3种对虾病毒囊膜蛋白对假型昆虫杆状病毒的包装与对虾组织亲嗜性的影响.pdf

第5 3卷 第1 1期 2 0 2 3年1 1月中 国 海 洋 大 学 学 报P E R I O D I C A L O F O C E A N U N I V E R S I T Y O F C H I N A5 3(1 1):0 6 5 0 7 8N o v.,2 0 2 33种对虾病毒囊膜蛋白对假型昆虫杆状病毒的包装与对虾组织亲嗜性的影响马振龙1,陶奕文1,赵亚琦1,宋 柳1,郭华荣1,2 (1.中国海洋大学海洋生命学院,海洋生物遗传与育种教育部重点实验室,山东 青岛 2 6 6 0 0 3;2.中国海洋大学海洋生物进化与多样性研究所,山东 青岛 2 6 6 0 0 3)摘 要:为探究对虾白斑综合征病毒(W S S V)3种囊膜蛋白V P 1 9、V P 2 4和V P 2 8对其假型昆虫杆状病毒的包装与对虾组织亲嗜性的影响,本研究首先分析了过表达的上述3种囊膜蛋白在包装细胞(S f 9)中的亚细胞定位,然后通过共转染的方法分别构建了其假型杆状病毒:B a c m i d-G U S/V P 1 9、B a c m i d-G U S/V P 2 4和B a c m i d-G U S/V P 2 8,比较了上述3种假型杆状病毒的包装效率及其在感染对虾组织上的特异性。结果表明,过表达的V P 1 9、V P 2 4和V P 2 8均可定位于包装细胞的细胞膜上,均能促进假型病毒的包装效率,并分别提高了1 4.1%、1 1.5%和1 1.7%,且携带不同囊膜蛋白的假型病毒在感染对虾成体时具有不同的最低感染剂量和不同的组织特异性。其中,假型病毒B a c m i d-G U S/V P 1 9和B a c m i d-G U S/V P 2 4仅能感染对虾成体的心脏和肌肉组织,且在单个对虾肌肉组织中两者的最低感染剂量分别为1 1 01 1、1 1 08个具有生物活性的病毒颗粒数。而假型病毒B a c m i d-G U S/V P 2 8不仅能感染对虾的心脏和肌肉组织,还能感染对虾的鳃组织,且其在单个对虾鳃组织中的最低感染剂量为1 1 08个转导单位,在单个对虾肌肉组织中的最低感染剂量为1 1 09个转导单位。病毒感染对虾的成体组织的电镜分析结果提示,同哺乳动物细胞中的感染结果相似,假型昆虫杆状病毒在对虾成体组织中的感染也是复制缺陷的。本研究成果拓展了人们对于对虾W S S V病毒囊膜蛋白的生物学功能的认知,为假型昆虫杆状病毒介导的基因转移与表达系统的构建及其在对虾活体基因转移中的应用提供指导。关键词:对虾;假型昆虫杆状病毒;包装;白斑综合征病毒;囊膜蛋白;组织特异性 中图法分类号:Q 2 9 1 文献标志码:A 文章编号:1 6 7 2-5 1 7 4(2 0 2 3)1 1-0 6 5-1 4D O I:1 0.1 6 4 4 1/j.c n k i.h d x b.2 0 2 2 0 0 6 3引用格式:马振龙,陶奕文,赵亚琦,等.3种对虾病毒囊膜蛋白对假型昆虫杆状病毒的包装与对虾组织亲嗜性的影响J.中国海洋大学学报(自然科学版),2 0 2 3,5 3(1 1):6 5-7 8.M a Z h e n l o n g,T a o Y i w e n,Z h a o Y a q i,e t a l.E f f e c t o f t h r e e s h r i m p v i r a l e n v e l o p e p r o t e i n s o n t h e p a c k a g i n g a n d s h r i m p-t i s-s u e-t r o p i s m o f p s e u d o t y p e d i n s e c t b a c u l o v i r u sJ.P e r i o d i c a l o f O c e a n U n i v e r s i t y o f C h i n a,2 0 2 3,5 3(1 1):6 5-7 8.基金项目:国家重点研究发展计划项目(2 0 1 8 Y F D 0 9 0 1 3 0 1);山东省自然科学基金项目(Z R 2 0 2 0 M C 1 8 9)资助S u p p o r t e d b y t h e N a t i o n a l K e y R e s e a r c h a n d D e v e l o p m e n t P r o g r a m o f C h i n a(2 0 1 8 Y F D 0 9 0 1 3 0 1);t h e N a t u r a l S c i e n c e F o u n d a t i o n o f S h a n d o n g P r o v i n c e(Z R 2 0 2 0 M C 1 8 9)收稿日期:2 0 2 2-0 1-2 7;修订日期:2 0 2 2-0 3-1 7作者简介:马振龙(1 9 9 6),男,硕士生。E-m a i l:m z l h x 0 1 0 1 1 6 3.c o m 通信作者:E-m a i l:h u a r o n g g u o o u c.e d u.c n 病毒介导的基因转移技术具有毒性小、致死率低、操作简单和转移效率高等优点1。其中,哺乳动物病毒介导的有逆转录病毒、慢病毒、腺病毒和腺相关病毒表达系统,昆虫病毒介导的有昆虫杆状病毒表达系统。根据病毒是否具囊膜,上述病毒又可分为两类:腺病毒和腺相关病毒为不具囊膜病毒,病毒的衣壳是裸露的,衣壳蛋白决定了病毒的宿主专一性;而逆转录病毒、慢病毒和昆虫杆状病毒的最外层由囊膜包被,为具囊膜病毒,其囊膜蛋白在病毒侵染宿主细胞的过程中发挥识别和结合宿主受体的作用,决定着病毒侵染的宿主范围及组织和细胞的特异性2。有研究表明,一种病毒的囊膜中可以插入其他病毒的囊膜蛋白,这种插入了另一种病毒囊膜蛋白的病毒被称为假型病毒,假型病毒往往因为引入了其他病毒的囊膜蛋白而改变了其本身的宿主亲嗜性3。本实验室P u等4最早通过共转染的方法,将对虾白斑综合征病毒(W S S V)的囊膜蛋白V P 1 9和V P 2 8引入到逆转录病毒的囊膜中,发现所构建的假型逆转录病毒具有了对虾细胞亲嗜性,可以感染对虾原代培养血淋巴细胞,但是感染效率不高。随后,本实验室C h e n等5采用类似的方法将V P 1 9和V P 2 8引入到慢病毒的囊膜中,发现所构建的假型慢病毒可以感染对虾原代培养血淋巴细胞和淋巴(O k a)器官原代培养细胞,感染和表达效率明显优于逆转录病毒。但上述两种假型病毒在对虾细胞中的感染和表达中 国 海 洋 大 学 学 报2 0 2 3 年效率仍远低于哺乳动物细胞。与哺乳动物相比,昆虫和对虾的亲缘关系更近,本实验室W u等6采用类似的方法,将对虾W S S V病毒囊膜蛋白V P 2 8引入昆虫重组杆状病毒(B a c m i d-G U S)的囊膜中,发现V P 2 8可以显著提高上述杆状病毒的包装效率及其在对虾中的亲嗜性,尤其是对虾成体组织,在几乎所有染毒对虾的组织中均可检测到-葡萄糖苷酸酶基因(G U S)的表达,但是具有明显的组织特异性。本文作者推测,V P 2 8-假型昆虫杆状病毒所表现的对虾组织特异性可能与V P 2 8的引入有关,但是V P 2 8对于上述假型病毒的对虾组织特异性的贡献有多大以及对虾W S S V病毒其他囊膜蛋白是否有相似的贡献尚不清楚。V P 1 9和V P 2 4是对虾W S S V病毒另外两种重要的囊膜蛋白。V P 1 9蛋白由1 2 1个氨基酸组成,存在两个跨膜结构域,可锚定在W S S V囊膜中发挥作用7。在病毒中和实验中,抗r V P 1 9血清可显著降低W S S V感染对虾的死亡率,表明V P 1 9可能在对虾的感染中起重要作用8-9。P u等4和C h e n等5将V P 1 9分别引入到逆转录病毒和慢病毒表达系统中发现,两种方式均明显提高了假型病毒对对虾细胞的亲嗜性。因此,本文作者关注到V P 1 9对于假型昆虫杆状病毒(B a c m i d-G U S/V P 1 9)的对虾组织特异性的贡献如何这一问题。V P 2 4蛋白含有2 0 8个氨基酸,其N端存在一段跨膜结构1 0。N i u等1 1发 现 对 虾M a r s u p e n a e u s j a p o n i-c u sp I g R是一种W S S V受体,与囊膜蛋白V P 2 4相互作用,W S S V可通过p I g R-C a M-网格蛋白的内吞途径进入对虾细胞。有研究表明,斑节对虾细胞表面的几丁质结合蛋白(P m C B P)可以与V P 2 4结合,促使W S S V进入对虾细胞内1 2。因此,V P 2 4成为本研究第二个关注的对虾W S S V囊膜蛋白。S y e d M u s t h a q等1 3构建了对虾W S S V囊膜蛋白V P 2 8的重组杆状病毒表达载体,发现过表达的V P 2 8蛋白定位于昆虫包装细胞的细胞膜上,为V P 2 8可被引入重组杆状病毒的囊膜上提供了直接的实验证据。而将V P 1 9和V P 2 4引入假型昆虫杆状病毒时是否也能定位于昆虫包装细胞的细胞膜上,是否也可以提高假型病毒的包装效率以及其对于假型病毒的对虾组织特异性的贡献如何,尚不清楚。因此,为了探究V P 2 8以及另外两种囊膜蛋白V P 1 9和V P 2 4对该假型重组杆状病毒的对虾组织特异性的贡献,本研究拟通过共转染的方法分别将上述3种对虾病毒囊膜蛋白引入到昆虫杆状病毒(B a c m i d-G U S)的囊膜中,然后比较上述3种假型病毒的包装效率及其在对虾中的组织特异性,并进一步分析上述3种囊膜蛋白在包装细胞(S f 9)中的亚细胞定位。本研究成果将拓展人们对于对虾W S S V病毒囊膜蛋白的生物学功能的认知,并为假型昆虫杆状病毒介导的基因转移与表达系统的构建及其在对虾活体基因转移中的应用提供指导。1 材料与方法1.1 对虾和小龙虾健康的刀额新对虾(M e t a p e n a e u s e n s i s),体质量为1 5 2 0 g,体长为1 01 5 c m,购自山东省青岛市南山水产品市场,于过滤的充气海水中暂养,每日换水1次,禁食,用于病毒感染实验。克氏原螯虾(P r o c a m b a r u s c l a r k i i)又称小龙虾,体质量为2 0 2 5 g,体长为1 3 2 0 c m,购自山东省青岛市南山水产品市场,于浅层的曝气自来水中暂养。取感染W S S V致死的冻存小龙虾的肌肉组织,制备病毒粗提液,以肌肉注射的方式感染小龙虾,制备W S S V染毒小龙虾,用于提取W S S V全基因组。1.2 S f 9细胞S f 9细胞系来源于草地贪夜蛾(S p o d o p t e r a f r u g i-p e r d a)的卵巢组织,复苏后置于含1 0%胎牛血清(F B S)的S I M培养基(S i n o b i o l o g i c a l公司)中,于2 8 培养箱中培养,每隔23 d传代一次,用于杆状病毒的包装和滴度测定。1.3 表达质粒基础质粒p c D N A 3.1/V 5-H i s购自I n v i t r o g e n公司,克隆质粒p MD 1 9-T购自T a K a R a公司,表达质粒p c D N A 3.1-V P 1 9、p c D N A 3.1-V P 2 8、p c D N A 3.1-V P 2 8-T A A/m C h e r r y和昆虫杆状病毒G U S报告基因重组表达质粒B a c m i d-G U S为实验室前期构建4,6。表达质粒p c D N A 3.1-V P 2 4的构建方法如下:根据对虾W S S V病毒囊膜蛋白V P 2 4的开放阅读框(O R F)序列设计特异性引物,并在引物两端加上酶切位点E c o R和B a mH,引物序列见表1。W S S V染毒小龙虾的肌肉组织总D N A的提取采用T I A N a m p G e-n o m i c D N A K i t试剂盒(T i a n G e n公司),利用超微量分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测D N A的质量和浓度。以W S S V染毒小龙虾的肌肉组织总D N A基因组为模板,使用P r e m i x T a qT M试剂盒(T a K a R a公司)扩增V P 2 4基因的编码框,P C R产物凝胶电泳,切胶回收并与克隆载体p M D 1 9-T连接,测序验证后,利用E c oR 和B a mH双酶切,将V P 2 4基因片段定向插入表达质粒p c D N A 3.1/V 5-H i s,构建p c D N A 3.1-V P 2 4重组表达质粒。为验证对虾病毒囊膜蛋白(V P 1 9和V P 2 4)在包装细胞(S f 9)中的亚细胞定位,本文进一步构建了红色荧光蛋白(m C h e r r y)标记的V P 1 9囊膜蛋白的融合表达重组质粒:p c D N A 3.1-V P 1 9-T A A/m C h e r r y,以及绿色荧光蛋白(e G F P)标记的V P 2 4囊膜蛋白融合表达重661 1期马振龙,等:3种对虾病毒囊膜蛋白对假型昆虫杆状病毒的包装与对虾组织亲嗜性的影响组质粒:p c D N A 3.1-V P 2 4-T A A/e G F P,所用引物序列见表1。其中,m C h e r r y和e G F P均标记在上述2个囊膜蛋白的羧基端(C端),并分别删除了其前面的囊膜蛋白的终止密码子(T A A)。将无终止密码子的V P 1 9和V P 2 4基因片段分别插入到B a mH 和E c oR 之间,将m C h e r r y和e G F P报告基因片段分别插入到其后的E c oR和N o t之间。上述以p c D N A 3.1/V 5-H i s为基础质粒的重组表达质粒的纯化采用F a s t P u r e E n d o F r e e P l a s m i d M a x i K i t试剂盒(诺唯赞生物公司)。B a c m i d-G U S重组质粒的纯化采用P u r e L i n kT M H i P u r e P l a s m i d D N A P u r i-f i c a t i o n K i t s试剂盒(I n v i t r o g e n公司),直接从B a c m i d-G U S重组菌株D H 1 0 B a cT M中提取6。所使用的溶菌肉汤(L B)液体培养基中含5 0 g/m L卡那霉素、7 g/m L庆大霉素和1 0 g/m L四环素。各种表达质粒冻存于-2 0 备用。表1 P C R引物T a b l e 1 P C R p r i m e r s u s e d i n t h i s s t u d y基因 G e n e引物序列(5 3)P r i m e r s e q u e n c e(5 3)V P 2 4F:G G A T C C A T G C A C A T G T G G G G G G T T T A C;R:G A A T T C T T A T T T T T C C C C A A C C T T A A A C A G AV P 1 9-T A AF:C G G G A T C C A T G G C C A C C A C G A C T A A C A C;R:C G G A A T T C C T G C C T C C T C T T G G G G T A AV P 2 4-T A AF:G G A T C C A T G C A C A T G T G G G G G G T T T A C;R:G A A T T C T T T T T C C C C A A C C T T A A A C A G A T C A Tm C h e r r yF:C G G A A T T C A T G G T G A G C A A G G G C G A G;R:A T A A G A A T G C G G C C G C T T A C T T G T A C A G C T C G T C C Ae G F PF:C G G A A T T C A A T A T G G T G A G C A A G G;R:A T A A G A A T G C G G C C G C T T A C T T G T A C A G 注:F表示正向引物;R表示反向引物。F r e p r e s e n t s f o r w a r d p r i m e r;R r e p r e s e n t s r e v e r s e p r i m e r.1.4 3种假型昆虫杆状病毒的包装、浓缩和纯化3种假型昆虫杆状病毒的包装、浓缩和纯化参照W u等6的方法进行,采用了W u等6所报道的V P 2 8-假型杆状病毒包装时的最佳共转染条件,包括囊膜蛋白表达质粒与昆虫杆状病毒表达质粒(B a c m i d-G U S)的共转染比例为3 1,转染试剂(L)质粒(g)=5 1,以及转染后第5天收集病毒等。其中,3种对虾W S S V囊膜蛋白(V P 1 9、V P 2 4和V P 2 8)对于假型杆状病毒的包装效率的影响实验在4 8孔细胞培养板中进行,分别比较了其在最佳转染条件和非最佳转染条件下的包装效率。具体方法如下:将S f 9细胞均匀接种到4 8孔板中,待细胞铺板率达到8 0%9 0%时,采用C e l l f e c t i n R e a g e n t(G i b c o公司)进行转染。其中,最佳转染条件为:于1.5 m L离心管中,在终体积为2 0 0 L的无血清无抗生素的G r a c e昆虫培养基(供应商:G i b c o公司)中溶解0.3 7 5 g B a c m i d-G U S重组质粒、0.1 2 5 g囊膜蛋白表达质粒p c D N A 3.1-V P 1 9(或p c D N A 3.1-V P 2 4,或p c-D N A 3.1-V P 2 8)和2.5 L C e l l f e c t i n 转染试剂,混匀,室温孵育3 0 m i n;弃除旧培养基,将2 0 0 L/孔上述脂质体-D N A复合物加入到4 8孔板中,于2 8 培养4 5 h后,更换培养液为含1 0%F B S的S I M培养基;继续孵育5 d后,进行X-g l u c染色,检测G U S基因的表达。与此不同的是,非最佳转染条件为:每孔0.1 5 g B a c m i d-G U S重组质粒、0.0 5 g囊膜蛋白表达质粒和1 L C e l l f e c t i n 转染试剂,其他条件同上。G U S基因的表达产物为-葡萄糖苷酸酶,是一个水解酶,X-g l u c(5-溴-4-氯-3-吲哚-葡萄糖苷酸)是该酶的水解底物,可被该酶水解产生无色的吲哚氧基中间产物,吲哚氧基中间产物可被进一步氧化成为蓝色沉淀,沉积于组织和细胞的原位,因而可根据X-g l u c染色的结果来检测G U S基因的表达。X-g l u c染色方法:首先弃除旧培养基,每孔加2 0 0 L P B S溶液(8 m g/m L N a C l、0.2 m g/m L K C l、3 m g/m L N a2H P O4(1 2 H2O和0.2 m g/m L KH2P O4,p H=6.8)洗涤1次;其次加1 2 5 L固定液,固定5 m i n,用P B S洗涤2次;然后加入1 2 5 L X-g l u c细胞染液(含1 m g/m L X-g l u c、5 mm o l/L K3F e(C N)6、5 mm o l/L K4F e(C N)6和2 mm o l/L M g C l2的P B S溶液)6,孵育过夜;最后第二天弃染液,用P B S洗涤1次,加5 0 0 L P B S后,观察拍照。3种假型病毒:B a c m i d-G U S/V P 1 9、B a c m i d-G U S/V P 2 4和B a c m i d-G U S/V P 2 8的包装实验在直径1 0 c m的细胞培养皿内进行,采用前面提及的最佳转染条件,不同的是,在终体积为5 0 0 L的无血清无抗生素的G r a c e培养基中溶解1 5 g B a c m i d-G U S质粒、5 g p c D N A 3.1-V P 1 9(或p c D N A 3.1-V P 2 4,或p c D N A 3.1-V P 2 8)表达质粒以及1 0 0 L C e l l f e c t i n 转染试剂。76中 国 海 洋 大 学 学 报2 0 2 3 年转染后继续孵育5 d后,收集细胞培养基上清,离心去除细胞碎片,获得P 1代病毒上清;将6个直径1 0 c m细胞培养皿中分别接种上4 0 0 L P 1代病毒上清,感染5 d后,收集所有培养基上清并离心,获得P 2代病毒上清。病毒的浓缩方法如下:用0.4 5 m滤膜过滤收集到的P 2代病毒上清,并转移到超速离心管中;在离心管底部加入2 5%的蔗糖溶液,于4 下8 0 0 0 0g离心7 5 m i n,进行病毒的浓缩和纯化,加入1 0 0 L的无菌P B S溶液重悬病毒颗粒,分装储存于-8 0 备用。浓缩后的假型病毒的滴度测定方法如下:将S f 9细胞接种到9 6孔板,待细胞密度达到8 0%9 0%时,分别接种经无血清无抗生素的S I M培养基梯度稀释(1 0-11 0-8)的假型昆虫杆状病毒:B a c m i d-G U S/V P 1 9、B a c m i d-G U S/V P 2 4和B a c m i d-G U S/V P 2 8,每孔添加1 0 0 L病毒稀释液,于2 8 培养箱中培养5 d后,进行X-g l u c染色,检测G U S基因的表达。转导单位(T U)指可以感染并进入到靶细胞中的病毒基因组数。病毒滴度(T U/m L)=阳性细胞百分数细胞总数稀释倍数/病毒稀释液体积(m L)。1.5 囊膜蛋白V P 1 9、V P 2 4和V P 2 8在包装细胞S f 9中的细胞膜定位 将S f 9细胞接种到1 2孔培养板中的细胞爬片上,待细胞铺板率达到7 0%8 0%时,将B a c m i d-G U S分别同p c D N A 3.1-V P 1 9-T A A/m C h e r r y、p c D N A 3.1-V P 2 4-T A A/e G F P和p c D N A 3.1-V P 2 8-T A A/m C h e r r y按照最优转染条件共转染到S f 9细胞中。转染9 6 h后在激光共聚焦显微镜下观察上述3种融合表达的囊膜蛋白在细胞中的表达并拍照。1.6 3种假型昆虫杆状病毒感染对虾成体根据3种假型昆虫杆状病毒的滴度来确定其在对虾成体组织中的最高和最低注射剂量,如表2所示。对照组对虾注射P B S溶液,实验组分别注射三种假型病毒。采用肌肉注射的感染方式,注射部位为第一、二腹足之间。注射完毕后,摁压针眼1 0 s左右以防止病毒溶液漏出。感染5 d后,分别取染毒对虾的心脏、O k a器官、肠、鳃和肌肉组织,置于1.5 m L E P管中;然后加入X-g l u c组织染液(1 m o l/L磷酸钠缓冲液、0.5 m o l/L N a2E D T A、1 0%T r i t o n X-1 0 0、5 0 mm o l/L K3F e(C N)6和5 0 m g/m L X-g l u c)6,浸没组织;置于3 7 培养箱孵育1 2 h,弃除染液,加P B S洗涤后,于体视显微镜下观察并拍照。为了检测假型病毒在对虾组织中是否具有复制和增殖能力,选择上述3种假型昆虫杆状病毒的最大剂量感染对虾,取G U S表达阳性的组织进行透射电镜分析。其 中,假 型 病 毒B a c m i d-G U S/V P 1 9、B a c m i d-G U S/V P 2 4和B a c m i d-G U S/V P 2 8的对单个对虾最大剂量分别是1 1 09、1 1 09和1 1 01 1个转导单位,前2种假型病毒的G U S表达阳性组织为心脏和肌肉,另外一种假型病毒的G U S表达阳性组织为心脏、鳃和肌肉。分别取大小为1 2 mm3的组织块,于4 预冷的2.5%戊二醛固定液中4 固定1 2 h,然后送至青岛大学医学院进行透射电子显微镜分析和观察。表2 3种假型病毒在对虾成体组织中的注射剂量T a b l e 2 T h e i n j e c t i o n d o s e s o f t h r e e p s e u d o t y p e d v i r u s e s i n a d u l t s h r i m p s病毒名称 V i r u s n a m e假型病毒的注射剂量(个体中的转导单位)T h e i n j e c t i o n d o s e s o f p s e u d o t y p e d v i r u s e s(T U i n i n d i v i d u l a l)第1组 G r o u p 1第2组 G r o u p 2第3组 G r o u p 3第4组 G r o u p 4第5组 G r o u p 5B a c m i d-G U S/V P 1 901 1 081 1 091 1 01 01 1 01 1B a c m i d-G U S/V P 2 41 1 071 1 081 1 0900B a c m i d-G U S/V P 2 81 1 071 1 081 1 0900注:每组有3只虾,每只虾仅注射一种病毒或不注射病毒。T h e r e a r e t h r e e s h r i m p s i n e a c h g r o u p,a n d e a c h s h r i m p i s o n l y i n j e c t e d w i t h o n e v i r u s o r n o t.1.7 统计学分析所有实验至少重复3次。应用软件I m a g e J计算3种假型昆虫杆状病毒在S f 9细胞中的感染与表达效率。阳性G U S信号的百分比通过以下公式计算:(具有G U S信号的阳性细胞数/细胞总数)1 0 0%。采用S P S S软件对数据进行统计学分析。2 实验结果2.1 真核表达载体p c D N A 3.1-V P 2 4的构建如图1所示,成功扩增得到对虾W S S V囊膜蛋白V P 2 4基因的编码框,大小位于5 0 07 5 0 b p之间,符合预期(见图1 A)。测序结果如图1 C所示,V P 2 4扩增片段与W S S V印度株的V P 2 4基因序列一致(见图1 D)。这表明含V P 2 4的表达质粒:p c D N A 3.1-V P 2 4已构建成功(见图1 B)。861 1期马振龙,等:3种对虾病毒囊膜蛋白对假型昆虫杆状病毒的包装与对虾组织亲嗜性的影响(A.V P 2 4基因的P C R扩增产物的凝胶电泳结果。其中:泳道M为T r a n s2 K P l u s D N A m a k e r;泳道1和2均为V P 2 4扩增产物。B.p c D N A 3.1-V P 2 4的质粒图谱。C.V P 2 4基因的测序结果。其中下划线分别代表酶切位点B a mH和E c oR。方框标出起始密码子(A T G)和终止密码子(T A A)。D.2种V P 2 4基因的同源比对结果。V P 2 4:P C R扩增片段。V P 2 4-:W S S V印度株(G e n B a n k N o.D Q 6 8 1 0 6 8.1)。A.T h e a g a r o s e g e l e l e c t r o p h o r e s i s a n a l y s i s o f P C R p r o d u c t s o f V P 2 4 g e n e.L a n e M:T r a n s2 K P l u s D N A m a k e r.L a n e s 1 a n d 2:P C R p r o d u c t s o f V P2 4 g e n e.B.T h e p l a s m i d m a p o f p c D-N A 3.1-V P 2 4.C.s e q u e n c e a n a l y s i s o f V P 2 4 g e n e.T h e e n d o n u c l e a s e c l e a v a g e s i t e s o f B a mH a n d E c oR a r e u n d e r l i n e d.T h e i n i t i a t i o n c o d o n(A T G)a n d t e r m i n a t i o n c o d o n(T A A)a r e b o x e d.D.t h e a l i g n m e n t r e s u l t o f t w o n u c l e i c a c i d s e q u e n c e s o f V P 2 4 g e n e.V P 2 4,t h e s e q u e n c e o f a m p l i f i e d V P 2 4 g e n e i n t h i s s t u d y.V P 2 4-,t h e s e q u e n c e o f V P 2 4 g e n e o f t h e I n d i a n s t r a i n(G e n B a n k N o.D Q 6 8 1 0 6 8.1).)图1 表达质粒p c D N A 3.1-V P 2 4的构建F i g.1 C o n s t r u c t i o n o f t h e e x p r e s s i o n p l a s m i d o f p c D N A 3.1-V P 2 496中 国 海 洋 大 学 学 报2 0 2 3 年2.2 3种对虾病毒囊膜蛋白对假型昆虫杆状病毒包装效率的影响 如图2 A 1F 1所示,在最佳转染条件下,B a c m i d-G U S重组表达质粒单独转染S f 9细胞的转染效率为(8 5.7 3.4)%,而B a c m i d-G U S分别同3种对虾病毒囊膜蛋白表达质粒p c D N A 3.1-V P 1 9、p c D N A 3.1-V P 2 4和p c D N A 3.1-V P 2 8共转染S f 9细胞的转染效率分别为(9 0.70.3)%、(8 7.31)%和(8 51)%。由于G U S报告基因的表达效率同病毒的包装效率正相关,因此,上述结果提示,同非假型病毒B a c m i d-G U S相比,上述3种假型病毒的包装效率没有得到明显提高。换言之,在最佳转染条件下对虾病毒3种囊膜蛋白(V P 1 9、V P 2 4和V P 2 8)对其假型病毒(B a c m i d-G U S/V P 1 9、B a c m i d-G U S/V P 2 4和B a c m i d-G U S/V P 2 8)的包装效率没有明显的促进作用。(A 1F 1为最优转染条件下的转染结果,即B a c m i d-G U S质粒为0.3 7 5 g/孔。A 2F 2为非最佳转染条件下的转染结果,即B a c m i d-G U S质粒为0.1 5 g/孔。A 1和A 2分别为不加B a c m i d-G U S质粒的阴性对照。B 1和B 2为B a c m i d-G U S单独转染结果。C 1和C 2为B a c m i d-G U S与p c D N A 3.1-V P 1 9共转染结果。D 1和D 2为B a c m i d-G U S与p c D N A 3.1-V P 2 4共转染结果。E 1和E 2为B a c m i d-G U S与p c D N A 3.1-V P 2 8共转染结果。F 1为B 1E 1的转染效率的柱状图。F 2为B 2E 2的转染效率柱状图。转染效率为平均值(标准误(n=9)。表示差异显著,单因素方差分析,P 0.0 5。标尺,1 0 0 m。P a n e l s A 1 t o F 1 a r e t h e r e s u l t s o b t a i n e d u n d e r t h e o p t i m a l c o-t r a n s f e c t i o n c o n d i t i o n,t h e a m o u n t o f B a c m i d-G U S p l a s m i d u s e d i s 0.3 7 5 g/w e l l.P a n e l s A 2 t o F 2 a r e t h e r e s u l t s o b t a i n e d u n d e r n o n-o p t i m a l t r a n s f e c t i o n c o n d i t i o n,t h e a m o u n t o f B a c m i d-G U S p l a s m i d u s e d i s 0.1 5 g/w e l l.P a n e l s A 1 a n d A 2,t h e u n-t r a n s f e c t e d c o n t r o l S f 9 c e l l s.P a n e l s B 1 a n d B 2:T h e S f 9 c e l l s t r a n s f e c t e d b y B a c m i d-G U S.P a n e l s C 1 a n d C 2,t h e S f 9 c e l l s c o-t r a n s f e c t e d b y B a c m i d-G U S a n d p c D N A 3.1-V P 1 9.P a n e l s D 1 a n d D 2:T h e S f 9 c e l l s c o-t r a n s f e c t e d b y B a c m i d-G U S a n d p c D N A 3.1-V P 2 4.P a n e l s E 1 a n d E 2:T h e S f 9 c e l l s c o-t r a n s f e c t e d b y B a c m i d-G U S a n d p c D N A 3.1-V P 2 8.P a n e l s F 1 s h o w s t h e c o r r e s p o n d i n g p a c k a g i n g e f f i c i e n c i e s o f P a n e l s B 1 t o E 1.F 2 s h o w s t h e c o r r e s p o n d i n g p a c k a g i n g e f f i c i e n c i e s o f p a n e l s B 2 t o E 2.D a t a f o r t r a n s f e c t i o n e f f i c i e n c y i s e x p r e s s e d a s a v e r a g e(s t a n d a r d e r r o r(n=9).r e p r e s e n t s s i g n i f i c a n