中药指纹图谱.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,中药指纹图谱,第一章 中药指纹图谱技术与中药质量控制,1.1 指纹图谱起源与发展,当代指纹判定始于19世纪末20世纪初范罪学和法医学。每个人指纹在微小细节结构上各有不一样，能够据以判别每个人特征。,指纹图谱技术应用于植物药质量控制，是从20世纪70年代，色谱技术发展，人们大量采取薄层色谱（TLC）方法，将植物中化学成份展载于由各种担体铺成薄层板上。依据薄层板上斑点位置、斑点大小、斑点颜色、斑点数目标多少进行定性判别，这种薄层判别方法具备了指纹图谱特征。,20世纪70年代及80年代，出现薄层扫描仪，日本和我国部分学者用薄层扫描仪得到复方成药扫描图作为色谱指纹图尝试应用于药材及成药分析。,20世纪80年代及90年代，高效液相技术得到发展，同时植物药中化学成份分离判定、活性成份不停说明，高效液相广泛应用于定性、定量分析。,西方普遍采取高效液相色谱法对植物药中已知及未知组分进行控制，并形成对应规范。当前,高效液相色谱法,已成为当前研究指纹图谱,主要伎俩,。,中药指纹图谱,2/54,1.2 中药指纹图谱定义,中药指纹图谱判别借用了法医学指纹判定概念。,定义：,利用当代分析技术对中药化学信息以图形（图像）方式进行表征并加以描述。,由次生代谢产物组成中药提取物色谱指纹图谱不但具备个体绝正确惟一性，更强调是物种特征惟一性与同种植物中相同性。,当代分析技术,：包含光谱、波谱、色谱、核磁共振、X射线衍射及各种技术联用。,中药化学信息,：植物药（包含起源于植物中药材）提取物（包含中药汤药）与化学合成药最根本区分是，它（即使是单味药材）是各种化学成份混合体。这种各种化学成份综合体组成了“中药化学信息”。因为中药疗效由各种成份协同作用或“相克作用”，中药中化学信息有一定含糊性。只有部分化学信息（包含已知活性成份、已知非活性成份、一部分未知成份）可表征于指纹图谱中。,中药指纹图谱,3/54,表征和描述,：“表征”是将中药化学信息经过色谱图（液相色谱图、气相色谱图或薄层色谱图）等方式进行表示；“描述”是对指纹图谱经过计算、分析、比较、评价等过程，以技术参数、指纹特征等加以说明。,中药指纹图谱研究须经过制备、分析、比较、评价和校验等过程。,分析色谱指纹图谱要求“准确识别”，不是“精密测量”；,比较供试品与对照品色谱指纹图谱要求“相同”，而不是“相同”；,评价色谱比较结果，是依据色谱指纹图谱含糊属性，着眼于宏观规律性特征分析，即着重识别完整色谱“图貌”，而不是求索细枝末节。,分析比较结果，是对供试品与对照品之间差异或一致性作出评价。,中药指纹图谱,4/54,1.3 中药指纹图谱与中药安全、有效、稳定和可控关系,药品研究主要内容包含药品安全性、有效性、稳定性和可控性，四者缺一不可。,已生产并临床使用注射剂等中成药，因为经过了药效学测试、临床评价，安全性与有效性没有，不过，现有质量控制方法不全方面性及生产过程中不稳定性造成各批次产品之间质量出现差异，在临床应用过程中往往出现非正常医疗事故。,中药指纹图谱,5/54,指纹图谱研究直接目标有两个方面：,（1）,对中药质量控制补充和提升。,现有中国药典质量控制方法及新药申报资料7，往往以1个或个以上成份为控制指标，在一定程度上反应了原药材、中间体及成品质量，但任何单一成份都难以准确、全方面地评价中药质量，不但不能进行真伪判别和优劣判别，在很多情况下，所检测指标成份（活性成份）还不含有“惟一性”，使用器材比较简单，操作比较粗糙，有时重现性差。,中药注射剂指纹图谱研究技术要求要求将指纹图谱检测指标及连续术要求作为质量标准单列项目，是对现行中药质量控制标准有益补充。,一个理想指纹图谱不但能到达定性判别目标，色谱图中大部分药谱理应到达基线分离，对大部分成份应可进行定量分析。在没有对照品情况下，也能够已知标准品针对其它未知或无标准品色谱峰进行定量。所以，中药指纹图谱是对现行中药质量标准近控制方法提升。,中药指纹图谱,6/54,（2）,控制中间体、成品一致性，降低批间差异,中药生产原材料，因土壤、气候等环境原因及采收加工不一样，实际使用时不能确保药材质量稳定，经加工提取得到中间体，每个批次在成份含量、成份组成及各成份百分比方面都不能保持一致。,经过指纹图谱研究，能够掌握每一个批次原药材、中间体中成份改变，进行有指导合理“勾兑“，确保成品在成份含量、组成百分比上一致，降低批间差异。,不论是原药材、中间体还是成品，因组方已固定、生产工艺相对恒定，药品安全性不可能直接经过指纹图谱来保障，但中药指纹图谱可直接处理中间体、成品批间一致性及稳定性问题，从而能够间接并最终保障成品安全性和有效性。,中药指纹图谱,7/54,一致性,安全性,指纹图谱,可控性,有效性,中药指纹图谱,8/54,1.4 中药指纹图谱建立意义与标准,中药指纹图谱建立是全方面反应中药内在化学成份种类与数量，进而反应中药质量。现阶段中药有效成份绝大多数没有明确，采取中药指纹图谱方式，将有效地表征中药质量。指纹图谱已为国际社会所认可，有利于中药及产品进入国际市场。,中药指纹图谱建立，应以系统化学成份和药理学研究为依靠，应表达,系统性、特征性、重现性三个基本标准,。,中药指纹图谱,9/54,系统性,：,“系统性“是指指纹图谱所反应化学成份应包含中药有效部位所含大部分成妥种类，或指标成份全部。,如：中药人参中所含有效成份多为皂苷类化合物，则其指纹图谱应尽可能多地反应其中皂苷成份；银杏叶中有效成份是黄酮和银杏内酯类，则其指纹图谱可采取两种方法针对这两类成份，分别分析，以到达系统、全方面目标。,中药指纹图谱,10/54,特征性,：,“特征性“是指指纹图谱中反应化学成份信息（详细表现为保留时间或位移值）是含有高度选择性，这些信息综合结果，将能特征地域分中药真伪与优劣，成为中药本身”化学条码“。,如：北五味妇高效液相色谱和薄层色谱指纹图谱，不但包含各种已知五味子木脂素成份，而且还有很多未知成份，这些成份之间次序、比值在一定范围内是固定，而且随药材品种不一样而不一样。经过这些整体信息，能够很好地域分北五味子与南五味子以及其它起源五味子药材，区分药材真伪与优劣。,中药指纹图谱,11/54,重现性,：,“重现性“是指所建立指纹图谱，在要求方法与条件下，不一样操作者和不一样试验室应能作出相同指纹图谱，其误差应在允许范例内，这么才能够确保指纹图谱使用含有通用性和实用性，也是作为标准方法所必备特征之一。,实现指纹图谱重现性，除在样品制备方法、分析过程、结果处理待步骤规范操作外，还应建立对应评价机制，对指纹图谱进行客观评价，并公布标准指纹图谱。,实现中药指纹图谱三标准，确保其标准化，做到统一规范，这么才能够使中药指纹图谱得以推广应用。,中药指纹图谱,12/54,1.5 国外植物药指纹图谱应用,美国FDA：允许草药保健品申报资料能够提供色谱指纹图；,WHO：1996年草药评价指导标准中要求，假如草药活性成份不明，能够提供色谱指纹图谱以证实产品质量一致。,欧共体：在草药质量指南中称，单靠测定某有效成份考查质量稳定性是不够，因为草药及其制剂是以整体为活性物质。在欧共体药品申请注册表格中植物药制品“药品教授汇报“要求经过已知含有治疗作用活性物质对原料、中间体及成品进行标准化控制。,中药指纹图谱,13/54,第二章 中药指纹图谱研究方法学,2.1 惯用指纹图谱研究方法与技术,研究对象不一样，指纹图谱研究方法与技术也不一样，并都伴随当代科技技术发展而发展。,中药指纹图谱研究所采取方法大致分为：色谱法、光谱法及其它。,色谱法包含：薄层色谱法（TLC）、液相色谱法（LC）、气相色谱法（GC）、高效毛细管电泳法（CE）；,光谱法包含：紫外光谱法（UV）、红外光谱法（IR）、近红外光谱法（NIR）；,X射线衍射法、核磁共振法（NMR）等。,中药指纹图谱,14/54,（1）,X射线衍射法及核磁共振法,这两种方法能给出药效物质基础结构信息，部分信息也可能与特定化学成份直接关联。但该两种方法所使用仪器在国内还未普及，不适应该方法应用与推广。在中药指纹图谱研究过程中不提议采取X射线衍射法及核磁共振法。,（2）,紫外可见分光光度法和红外光谱法,这两种方法能够给出药效物质基础结构信息，但所给出信息是全部化学物质结构结构信息加和，不具备指纹特征，但可作为中药指纹图谱研究辅助方法。,中药指纹图谱,15/54,（3）,近红外光谱法,此方法与红外光谱法原理相同，但检测时采取近红外波长，所给出信息是全部化学物质结构信息加和，经过一系列样本检测（必须预先知道样品中相关成份含量或样本定性归属），利用化学计量学伎俩，建立了样本与信息之间数学模型。利用该模型即可对未知样本（如：新近购进原药材或新生产成品等）进行区分分析（给出结果：合格是否、含量多少等）。,优点：检测速度快（通常为1 min）、操作简单、适宜过程控制等。,数据处理需掌握一定化学计量学知识。,近红外技术在农药、化工、农业等相关领域已广泛应用，方法成熟度较高，在中药质量控制方面有很好应用前景，可大力推广近红外技术在原材料质量控制中应用。,中药指纹图谱,16/54,（4）,薄层色谱法,薄层色谱法为传统定性、定量分析方法，广泛应用于道地药材定性判定。,版中国药典，采取薄层色谱法进行定性判别，列于【判别】项下；采取薄层扫描法进行含量测定，列于【含量测定】项下。,优点：操作简单、分析速度快、一次分析样品数量多。,缺点：重现性、精密度差。,可作为中药指纹图谱研究借鉴与补充。,（5）,液相色谱法,最惯用指纹图谱研究方法，其中高效液相色谱法（HPLC）含有分离效能高、选择性高、检测灵敏高、分析速度快、应用范围广等特点。,中药样品中含有成份绝大多数可在高效液相色谱仪上进行分析检测，方法成熟，中药指纹图谱研究应优先考虑高效液相色谱法。,中药指纹图谱,17/54,（6）,气相色谱法,气相色谱法主要用于分析气体、挥发性和半挥发性液体以及能够产生足够蒸气压固体，或者沸点在500以下，相对分子质量400以下物质。,在中药质量控制中主要用于挥发油、极性较小成份或衍生化后可挥发性成份（如脂肪酸酯）。,特点：灵敏度高、分离度好、分析速度快，定量分析精密度优于1%，但分析范围只局限于低沸点成份是其主要不足。为中药指纹图谱研究主要方法之一。,中药指纹图谱,18/54,（7）,高效毛细管电泳法,高效毛细管电泳法是以毛细管为分离通道、以高压直流电场为驱动力新型分离分析技术。适合用于中药中带电荷化合物（蛋白质、氨基酸、黄酮、生物碱）、有机酸、单糖及一些中性分子分离分析，可作为中药指纹图谱研究补充。,（8）,其它,高效液相色谱与质谱联用（HPLC-MS）、气相色谱与质谱联用（GC-MS）、毛细管电泳与质谱联用（CE-MS）等。,这些方法可在指纹图谱中部分色谱峰在无标准物质验证情况下，起到定性判别作用。,最惯用为：TLC、HPLC、GC。,中药指纹图谱,19/54,2.2 指纹图谱研究惯用仪器与设备,2.2.1 薄层扫描仪,（1）,薄层扫描流程,点样 洗脱展开 扫描检测 数据处理,（2）,薄层扫描仪主要部件,经典薄层扫描仪主要由机械扫描装置和数据处理两部分组成，新型薄层扫描仪配有自动点样器等。,（3）,主要厂家及仪器型号,日本岛津CS系列；美国Schoeffel SD3000等。,2.2.2 高效液相色谱仪,2 2.2.3 气相色谱仪,中药指纹图谱,20/54,2.3 指纹图谱研究对高效液相色谱仪要求,2.3.1 柱外效应,应尤其注意“柱外效应”对分析结果影响。,因为样品分子在液体流动相扩散系数比在气体中小45个数量级，液体流动相流速也比气相慢12个数量级，所以，样品注入色谱柱后，在柱子以外任何死空间（如进样器、柱接连接管和检测器）中，样品分子扩散和滞留都会显著引发色谱峰扩散，而使柱效降低，所以柱外死体积影响量不能忽略。,在制造和使用高效液相色谱仪时，应使柱外效应减至最小,以取得理想分析结果。,提议,：色谱柱及检测器前,死体积应最小,。,中药指纹图谱,21/54,2.3.2 流动相脱气,流动相在使用前必须进行脱气处理，以除去其中溶解气体（如O2），预防在洗脱过程中，因压力降低而产生气泡。若在低死体积检测池中存在气泡，会增加基线噪声，严重时会造成份析灵敏度下降而无法进行分析。,溶解在流动相中氧气会造成荧光猝灭，影响荧光检测器检测；可造成样品中一些级组分被子氧化或使柱中固定相发生降解而改变柱分离性能。,惯用脱气方法有,离线式脱气,和,在线式脱气,。,离线式脱气,：吹氦脱气法、加热回流法、抽真空脱气法、超声波脱气法等。离线式脱气会因流动相存放时间延长以致有空气重新溶解在流动相中；,在线式脱气,技术是把真空脱气装置串接到贮液系统中，并结合膜过滤器，实现流动相在进入输液泵前连续脱气。在线式脱气法脱气效果显著优于离线式脱气法，并适合用于多元溶剂体系。,提议,：选择,在线脱气,。,中药指纹图谱,22/54,2.3.3 梯度洗脱,梯度洗脱是流动相中含有两种或两种以上不一样极性溶剂，在洗脱过程中连续或间断改变流动相组成，以调整它极性，使每个流出组分取得最理想分离效果，并使样品中全部组分可在最短分析时间内，以适用分离度取得圆满选择性分离。分为高压梯度和低压梯度两种方式进行操作。,因为高压梯度装置中，每种溶剂是分别由泵输送，进入混合器后，溶剂可压缩性和溶剂混合时热力学体积改变，可能影响输入到色谱柱流动相组成，所以高压梯度洗脱过程中为确保流速稳定必须使用恒流泵，不然极难取得重复性结果。,低压梯度是在常压下将多元溶剂输至混合器中。,优点是：仅需要使用一个高压输液泵；减小了溶剂可压缩性影响，并能完全消除因为溶剂混合引发热力学体积改变带来误差。,提议,：选择,低压梯度,。,中药指纹图谱,23/54,2.3.4 样品进样,进样器有以下几个：,（1）,停流进样装置,为预防在带压操作下引发流动相泄露，此装置要求进样前压降至常压下再进样，操作繁琐，已较少使用。,（2）,六通阀进样装置,该方法重现性很好，较惯用。,（3）,自动进样器,自动进样器由计算机自动控制订量阀，按预先编制注射样品操作程序工作。取样、进样、复位、样品管路清洗和样品盘转动，全部按预定程序自动进行，一次可进行几十个或上百个样品分析。,自动进样样品量可连续调整，适合大量样品分析，节约人力。,（4）,提议,：中药指纹图谱研究过程中，因为对样品进样量准确度要求不高，所以对进样器选择可结合研究者实际情况，提议选择,六通阀手动进样装置,。,中药指纹图谱,24/54,2.3.5 色谱柱,2.3.6 柱温,不一样柱温下同一成份在保留时间往往发生迁移，有时还影响成份之间分离效果。,因为中药样品成份复杂性，尤其是中药指纹图谱技术要求色谱峰相对保留时间、峰面积比值相对恒定，对柱温要求应严格控制，以确保分析方法重现性。,提议,：选择,柱温箱,。,中药指纹图谱,25/54,2.3.7 检测器,（1）,紫外线检测器,应用最广，要求分析样品必须在紫外线区有吸收。,特点：灵敏度高、线性范围宽，可做成很小池体积流通，对流动相流速和温度改变不太敏感，易操作，不破坏样品，波长能够选择及可用于梯度洗脱。,（2）,示差折光检测器,示差折光检测器是通用型检测器，对在可见光或紫外线区无吸收样品普通选取。不破坏样品，缺点是对温度改变敏感，不能用低梯度洗脱，灵敏度低，不能用于痕量分析。,（3）,荧光检测器,（4）,电化学检测器,中药指纹图谱,26/54,（5）,二极管阵列检测器,光束经过流通池、分光系统后，使全部波长在二级管阵列检测器同时检测器，可得三维时间-色谱信号-吸收光谱图。,特点：可进行全波长检测，一次进样能够检测到样品中不一样波长下全部组分；光谱分辨率高，能够检测色谱峰纯度；灵敏度高，线性范围宽，基线噪声小。,可得到全部组分全波长扫描图，可用于定性分析，经过对三维色谱图分析，能够优化检测波长。,（6）,蒸发激光光散射检测器,通用性检测器。能够检测挥发性低于流动相任何样品，可作于无生色团物质检测，如碳水化合物（多糖）、类脂类（磷脂）、皂苷、不进行衍生化脂肪酸和氨基酸，以及结构不明又无标准样品未知物。,依据详细情况，进行选择。据统计，95%中药组分在可见光或紫外线区有吸收，可首选配置可编波长紫外线检测器（VWD）。,提议,：在指纹图谱研究过程中，因为并不完全了解样品中所含组分化学结构，尤其是复方制剂所含组分结构类型不一，最大吸收波长各不相同，极难一次成功地选择好检测波长。所以,最好选取二极管阵列检测器,。,中药指纹图谱,27/54,第三章 中药色谱指纹图谱研究过程中关键问题,指纹图谱技术在植物药领域已应用十余年，研究方法与研究思绪相对成熟，已形成共识，普遍采取HPLC、TLC、GC或NIR（近红外技术），对植物药有效组分进行全成份质量控制，即指纹图谱技术。,中药指纹图谱,28/54,3.1 方案设计与思绪,3.1.1 研究对象确实定,植物药或中药成份可分为：蛋白质、脂类、糖及衍生物、有机酸、酚类、鞣质、醌类、内酯、香豆精、黄酮类、皂苷类、生物碱类、甾体类、萜类、挥发油等。,当研究某个注射剂品种指纹图谱时，首先必须调研相关文件、新药申报资料（质量部分和工艺部分）及其它研究结果，尽可能详尽地了解药材、中间体及成品中所含水量成份种类及其理化性质，经综合分析后找出成品中药效成妥或有效成份，作为成品或中间体指纹图谱研究对象，即分析检测目标。,如：黄芪含黄酮、皂苷及多糖；黄芪多糖注射液是以黄芪中多糖为原料，所以对黄芪多糖注射液进行指纹图谱研究时应以多糖作为研究对象；研究其中间体时也应以多糖为研究对象；研究原药材指纹图谱时应把黄酮、皂苷及多糖作为研究对象。,复方应以君药、臣药中有效成份作为主要研究对象，佐使药中成份可采取其它指纹图谱方法进行辅助、补充研究。,中药指纹图谱,29/54,3.1.2 研究方法选择,主要采取色谱法。各种色谱法是互补，应依据研究对象实际需要和可能以及按照不一样色谱技术特点和优势而定，目标是确保方法重现性和确能反应产品质量主要化学成份。,一个中药制剂指纹图谱应能够同时采取两种或更各种方法进行研究。,指纹图谱研究方法应依据研究对象物理化学性质来选择，大多数方法可采取HPLC法。通常挥发油类采取GC。一些难以检测或采取上述方法得不到较理想分离效果时，可采取TLC或CE。,中药指纹图谱,30/54,3.1.3 研究内容,依据国家药品监督管理局下发中药注射剂指纹图谱研究技术要求（暂行）要求，主要研究内容有原药材、中间体、注射剂指纹图谱，包括样品名称、起源、制备、测定方法、指纹图谱及技术参数等研究项。,中药指纹图谱,31/54,3.2 原药材、中间体及注射剂样品选择与搜集,中药是天然产物，中药活性成份都是次生代谢产物，本身有它内在不稳定性。我国药材品种多、产地广、分散度大，造成了中药材基源复杂，形成许多同名异物品种，这些品种在传统中医临床中并未加以细分，其中多数已收入中华人民共和国药典。对于中国药典收载品种，从中医角度均可入药，这种多基源药材增加了色谱指纹图谱研究难度。,近年因为药材量需求增大，药材资源破坏严重，药材内在质量下降，炮制加工粗放造成有效成份流失，人为原因造成了药材质量不稳定，不利于色谱指纹图谱研究与应用。,我国药材GAP工程已起步，将有利于中药注射剂及其它制剂质量控制。,中药指纹图谱,32/54,已生产注射剂，因生产中药材起源基本确定，在补充其指纹图谱时，原药材样品搜集应遵照以下标准：,药材尽可能固定产地（如道地药材）、采收期、炮制方法；,对已往生产使用过药材应结合临床使用情况选择搜集样品，对工艺稳定、疗效恒定、临床使用中极少出现异常医疗事故药材批次应重点选择；,另外还应搜集不一样产地、不一样采收期药材，这些药材即使含量高低不一样，组成百分比各异，但当正常使用药材一旦出现偏差时，可经过这些批次药材实施合理“勾兑”。经过对指纹图谱研究，能够对“勾兑”过程进行指导。,中间体、注射剂因其生产工艺已经恒定，样品搜集标准也应重点选择工艺稳定、疗效恒定、临床使用中极少出现医疗事故批次。,依据中药注射剂指纹图谱研究技术要求（暂行）之要求，原药材、中间体及注射剂样品最少应搜集10批次。不能够同一批次样品分散成数个批次，充当样品。,中药指纹图谱,33/54,33 原药材、中间体及注射剂预处理,在指纹图谱研究过程中，供试品（原药材、中间体及注射剂）溶液制备过程不是关键性技术问题，但操作烦琐。,原药材供试品制备最为复杂。原药材所含各种组分混杂在一起，样品制备时，应依据所含成份和物理化学性质，经过萃取、沉淀、吸附或经过化学反应，分离富集样品。,如：黄芪药材中黄酮类成份经过碱水萃取，皂苷类成份经过大孔树脂吸附；苦参中总生物碱经过阳离子树脂吸附与解吸附。,中间体是原药材经过了多步处理而得，已经滤过了大部分成份，只保留一小 部分有效组分，样品制备时，可针对有效成份处理，并参考原药材制备方法。,样品富集后，尚需过氧化铝预柱、C18预柱、硅胶预柱、聚酰胺预柱等，以除去色素等杂质，防止干扰或对色谱柱损耗。,注射液中除少数品种添加助溶剂外，所含化学成份均含有很好水溶解性能，面且硕士产工艺时考虑到色素、生物大分子等原因，生产过程中已经过微孔滤膜、脱色等操作，所以，样品无需特殊处理，可直接分析检测。,中药指纹图谱,34/54,3.4 色谱条件选择,指纹图谱色谱条件是研究检测方法过程中最主要、关键性内容。,我们以HPLC法为例，阐述各影响原因及处理路径。,3.4.1 流动相,可用作流动相溶剂有：乙腈、甲醇、乙醇、四氢呋喃、氯仿、二氯甲烷、正已烷等。反相高效液相，以乙腈-水系统比较适合梯度洗脱。醇-水系统因为热力学和可压缩性原因，在梯度洗脱时易造成基线漂移。,在流动相中可加入磷酸、乙酸、三乙胺、二乙胺、正丁基溴化胺、十二烷基磺酸钠等各种改性剂，或采取磷酸-磷酸氢二钠/磷酸二氢钠、乙酸-乙酸钠缓冲溶液，以到达改进色谱峰分离程度及改进峰形目标。,样品中如有部分成份极性较小，在流动相中可加入少许异丙醇、四氢呋喃、氯仿、环糊精等，增加流动相对样品溶解性，首先改进峰形，另首先可快速洗脱。,对黄酮类、酚酸类成份可参考选择乙膊-水-酸系统流动相；对皂苷类成份可参考选择乙腈-水系统流动相，生物碱类成份可参考选择乙腈-水-三乙胺等系统流动相。,中药指纹图谱,35/54,3.4.2 检测波长,选择有以下方法：,参考样品全波长紫外线吸收图，选择吸收峰值；,参考对照品全波长紫外线吸收图，选择吸收峰值；,依据君、臣、佐、使组方理论，在尽可能兼顾佐使药同时，主要选择君、臣药中有效成妥及收峰值。,一个检测波长下色谱图如不能到达控制质量目标，可建立多个检测波长下指纹图谱。,中药指纹图谱,36/54,3.4.3 柱温,柱温选择与恒定是影响指纹图谱技术稳定主要原因之一。适宜柱温不但影响色谱峰分离效果，而且柱温发生改变将造成色谱峰保留时间迁移，技术参数设置就失去了意义，所以，柱温必须限定。,当色谱图某个色谱峰因溶解度差而峰形较“钝”时，可适当提升柱温（3050）；如样品中组分在常温或高温下不稳定，易发生水解、分解等改变时，可降低柱温。,中药指纹图谱,37/54,3.4.4 色谱柱,不一样厂家色谱柱因为采取填料不一样，柱效相差较大。即使流动相条件一致，用不一样填料色谱柱重复测试时，不但分离效果大不相同，而且保留时间迁移程度也比较显著。,可供选择色谱柱填料型号：Zorbax、Polaris、Kromasil、MataSil、Nucleosil。,因为中药样品复杂性，首先所含成份极性高低不等，另首先部分成份结构相同，极性相差不大，分离比较困难，所以选择色谱柱时应以主要成份得到分离为目标，柱效不易过高。,同时要考虑填料稳定性和载样量。指纹图谱普通选取510mC18填料柱，以4.6mm,250mm较适宜，其它特殊色谱柱，如氨基柱、腈基柱、酸性柱、碱性柱等，可视研究对象不一样而采取。,中药指纹图谱,38/54,3.4.5 进样量,进样量对指纹图谱结果影响不大，但加大进样量，能够减弱梯度洗脱时基线漂移程度；然而色谱柱载样量有一定程度，进样量过大，色谱柱超载，造成色谱峰峰宽增加或色谱峰尖钝化，并影响柱寿命。研究发觉，进样量应控制最高色谱峰吸收值在1000mAU以下适合。当等度洗脱时，基线平稳，进样量较平稳，进样量应尽可能降低，普通控制最高色谱峰吸收值在100mAU左右，不宜超出500mAU。,中药指纹图谱,39/54,3.4.6 色谱条件优化,当一个指纹图谱初步建立后，尚需深入优化。首先应选择不一样操作者、不一样型号仪器进行测试；其次应在其它试验室、研究单位进行测试。,国外一个成熟指纹图谱在形成法规之前，选择世界各地有名检测机构（分布于企业、医院、大学等独立分析检测室）进行复核，以确保所建立指纹图谱技术稳定、可靠。,中药指纹图谱,40/54,3.5 指纹特征选择,指纹图谱一量建立，按照中药注射剂指纹图谱研究技术要求（暂行）要求，除提供指纹图谱外，还应说明对应技术参数。但大量相对保留时间、共有峰峰面积比值等技术参数，不能直观地用来判定、判别。,经过大样本指纹图谱挖掘，找出隐藏其中指纹特征，是指纹图谱研究直接目标。,如：欧美植物药领域普遍采取以人参皂苷Rg1和人参皂苷Re峰面积作为判别中国人参、朝鲜人参、越南人参、西洋参及三七参特征参数；淫羊藿中“五指峰”是中国药典收载品种,Epimedium breuvicornum,Maxim。经典特征，依据“五指峰”特征区色谱峰组成及相互间峰面积比值，可定性判别、定量分析不一样产地、不一样提取工艺及不一样品种淫羊藿。,指纹图谱研究建立、分析、比较、评价和校验应逐步形成规范并取得共识。指纹图谱研究应结合当前实际情况，同时结合生产工艺筛选及药效和临床观察，当前阶段宜简不宜繁、宜易不宜难，基本确保产品质量基本稳定和一致.,中药指纹图谱,41/54,第四章 中药色谱指纹图谱建立与评价,按技术要求分析/抽检成品，并与对照色谱指纹图谱及技术参数比较，判别检测产品是否合格，是实施中药指纹图谱最终目标。,实现中药指纹国库券谱技术革新，除了研究中药色谱指纹图谱，还包含对照指纹图谱及其技术参数建立与指纹图谱评价等过程。,中药指纹图谱,42/54,4.,1 对照指纹图谱建立与指纹图谱评价,当前对中药材、中间体及成品（主要为注射剂）指纹图谱研究大多采取图谱法，经分析检测得到了大量色谱数据。按中药注射剂指纹图谱研究技术要求（暂行），需对以上色谱数据进行处理，才能得到指纹图谱技术参数。,如：相对保留时间、峰面积比值、相对标准偏差等。,当前多采取人工手动计算方法或借助于Microsoft Excell等应用软件计算这些参数，繁琐，易出差错，计算操作过程了也不规范。现在已对计算公式及计算过程要求规范。,中药指纹图谱,43/54,4.1.1 相关技术参数计算公式,（1）相对保留时间R,TR,T,R,（i）,T,R,（S）,T,R,（i）,各色谱峰保留时间,T,R,（s）,参考峰保留时间,（2）积分相对比值R,A,A,（i）,R,A,=,A,（s）,A,（i）,为各色谱峰积分面积；,A,（s）,为参考峰积分面积。,R,RT（i）,=,中药指纹图谱,44/54,（3）相对标准偏差RSD%,（X,i,X）,2,n -1,RSD%=,X,X,i,为样品对应参数；X为均值；n为样品数量（个）,。,中药指纹图谱,45/54,4.1.2 中药色谱对照指纹图谱建立与中药色谱指纹图谱评价标准,中药指纹图谱及技术参数一旦建立，就能够作为“标准”或“对照”/“参考”，所起作用如同对照药材，样品色谱图谱可与对照指纹图谱进行比较。在对照指纹图谱建立及与中药指纹图谱评价过程中须综合考虑以下标准。,中药指纹图谱,46/54,4.1.2.1 整体性,对照指纹图谱建与评价应注意指纹特征整体性。,一个品种对照指纹图谱是由各个含有指纹意义峰组成完整图谱组成，各个有指纹意义峰（或薄层色谱斑点）其位置（保留时间或比移值）、大小或高你（积分面积或峰高）、各峰之间相正确百分比是指纹图谱综合参数，建立和评价时从整体角度综合考虑，注意各有指纹意义峰相互依存关系。,中药指纹图谱,47/54,中药色谱指纹图谱在一定程度上与临床疗效稳定性及用药安全性方面有相关性，所以对照指纹图谱中全部色谱峰在样品指纹图谱中均应表达且可追溯。只有在对照指纹图谱中全部色谱峰稳定表达，才是确保产品真正稳定可控前提。为确保色谱指纹图谱在整体上相同，在建立对照指纹图谱时：,应尽可能包含全部含有指纹意义特征峰，尤其是含量少面指纹意义显著色谱峰、指纹特征区、共有特征区；,排除溶剂峰及其它能够追溯杂质峰，供试品制备应与工业生产相同，并尽可能采取流动相来溶解。,经过比较指纹图谱在整体上相同，楞以判断出样品真实性。,中药指纹图谱,48/54,4.1.2.2 含糊性,在实际过程中因为受到各种原因影响，样品指纹图谱中有可能出现个别色谱峰增加/降低，色谱峰图谱行为可能发生改变，如峰形、峰宽、峰高发生改变及保留时间发生偏移等，不可机械性地经过色谱图叠加来评价反指纹色谱图和相同。,增加/降低色谱峰对指纹图谱整体相同贡献，不是单纯性降低，有可能出现相互消长现象。对于难以把握色谱峰，提议由软件去进行判别评价，尽可能防止人为判别评价。,中药指纹图谱,49/54,4.2 对照指纹图谱建立方法,4.2.1 经典指纹图谱建立模式,4.2.1.1经典指纹图谱选择法,经过一组或一系列样品指纹图谱研究，从中选择一个含有经典意义或有代表性指纹图谱作为对照指纹图谱。,当样品间指纹特征相近时，该方法很好。但所选择经典指纹图谱只包含单个样品特征，选择旱过程可能出现随意性。当样品间指纹特征差异较大时，经典指纹图谱选择就很困难。,4.2.1.2 共有模式生成法,经过对一批色谱指纹图谱研究，模拟出对照指纹图谱或生成对照指纹图谱数据，即共有模式生成法。,因为共有模式生成法综合了全部样品指纹图谱信息，所以,提议使用共有模式生成法,。,中药指纹图谱,50/54,4.3指纹图谱评价方法,指纹图谱相同性评价从两个方面考虑：,（1）,色谱整体“面貌”，即有指纹意义峰数目、峰位置和次序、各峰之间大致百分比（薄层色谱还有斑点颜色）等是否相同，以判断样品真实性。,（2）,以样品与对照样品或“标准图谱”之间或不一样批次样品指纹图谱之间总积分值作量化比较。如总积分面积相差较大（如,+,20%），则说明一样量样品含有内在物质上有显著差异，这种差异是否允许，应视详细品种、详细工艺实际情况，并结合含量测定项目综合判断。,能 比较应在同一台仪器平行进行测定，评价结果可能陈致误判或不一样评价者得到不一样评价结果，提议经过计算机辅助指纹图谱相同度评价软件来进行。,中药指纹图谱,51/54,4.3.1 评价指标,采取相同度作为指纹图谱评价指标。,4.3.1 引用变量,依据中药注射剂指纹图谱研究技术要求（暂行）之要求，与中药指纹图谱相关技术参数以下：保留时间（RT）；峰高（height）；峰面积（area）；峰面积比（A%）；相对保留时间（R,RT,）；积分面积相对比值（R,A,）。,相对保留时间（R,RT,）和积分面积相对比值（R,A,）是中药指纹图谱两个关键参数，可作为指纹相同度评价主要变量。,参考国外试验室做法，现选择积分面积相对比值（R,A,）作为计算指纹图谱相同度变量。,中药指纹图谱,52/54,4.3.3 数据获取路径,将中药色谱指纹图经过扫描仪等设备，即可将图形/图像转化成ASCII数据。,从色谱软件中均可采集到截片数据，即时间与电信号响应值。,从色谱软件中均可直接读取色谱数据（如保留时间、峰面积等）。,4.3.4 相同度算法,（1）,相关系数算法,（2）,夹角余弦算法。,中药指纹图谱,53/54,主要文件：,（1）,关于印发中药注射剂指纹图谱研究技术要求（暂行）通知,（2）,中药注射剂指纹图谱研究技术要求（暂行）,（3）,中药注射剂指纹图谱试验研究技术指南（试行）,中药指纹图谱,54/54,