胞培养基（胞培养基（DMEMDMEM）DMEMDMEM（1X high glucose1X high glucose）450ml450ml 胎牛血清（胎牛血清（胎牛血清（胎牛血清（FBSFBS）10%10%青链霉素青链霉素青链霉素青链霉素 100U/ml100U/ml L-L-谷氨酰胺谷氨酰胺谷氨酰胺谷氨酰胺 2mM2mM兔自身免疫性干眼模型兔自身免疫性干眼模型n n主要主要主要主要试剂试剂及溶液配制及溶液配制及溶液配制及溶液配制 ：HamsHams液液液液 Hams F-12 Hams F-12 1L1L HepesHepes 10ml/L10ml/L 牛血清蛋白蛋白（牛血清蛋白蛋白（牛血清蛋白蛋白（牛血清蛋白蛋白（BSABSA）100U/ml100U/ml 胰蛋白酶抑制剂胰蛋白酶抑制剂胰蛋白酶抑制剂胰蛋白酶抑制剂 50mg/L50mg/L 丁酸丁酸丁酸丁酸 0.22g/L 0.22g/L 青链霉素青链霉素青链霉素青链霉素 100U/ml100U/ml L-L-谷氨酰胺谷氨酰胺谷氨酰胺谷氨酰胺 2mM2mM 亚油酸亚油酸亚油酸亚油酸 1mg/ml 42ul1mg/ml 42ul各组分充分溶解于各组分充分溶解于各组分充分溶解于各组分充分溶解于900ml Hams F-12900ml Hams F-12后调节后调节后调节后调节PHPH值至值至值至值至7.47.4，Hams F-12Hams F-12定容至定容至定容至定容至1000ml1000ml，0.22m 0.22m 滤器过滤，滤器过滤，滤器过滤，滤器过滤，4 4冰箱保存备用冰箱保存备用冰箱保存备用冰箱保存备用。兔自身免疫性干眼模型兔自身免疫性干眼模型n n主要主要主要主要试剂试剂及溶液配制及溶液配制及溶液配制及溶液配制 ：HanksHanks液液液液 Hanks Salts Hanks Salts 1bottle1bottle HepesHepes 2.38g2.38g EDTA 0.76gEDTA 0.76g各组分充分溶解于各组分充分溶解于各组分充分溶解于各组分充分溶解于900ml 900ml 超纯水超纯水超纯水超纯水后调节后调节后调节后调节PHPH值至值至值至值至7.47.4，超纯水定容至，超纯水定容至，超纯水定容至，超纯水定容至 1000mL 1000mL，0.22m 0.22m 滤器过滤，滤器过滤，滤器过滤，滤器过滤，4 4冰箱避光保存冰箱避光保存冰箱避光保存冰箱避光保存。混合消化酶（混合消化酶（混合消化酶（混合消化酶（CDHCDH）胶原酶胶原酶胶原酶胶原酶 collagenasecollagenase 450unit/ml450unit/ml 透明质酸酶透明质酸酶透明质酸酶透明质酸酶 hyyaluronidasehyyaluronidase 200unit/ml200unit/ml DNADNA酶酶酶酶 25unit/ml 25unit/ml分别称取计算好的分别称取计算好的分别称取计算好的分别称取计算好的型胶原酶和透明质酸酶，将其充分溶解于一定体积的型胶原酶和透明质酸酶，将其充分溶解于一定体积的型胶原酶和透明质酸酶，将其充分溶解于一定体积的型胶原酶和透明质酸酶，将其充分溶解于一定体积的 Hams Hams液中，加入溶解分装好的液中，加入溶解分装好的液中，加入溶解分装好的液中，加入溶解分装好的 DNA DNA 酶充分混匀，酶充分混匀，酶充分混匀，酶充分混匀，0.22m 0.22m 滤器过滤，滤器过滤，滤器过滤，滤器过滤，4 4冰箱备用冰箱备用冰箱备用冰箱备用。兔自身免疫性干眼模型兔自身免疫性干眼模型n n主要主要主要主要试剂试剂及溶液配制及溶液配制及溶液配制及溶液配制 ：10%Ficoll10%FicollFicoll Ficoll 粉与粉与粉与粉与 DPBS DPBS 按比例配制高压灭菌按比例配制高压灭菌按比例配制高压灭菌按比例配制高压灭菌,分装后分装后分装后分装后-20C-20C 避光保存避光保存避光保存避光保存。实时突光定量实时突光定量实时突光定量实时突光定量 PCR PCR 试剂盒试剂盒试剂盒试剂盒 SYBR Green(Roche 491385001)SYBR Green(Roche 491385001)PE-Anti-Human Foxp3(Biolegend)PE-Anti-Human Foxp3(Biolegend)Anti-Rabbit CD4(Mouse anti-Rabbit Monoclonal AntibodyAbD)Anti-Rabbit CD4(Mouse anti-Rabbit Monoclonal AntibodyAbD)淋巴细胞分离液淋巴细胞分离液淋巴细胞分离液淋巴细胞分离液 无无无无 RNA RNA 酶水（酶水（酶水（酶水（DEPC DEPC 水）水）水）水）兔自身免疫性干眼模型兔自身免疫性干眼模型n n实验实验方法方法方法方法 ：1 1、兔泪腺上皮兔泪腺上皮兔泪腺上皮兔泪腺上皮细细胞分离、胞分离、胞分离、胞分离、纯纯化、培养化、培养化、培养化、培养（1 1）新西兰大白兔肌肉注射陆眠宁和氯胺酮（两者的比例为新西兰大白兔肌肉注射陆眠宁和氯胺酮（两者的比例为新西兰大白兔肌肉注射陆眠宁和氯胺酮（两者的比例为新西兰大白兔肌肉注射陆眠宁和氯胺酮（两者的比例为2:32:3，0.3-0.4ml/kg0.3-0.4ml/kg）进行）进行）进行）进行麻醉，剪去兔左眼睫毛，将生理盐水和碘伏按麻醉，剪去兔左眼睫毛，将生理盐水和碘伏按麻醉，剪去兔左眼睫毛，将生理盐水和碘伏按麻醉，剪去兔左眼睫毛，将生理盐水和碘伏按1:11:1稀释，充分清洗术眼结膜囊，再用生稀释，充分清洗术眼结膜囊，再用生稀释，充分清洗术眼结膜囊，再用生稀释，充分清洗术眼结膜囊，再用生理盐水清洗，以免碘伏刺激眼表，后用理盐水清洗，以免碘伏刺激眼表，后用理盐水清洗，以免碘伏刺激眼表，后用理盐水清洗，以免碘伏刺激眼表，后用0.5%0.5%盐酸丁卡因滴眼液滴术眼，后用无菌手术盐酸丁卡因滴眼液滴术眼，后用无菌手术盐酸丁卡因滴眼液滴术眼，后用无菌手术盐酸丁卡因滴眼液滴术眼，后用无菌手术器械将麻醉后的兔子在超净台中操作摘取兔左下泪腺器械将麻醉后的兔子在超净台中操作摘取兔左下泪腺器械将麻醉后的兔子在超净台中操作摘取兔左下泪腺器械将麻醉后的兔子在超净台中操作摘取兔左下泪腺,将泪腺转移到提前配置好的装有将泪腺转移到提前配置好的装有将泪腺转移到提前配置好的装有将泪腺转移到提前配置好的装有双抗双抗双抗双抗和和和和HamsHams液的液的液的液的50ml50ml离心管中离心管中离心管中离心管中。（2 2）在在在在细细胞胞胞胞间间超超超超净净台台台台进进行以下操作，将泪腺和少量的行以下操作，将泪腺和少量的行以下操作，将泪腺和少量的行以下操作，将泪腺和少量的HamsHams液放入培养皿中，先剔除液放入培养皿中，先剔除液放入培养皿中，先剔除液放入培养皿中，先剔除泪腺泪腺泪腺泪腺组织组织周周周周围围的血管、脂肪的血管、脂肪的血管、脂肪的血管、脂肪组织组织和筋膜，无菌刀将腺体切碎至和筋膜，无菌刀将腺体切碎至和筋膜，无菌刀将腺体切碎至和筋膜，无菌刀将腺体切碎至约约1mm1mm1mm1mm的的的的组织块组织块，用移液用移液用移液用移液枪枪加入加入加入加入HanksHanks液后吹打吹散液后吹打吹散液后吹打吹散液后吹打吹散组织块组织块，转转移到移到移到移到50ml50ml离心管中离心管中离心管中离心管中倾倾斜静置斜静置斜静置斜静置15min15min，弃，弃，弃，弃掉上清。掉上清。掉上清。掉上清。（3 3）然后再加入然后再加入然后再加入然后再加入HamsHams液吹打均匀液吹打均匀液吹打均匀液吹打均匀倾倾斜静置斜静置斜静置斜静置15min15min，小心弃掉上清，以防，小心弃掉上清，以防，小心弃掉上清，以防，小心弃掉上清，以防组织块组织块的的的的丢丢失。失。失。失。（4 4）加入配置好的消化加入配置好的消化加入配置好的消化加入配置好的消化酶酶（胶原（胶原（胶原（胶原酶酶，透明，透明，透明，透明质质酸酸酸酸酶酶，DNADNA酶酶）,磁力磁力磁力磁力搅搅拌器提前拌器提前拌器提前拌器提前设设置好置好置好置好温度和温度和温度和温度和转转速，速，速，速，3737恒温水浴消化恒温水浴消化恒温水浴消化恒温水浴消化10min10min。兔自身免疫性干眼模型兔自身免疫性干眼模型n n实验实验方法方法方法方法 ：1 1、兔泪腺上皮兔泪腺上皮兔泪腺上皮兔泪腺上皮细细胞分离、胞分离、胞分离、胞分离、纯纯化、培养化、培养化、培养化、培养（5 5）取出后静置取出后静置取出后静置取出后静置15min15min，弃掉上清，加入，弃掉上清，加入，弃掉上清，加入，弃掉上清，加入10ml Hanks10ml Hanks液反复吹打后静置液反复吹打后静置液反复吹打后静置液反复吹打后静置15min15min，弃掉，弃掉，弃掉，弃掉上清。上清。上清。上清。（6 6）再再再再加入配置好剩余的消化酶，加入配置好剩余的消化酶，加入配置好剩余的消化酶，加入配置好剩余的消化酶，3737水浴消化水浴消化水浴消化水浴消化30min30min，观察组织块的大小，可适当，观察组织块的大小，可适当，观察组织块的大小，可适当，观察组织块的大小，可适当的增减的增减的增减的增减10min10min。（7 7）然后用）然后用）然后用）然后用HamsHams液浸润液浸润液浸润液浸润40m40m无菌细胞筛，将其置于无菌细胞筛，将其置于无菌细胞筛，将其置于无菌细胞筛，将其置于50ml50ml离心管上，将稀释后的混离心管上，将稀释后的混离心管上，将稀释后的混离心管上，将稀释后的混合液吹打均匀后过滤，合液吹打均匀后过滤，合液吹打均匀后过滤，合液吹打均匀后过滤，1000rpm1000rpm离心离心离心离心6min6min，弃上清，弃上清，弃上清，弃上清。（8 8）加入）加入）加入）加入20ml Hanks20ml Hanks液吹打均匀，离心液吹打均匀，离心液吹打均匀，离心液吹打均匀，离心1000rpm1000rpm，6min6min，弃上清，加入，弃上清，加入，弃上清，加入，弃上清，加入5ml Hams5ml Hams液液液液充分混匀。充分混匀。充分混匀。充分混匀。（9 9）提前准）提前准）提前准）提前准备质备质量分数量分数量分数量分数为为10%10%的的的的FicollFicoll（Sigma FicollSigma Ficoll粉与粉与粉与粉与 Hams Hams液配制），用液配制），用液配制），用液配制），用HamsHams液稀液稀液稀液稀释释到到到到2%2%、3%3%、4%4%，从下到上依次，从下到上依次，从下到上依次，从下到上依次为为4%4%、3%3%、2%2%各各各各5ml5ml加入加入加入加入50ml50ml离心管中，将离心管中，将离心管中，将离心管中，将细细胞胞胞胞悬悬液液液液缓缓慢加入到慢加入到慢加入到慢加入到FicollFicoll液面上，液面上，液面上，液面上，进进行密度梯度离心，行密度梯度离心，行密度梯度离心，行密度梯度离心，400 rpm400 rpm离心离心离心离心10min10min，上下加速度，上下加速度，上下加速度，上下加速度为为0 0。兔自身免疫性干眼模型兔自身免疫性干眼模型n n实验实验方法方法方法方法 ：1 1、兔泪腺上皮兔泪腺上皮兔泪腺上皮兔泪腺上皮细细胞分离、胞分离、胞分离、胞分离、纯纯化、培养化、培养化、培养化、培养（1010）离心后，细胞在最底层。弃上清，用）离心后，细胞在最底层。弃上清，用）离心后，细胞在最底层。弃上清，用）离心后，细胞在最底层。弃上清，用PBSPBS缓冲液洗两遍细胞，洗掉杂质和缓冲液洗两遍细胞，洗掉杂质和缓冲液洗两遍细胞，洗掉杂质和缓冲液洗两遍细胞，洗掉杂质和FicollFicoll，离心结束尽可能弃干净上清。，离心结束尽可能弃干净上清。，离心结束尽可能弃干净上清。，离心结束尽可能弃干净上清。（1111）加入）加入）加入）加入DMEMDMEM完全培养基（完全培养基（完全培养基（完全培养基（10%FBS+1%10%FBS+1%双抗双抗双抗双抗+1%+1%谷氨酰胺谷氨酰胺谷氨酰胺谷氨酰胺+DMEM+DMEM基础培养基），基础培养基），基础培养基），基础培养基），进行细胞计数和细胞活性观察，细胞计数后取一定数量进行细胞计数和细胞活性观察，细胞计数后取一定数量进行细胞计数和细胞活性观察，细胞计数后取一定数量进行细胞计数和细胞活性观察，细胞计数后取一定数量10105 5细胞于细胞于细胞于细胞于100L PBS100L PBS内吹打均内吹打均内吹打均内吹打均匀，再加入匀，再加入匀，再加入匀，再加入100L100L的台盼蓝，显微镜下观察计数板上细胞染色情况，计录未着染的细胞的台盼蓝，显微镜下观察计数板上细胞染色情况，计录未着染的细胞的台盼蓝，显微镜下观察计数板上细胞染色情况，计录未着染的细胞的台盼蓝，显微镜下观察计数板上细胞染色情况，计录未着染的细胞百分比。百分比。百分比。百分比。（1212）将分离的泪腺上皮细胞）将分离的泪腺上皮细胞）将分离的泪腺上皮细胞）将分离的泪腺上皮细胞1.5101.5105 5/孔放置孔放置孔放置孔放置2424孔板中于孔板中于孔板中于孔板中于3737、5%CO5%CO2 2、100%100%饱和湿饱和湿饱和湿饱和湿度的培养箱中培养。度的培养箱中培养。度的培养箱中培养。度的培养箱中培养。兔自身免疫性干眼模型兔自身免疫性干眼模型n n实验实验方法方法方法方法 ：2 2、兔外周血淋巴兔外周血淋巴兔外周血淋巴兔外周血淋巴细细胞分离、培养胞分离、培养胞分离、培养胞分离、培养（1 1）将新西兰大白兔固定，兔耳中动脉碘伏消毒后用酒精棉球擦拭使其血管扩张，用）将新西兰大白兔固定，兔耳中动脉碘伏消毒后用酒精棉球擦拭使其血管扩张，用）将新西兰大白兔固定，兔耳中动脉碘伏消毒后用酒精棉球擦拭使其血管扩张，用）将新西兰大白兔固定，兔耳中动脉碘伏消毒后用酒精棉球擦拭使其血管扩张，用提前准备的静脉采血针和采血管采血，每只兔预计抽大约提前准备的静脉采血针和采血管采血，每只兔预计抽大约提前准备的静脉采血针和采血管采血，每只兔预计抽大约提前准备的静脉采血针和采血管采血，每只兔预计抽大约20mL20mL的外周血。的外周血。的外周血。的外周血。（2 2）用提前预热的）用提前预热的）用提前预热的）用提前预热的3737的的的的PBSPBS缓冲液将外周血稀释缓冲液将外周血稀释缓冲液将外周血稀释缓冲液将外周血稀释3 3倍后装在倍后装在倍后装在倍后装在50mL50mL离心管中（每管约离心管中（每管约离心管中（每管约离心管中（每管约30ml30ml）。）。）。）。（3 3）将每管约）将每管约）将每管约）将每管约30ml30ml稀释的外周血缓慢加入到稀释的外周血缓慢加入到稀释的外周血缓慢加入到稀释的外周血缓慢加入到10mL10mL淋巴细胞分离液液面上，离心淋巴细胞分离液液面上，离心淋巴细胞分离液液面上，离心淋巴细胞分离液液面上，离心2000 2000 rpmrpm，20min20min，上下加速度为，上下加速度为，上下加速度为，上下加速度为0 0。（4 4）离心后可见离心管中分三层，在上、中间层界面处有一以淋巴细胞为主的白色云）离心后可见离心管中分三层，在上、中间层界面处有一以淋巴细胞为主的白色云）离心后可见离心管中分三层，在上、中间层界面处有一以淋巴细胞为主的白色云）离心后可见离心管中分三层，在上、中间层界面处有一以淋巴细胞为主的白色云雾状狭窄带，这一层细胞即为所需要，吸取收集该层淋巴细胞带放入新的雾状狭窄带，这一层细胞即为所需要，吸取收集该层淋巴细胞带放入新的雾状狭窄带，这一层细胞即为所需要，吸取收集该层淋巴细胞带放入新的雾状狭窄带，这一层细胞即为所需要，吸取收集该层淋巴细胞带放入新的50mL50mL离心管离心管离心管离心管中。中。中。中。（5 5）加入）加入）加入）加入PBSPBS缓冲液，离心缓冲液，离心缓冲液，离心缓冲液，离心2000 rpm2000 rpm，10min,10min,弃上清，再加入弃上清，再加入弃上清，再加入弃上清，再加入PBSPBS缓冲液离心。缓冲液离心。缓冲液离心。缓冲液离心。兔自身免疫性干眼模型兔自身免疫性干眼模型n n实验实验方法方法方法方法 ：2 2、兔外周血淋巴兔外周血淋巴兔外周血淋巴兔外周血淋巴细细胞分离、培养胞分离、培养胞分离、培养胞分离、培养（6 6）加淋巴细胞培养基（）加淋巴细胞培养基（）加淋巴细胞培养基（）加淋巴细胞培养基（10%FBS+1%10%FBS+1%双抗双抗双抗双抗+1%+1%谷氨酰胺谷氨酰胺谷氨酰胺谷氨酰胺+RPMI1640+RPMI1640培养基培养基培养基培养基+巯基乙巯基乙巯基乙巯基乙醇），计数，进行细胞计数和细胞活性观察，细胞计数后取一定数量醇），计数，进行细胞计数和细胞活性观察，细胞计数后取一定数量醇），计数，进行细胞计数和细胞活性观察，细胞计数后取一定数量醇），计数，进行细胞计数和细胞活性观察，细胞计数后取一定数量10105 5细胞于细胞于细胞于细胞于100LPBS100LPBS内吹打均匀，再加入内吹打均匀，再加入内吹打均匀，再加入内吹打均匀，再加入100L100L的台盼蓝，计录未着染的细胞百分比。的台盼蓝，计录未着染的细胞百分比。的台盼蓝，计录未着染的细胞百分比。的台盼蓝，计录未着染的细胞百分比。（7 7）分别配制与泪腺上皮细胞等密度的细胞液。）分别配制与泪腺上皮细胞等密度的细胞液。）分别配制与泪腺上皮细胞等密度的细胞液。）分别配制与泪腺上皮细胞等密度的细胞液。兔自身免疫性干眼模型兔自身免疫性干眼模型n n实验实验方法方法方法方法 ：3 3、建立自体建立自体建立自体建立自体细细胞混合培养体系胞混合培养体系胞混合培养体系胞混合培养体系 泪腺上皮细胞培养于平底泪腺上皮细胞培养于平底泪腺上皮细胞培养于平底泪腺上皮细胞培养于平底2424孔板内（孔板内（孔板内（孔板内（1.5x101.5x105 5个个个个/孔），单独培养孔），单独培养孔），单独培养孔），单独培养2d2d的泪腺上皮细胞，进的泪腺上皮细胞，进的泪腺上皮细胞，进的泪腺上皮细胞，进行行行行 线照射（剂量为线照射（剂量为线照射（剂量为线照射（剂量为25Gy25Gy），使其失去反应能力，成为刺激细胞。），使其失去反应能力，成为刺激细胞。），使其失去反应能力，成为刺激细胞。），使其失去反应能力，成为刺激细胞。载有泪腺上皮细胞的载有泪腺上皮细胞的载有泪腺上皮细胞的载有泪腺上皮细胞的2424孔板照完射线后，每孔加入当天分离等数量的外周血淋巴细胞孔板照完射线后，每孔加入当天分离等数量的外周血淋巴细胞孔板照完射线后，每孔加入当天分离等数量的外周血淋巴细胞孔板照完射线后，每孔加入当天分离等数量的外周血淋巴细胞1.5101.5105 5个，此时泪腺上皮细胞已贴壁，淋巴细胞为悬浮细胞，加入淋巴细胞时候小心个，此时泪腺上皮细胞已贴壁，淋巴细胞为悬浮细胞，加入淋巴细胞时候小心个，此时泪腺上皮细胞已贴壁，淋巴细胞为悬浮细胞，加入淋巴细胞时候小心个，此时泪腺上皮细胞已贴壁，淋巴细胞为悬浮细胞，加入淋巴细胞时候小心缓慢加入，以防吹起已贴壁的泪腺上皮细胞，建立混合培养体系，培养缓慢加入，以防吹起已贴壁的泪腺上皮细胞，建立混合培养体系，培养缓慢加入，以防吹起已贴壁的泪腺上皮细胞，建立混合培养体系，培养缓慢加入，以防吹起已贴壁的泪腺上皮细胞，建立混合培养体系，培养5 5天。天。天。天。兔自身免疫性干眼模型兔自身免疫性干眼模型n n实验实验方法方法方法方法 ：4 4、自身免疫干眼模型的制备、自身免疫干眼模型的制备、自身免疫干眼模型的制备、自身免疫干眼模型的制备（1 1）实验分组：）实验分组：）实验分组：）实验分组：2424只术前检查合格的雌性新西兰大白兔，按照随机数表法给兔子编号，只术前检查合格的雌性新西兰大白兔，按照随机数表法给兔子编号，只术前检查合格的雌性新西兰大白兔，按照随机数表法给兔子编号，只术前检查合格的雌性新西兰大白兔，按照随机数表法给兔子编号，分为分为分为分为2 2组即正常对照组，干眼模型组组即正常对照组，干眼模型组组即正常对照组，干眼模型组组即正常对照组，干眼模型组。干眼模型组为静脉回输自体激活的外周血淋巴细干眼模型组为静脉回输自体激活的外周血淋巴细干眼模型组为静脉回输自体激活的外周血淋巴细干眼模型组为静脉回输自体激活的外周血淋巴细胞诱导的兔自身免疫性干眼胞诱导的兔自身免疫性干眼胞诱导的兔自身免疫性干眼胞诱导的兔自身免疫性干眼。正常对照组为静脉回输与干眼模型组等体积的正常对照组为静脉回输与干眼模型组等体积的正常对照组为静脉回输与干眼模型组等体积的正常对照组为静脉回输与干眼模型组等体积的PBSPBS缓冲缓冲缓冲缓冲液液液液。（2 2）干眼模型的制备：将标注好的雌性新西兰白兔固定，预先准备好输液器、）干眼模型的制备：将标注好的雌性新西兰白兔固定，预先准备好输液器、）干眼模型的制备：将标注好的雌性新西兰白兔固定，预先准备好输液器、）干眼模型的制备：将标注好的雌性新西兰白兔固定，预先准备好输液器、5ml5ml、10ml10ml针管、酒精、碘伏，以及预先准备好的淋巴细胞（混合体系混合培养针管、酒精、碘伏，以及预先准备好的淋巴细胞（混合体系混合培养针管、酒精、碘伏，以及预先准备好的淋巴细胞（混合体系混合培养针管、酒精、碘伏，以及预先准备好的淋巴细胞（混合体系混合培养5 5天，观察发天，观察发天，观察发天，观察发现淋巴细胞较之前体积变大，呈圆形，聚集性分布，周围可见围绕的泪腺上皮细胞，现淋巴细胞较之前体积变大，呈圆形，聚集性分布，周围可见围绕的泪腺上皮细胞，现淋巴细胞较之前体积变大，呈圆形，聚集性分布，周围可见围绕的泪腺上皮细胞，现淋巴细胞较之前体积变大，呈圆形，聚集性分布，周围可见围绕的泪腺上皮细胞，用用用用1ml1ml枪头缓慢吹起落在底部的淋巴细胞，收集到枪头缓慢吹起落在底部的淋巴细胞，收集到枪头缓慢吹起落在底部的淋巴细胞，收集到枪头缓慢吹起落在底部的淋巴细胞，收集到50ml50ml离心管中，在这个过程中在显微离心管中，在这个过程中在显微离心管中，在这个过程中在显微离心管中，在这个过程中在显微镜下观察进来避免吹起贴壁的泪腺上皮细胞，用镜下观察进来避免吹起贴壁的泪腺上皮细胞，用镜下观察进来避免吹起贴壁的泪腺上皮细胞，用镜下观察进来避免吹起贴壁的泪腺上皮细胞，用PBSPBS缓冲液将缓冲液将缓冲液将缓冲液将2424孔板洗两遍，孔板洗两遍，孔板洗两遍，孔板洗两遍，2000rpm2000rpm离心离心离心离心10min10min，弃掉上清，再用，弃掉上清，再用，弃掉上清，再用，弃掉上清，再用PBSPBS缓冲液洗一遍，之后加缓冲液洗一遍，之后加缓冲液洗一遍，之后加缓冲液洗一遍，之后加1ml1ml的的的的PBSPBS缓冲液计数，吹散缓冲液计数，吹散缓冲液计数，吹散缓冲液计数，吹散细胞，尽可能不要有细胞团块避免栓塞发生的可能，最后按照淋巴细胞细胞，尽可能不要有细胞团块避免栓塞发生的可能，最后按照淋巴细胞细胞，尽可能不要有细胞团块避免栓塞发生的可能，最后按照淋巴细胞细胞，尽可能不要有细胞团块避免栓塞发生的可能，最后按照淋巴细胞2102105 5每只兔子每只兔子每只兔子每只兔子的数量，每只兔子的数量，每只兔子的数量，每只兔子的数量，每只兔子1ml1ml转移到转移到转移到转移到50ml50ml离心管中放在冰上保持细胞活性，以备使用）。离心管中放在冰上保持细胞活性，以备使用）。离心管中放在冰上保持细胞活性，以备使用）。离心管中放在冰上保持细胞活性，以备使用）。兔自身免疫性干眼模型兔自身免疫性干眼模型n n实验实验方法方法方法方法 ：4 4、自身免疫干眼模型的制备、自身免疫干眼模型的制备、自身免疫干眼模型的制备、自身免疫干眼模型的制备 釆用静脉输液器，预先将釆用静脉输液器，预先将釆用静脉输液器，预先将釆用静脉输液器，预先将PBSPBS充满整个静脉回输装置排空空气预防空气栓塞。通过耳充满整个静脉回输装置排空空气预防空气栓塞。通过耳充满整个静脉回输装置排空空气预防空气栓塞。通过耳充满整个静脉回输装置排空空气预防空气栓塞。通过耳缘静脉回输激活的自体激活的外周血淋巴细胞（缘静脉回输激活的自体激活的外周血淋巴细胞（缘静脉回输激活的自体激活的外周血淋巴细胞（缘静脉回输激活的自体激活的外周血淋巴细胞（2x102x106 6/ml/ml，1ml1ml）为干眼模型组）为干眼模型组）为干眼模型组）为干眼模型组，耳缘耳缘耳缘耳缘静脉碘伏消毒后用静脉碘伏消毒后用静脉碘伏消毒后用静脉碘伏消毒后用2ml2ml的注射器推注的注射器推注的注射器推注的注射器推注1mLPBS1mLPBS确保液体进入静脉血管中，然后在接头处确保液体进入静脉血管中，然后在接头处确保液体进入静脉血管中，然后在接头处确保液体进入静脉血管中，然后在接头处换成有细胞液的注射器，注射前保证无细胞沉淀以防栓塞，匀速推注，最后换成装有换成有细胞液的注射器，注射前保证无细胞沉淀以防栓塞，匀速推注，最后换成装有换成有细胞液的注射器，注射前保证无细胞沉淀以防栓塞，匀速推注，最后换成装有换成有细胞液的注射器，注射前保证无细胞沉淀以防栓塞，匀速推注，最后换成装有PBSPBS的注射器，再输入的注射器，再输入的注射器，再输入的注射器，再输入1ml1ml左右的左右的左右的左右的PBSPBS保证细胞完全进入到血管中，以防细胞丢失。静保证细胞完全进入到血管中，以防细胞丢失。静保证细胞完全进入到血管中，以防细胞丢失。静保证细胞完全进入到血管中，以防细胞丢失。静脉回输等量脉回输等量脉回输等量脉回输等量PBSPBS的新西兰白兔为对照组。的新西兰白兔为对照组。的新西兰白兔为对照组。的新西兰白兔为对照组。兔自身免疫性干眼模型兔自身免疫性干眼模型n n临临床指床指床指床指标标的的的的检测检测 ：移植前和移植后移植前和移植后移植前和移植后移植前和移植后2 2周、周、周、周、4 4 周、周、周、周、6 6 周分别进行以下临床指标的观察：周分别进行以下临床指标的观察：周分别进行以下临床指标的观察：周分别进行以下临床指标的观察：泪液分泌量实验（泪液分泌量实验（泪液分泌量实验（泪液分泌量实验（SchirmersSchirmers实验）实验）实验）实验）将兔子固定好，在非表麻条件下，将将兔子固定好，在非表麻条件下，将将兔子固定好，在非表麻条件下，将将兔子固定好，在非表麻条件下，将 Schirmers Schirmers 试纸条顶端放置于下穹窿结膜中试纸条顶端放置于下穹窿结膜中试纸条顶端放置于下穹窿结膜中试纸条顶端放置于下穹窿结膜中外侧外侧外侧外侧1/31/3处，检查者辅助闭合兔眼，此时尽量避免兔子第三眼睑遮住角膜以及试处，检查者辅助闭合兔眼，此时尽量避免兔子第三眼睑遮住角膜以及试处，检查者辅助闭合兔眼，此时尽量避免兔子第三眼睑遮住角膜以及试处，检查者辅助闭合兔眼，此时尽量避免兔子第三眼睑遮住角膜以及试纸条，计时纸条，计时纸条，计时纸条，计时1 1分钟后取出试纸条，记录湿润长度，试验过程中尽量避免试纸条接分钟后取出试纸条，记录湿润长度，试验过程中尽量避免试纸条接分钟后取出试纸条，记录湿润长度，试验过程中尽量避免试纸条接分钟后取出试纸条，记录湿润长度，试验过程中尽量避免试纸条接触角膜，以免造成角膜上皮损伤。触角膜，以免造成角膜上皮损伤。触角膜，以免造成角膜上皮损伤。触角膜，以免造成角膜上皮损伤。泪膜稳定性实验（泪膜破裂时间泪膜稳定性实验（泪膜破裂时间泪膜稳定性实验（泪膜破裂时间泪膜稳定性实验（泪膜破裂时间tear break-up timetear break-up time，BUTBUT）将兔子固定好，眼表滴将兔子固定好，眼表滴将兔子固定好，眼表滴将兔子固定好，眼表滴10L10L荧光素液，检查者辅助兔眨眼荧光素液，检查者辅助兔眨眼荧光素液，检查者辅助兔眨眼荧光素液，检查者辅助兔眨眼 3 3 次，计时次，计时次，计时次，计时1 1分钟，检分钟，检分钟，检分钟，检查者辅助打开上下眼睑，检查者用手持裂隙灯，在钴蓝光下观察角膜表面泪膜破查者辅助打开上下眼睑，检查者用手持裂隙灯，在钴蓝光下观察角膜表面泪膜破查者辅助打开上下眼睑，检查者用手持裂隙灯，在钴蓝光下观察角膜表面泪膜破查者辅助打开上下眼睑，检查者用手持裂隙灯，在钴蓝光下观察角膜表面泪膜破裂时间以及泪河高度，重复三次取平均值。裂时间以及泪河高度，重复三次取平均值。裂时间以及泪河高度，重复三次取平均值。裂时间以及泪河高度，重复三次取平均值。角膜、结膜荧光素钠染色实验角膜、结膜荧光素钠染色实验角膜、结膜荧光素钠染色实验角膜、结膜荧光素钠染色实验 将兔子固定好，复方托比卡按散瞳，等待大约十分钟，等其瞳孔完全散开后，眼将兔子固定好，复方托比卡按散瞳，等待大约十分钟，等其瞳孔完全散开后，眼将兔子固定好，复方托比卡按散瞳，等待大约十分钟，等其瞳孔完全散开后，眼将兔子固定好，复方托比卡按散瞳，等待大约十分钟，等其瞳孔完全散开后，眼表滴表滴表滴表滴10L10L荧光素液，计时荧光素液，计时荧光素液，计时荧光素液，计时1 1分钟，使荧光素液均匀平铺于眼表，检查者辅分钟，使荧光素液均匀平铺于眼表，检查者辅分钟，使荧光素液均匀平铺于眼表，检查者辅分钟，使荧光素液均匀平铺于眼表，检查者辅助打开助打开助打开助打开上下眼上下眼上下眼上下眼睑睑，将裂隙灯下，将裂隙灯下，将裂隙灯下，将裂隙灯下调调至至至至钴蓝钴蓝光，光，光，光，观观察角膜、察角膜、察角膜、察角膜、结结膜的着染情况并拍照膜的着染情况并拍照膜的着染情况并拍照膜的着染情况并拍照记录记录。兔自身免疫性干眼模型兔自身免疫性干眼模型n n组织组织病理学病理学病理学病理学观观察察察察 ：分分分分别别于移植后于移植后于移植后于移植后6 6周从各周从各周从各周从各组组中新西中新西中新西中新西兰兰大白兔注射戊巴比妥大白兔注射戊巴比妥大白兔注射戊巴比妥大白兔注射戊巴比妥钠钠（56mg/kg56mg/kg）处处死兔子，分离死兔子，分离死兔子，分离死兔子，分离上下泪腺、上下泪腺、上下泪腺、上下泪腺、结结膜、角膜置于膜、角膜置于膜、角膜置于膜、角膜置于10%10%甲甲甲甲醛醛溶液中固定，常溶液中固定，常溶液中固定，常溶液中固定，常规规石蜡包埋，石蜡包埋，石蜡包埋，石蜡包埋，HEHE染色后染色后染色后染色后观观察浸察浸察浸察浸润润细细胞的情况。胞的情况。胞的情况。胞的情况。（1 1）取泪腺、）取泪腺、）取泪腺、）取泪腺、结结膜等膜等膜等膜等组织块组织块，用，用，用，用 10%10%甲甲甲甲醛醛溶液固定，固定后常溶液固定，固定后常溶液固定，固定后常溶液固定，固定后常规规石蜡包埋，切片。石蜡包埋，切片。石蜡包埋，切片。石蜡包埋，切片。（2 2）石蜡包埋切片后用二甲苯脱蜡，二甲苯）石蜡包埋切片后用二甲苯脱蜡，二甲苯）石蜡包埋切片后用二甲苯脱蜡，二甲苯）石蜡包埋切片后用二甲苯脱蜡，二甲苯I I、二甲苯、二甲苯、二甲苯、二甲苯各各各各5min5min，100100乙醇、乙醇、乙醇、乙醇、2min2min，9595的乙醇、的乙醇、的乙醇、的乙醇、1min1min，8080乙醇、乙醇、乙醇、乙醇、7575的乙醇各的乙醇各的乙醇各的乙醇各1min1min，蒸，蒸，蒸，蒸馏馏水洗水洗水洗水洗2min2min。（3 3）苏苏木素染色木素染色木素染色木素染色5min5min后冲洗。后冲洗。后冲洗。后冲洗。（4 4）1%1%盐盐酸乙醇浸泡酸乙醇浸泡酸乙醇浸泡酸乙醇浸泡30s30s（数下）。（数下）。（数下）。（数下）。（5 5）自来水浸泡）自来水浸泡）自来水浸泡）自来水浸泡15min15min。（6 6）伊）伊）伊）伊红红液染色液染色液染色液染色2min2min。（7 7）常）常）常）常规规脱水，脱水，脱水，脱水，95 95乙醇乙醇乙醇乙醇I I、1min1min，9595乙醇乙醇乙醇乙醇、1min1min，100100乙醇乙醇乙醇乙醇I I、1min1min，100100乙乙乙乙醇醇醇醇、1min1min，二甲苯石碳酸（，二甲苯石碳酸（，二甲苯石碳酸（，二甲苯石碳酸（3 3：1 1）1min1min，二甲苯透明，二甲苯，二甲苯透明，二甲苯，二甲苯透明，二甲苯，二甲苯透明，二甲苯I I、1min1min，二甲苯，二甲苯，二甲苯，二甲苯、1min1min。（8 8）中性）中性）中性）中性树树脂封片固定。脂封片固定。脂封片固定。脂封片固定。兔自身免疫性干眼模型兔自身免疫性干眼模型n n泪腺泪腺泪腺泪腺组织组织RNARNA的提取的提取的提取的提取 ：（1 1）分）分）分）分别别于移植后于移植后于移植后于移植后6 6周将各周将各周将各周将各组组中新西中新西中新西中新西兰兰大白兔注射戊巴比妥大白兔注