CircBACH1调节miR-140-5p_MDM2轴对多发性骨髓瘤细胞增殖、凋亡和化疗敏感性的影响 (1).pdf

Tianjin Med J,November 2023,Vol.51 No.11CircBACH1调节miR-140-5p/MDM2轴对多发性骨髓瘤细胞增殖、凋亡和化疗敏感性的影响刘荟敏，许旋旋，王远丽，熊涛，唐元艳摘要：目的探讨CircBACH1对多发性骨髓瘤（MM）细胞增殖、凋亡和化疗敏感性的影响以及在此过程中对miR-140-5p/MDM2轴的调节机制。方法收集MM组和正常对照组骨髓浆细胞，将人MM细胞系U266细胞分为未转染（Control）组、si-NC 组、si1-CircBACH1 组、si2-CircBACH1 组、si-CircBACH1+anti-miR-NC 组、si-CircBACH1+anti-miR-140-5p组。实时荧光定量PCR检测细胞中CircBACH1、miR-140-5p、鼠双微体2（MDM2）mRNA的表达；CCK-8法检测细胞增殖活性；流式细胞术检测细胞凋亡及对硼替佐米的敏感性；Western blot检测细胞中B细胞淋巴因子2（Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（Bax）、裂解的胱天蛋白酶（cleaved caspase）-3蛋白的表达；双萤光素酶报告基因实验验证CircBACH1、miR-140-5p、MDM2三者的靶向关系。结果与正常对照组相比，MM组的骨髓浆细胞及U266细胞中 CircBACH1、MDM2 mRNA 表达升高，miR-140-5p 表达降低（P0.05）；与 Control 组和 si-NC 组相比，si-CircBACH1组细胞中CircBACH1、MDM2的mRNA表达、细胞增殖活性、Bcl-2蛋白表达均降低，miR-140-5p的表达、细胞凋亡率、化疗敏感性及cleaved caspase-3、Bax表达均升高（P0.05）；而回补实验中，si-CircBACH1对MM细胞的影响被anti-miR-140-5p逆转，且MDM2的表达也升高（P0.05）。双萤光素酶基因报告实验验证了CircBACH1、MDM2均与miR-140-5p存在靶向关系。结论敲低CircBACH1能够上调miR-140-5p表达，下调MDM2的表达，抑制MM细胞的增殖，促进MM细胞凋亡，提高化疗敏感性。关键词：多发性骨髓瘤；细胞增殖；细胞凋亡；CircBACH1；miR-140-5p；MDM2轴；化疗敏感性中图分类号：R733.3文献标志码：ADOI：10.11958/20230126Impacts of CircBACH1 on proliferation,apoptosis and chemosensitivity of multiple myelomacells by regulating miR-140-5p/MDM2 axisLIU Huimin,XU Xuanxuan,WANG Yuanli,XIONG Tao,TANG YuanyanDepartment of Hematology,Jingzhou Central Hospital,Jingzhou 434020,ChinaCorresponding AuthorE-mail:Abstract:ObjectiveTo investigate the effect of CircBACH1 on proliferation,apoptosis and chemotherapy sensitivityof multiple myeloma(MM)cells and the regulatory mechanism on miR-140-5p/MDM2 axis during this process.MethodsBone marrow plasma cells were collected from the MM patient group and normal control group.Human MM cell line U266cells were divided into the untransfected group,the si-NC group,the si1-CircBACH1 group,the si2-CircBACH1 group,thesi-CircBACH1+anti-miR-NC group and the si-CircBACH1+anti-miR-140-5p group.The mRNA expressions ofCircBACH1,miR-140-5p and mouse double microsoma 2(MDM2)were detected by real-time quantitative PCR.Cellproliferation activity was detected by CCK-8 assay.Flow cytometry was used to detect apoptosis and sensitivity to基金项目：湖北省卫生计生委科研项目（WJ2019F125）作者单位：荆州市中心医院血液内科（邮编434020）作者简介：刘荟敏（1984），女，主治医师，主要从事白血病和骨髓造血干细胞方面研究。E-mail：通信作者E-mail：MaterBiolAppl，2019，104：109909.doi：10.1016/j.msec.2019.109909.16 JUNEJA T，PANDYA M D，SHAH S.Molecular Landscape andcomputational screening of the natural inhibitors against HPV16 E6oncoproteinJ.Asian Pac J Cancer Prev，2021，22（8）：2461-2469.doi：10.31557/APJCP.2021.22.8.2461.17 SHI S，MA B，SUN F，et al.Theaflavin binds to a druggable pocketof TMEM16A channel and inhibits lung adenocarcinoma cellviability J.J Biol Chem，2021，297（3）：101016.doi：10.1016/j.jbc.2021.101016.18 BUYUK B，JIN S，YE K.Epithelial-to-mesenchymal transitionsignaling pathways responsible for breast cancer metastasis J.CellMol Bioeng，2022，15（1）：1-13.doi：10.1007/s12195-021-00694-9.19 PENG J，WU H J，ZHANG H F，et al.miR-143-3p inhibitsproliferation and invasion of hepatocellular carcinoma cells byregulating its target gene FGF1J.Clin Transl Oncol，2021，23（3）：468-480.doi：10.1007/s12094-020-02440-5.20 NOGUCHI S，HIRANO K，TANIMOTO N，et al.SLUG isupregulated and induces epithelial mesenchymal transition incanine oral squamous cell carcinoma J.Vet Comp Oncol，2022，20（1）：134-141.doi：10.1111/vco.12755.（2023-02-17收稿2023-05-12修回）（本文编辑李国琪）细胞与分子生物学1170天津医药 2023 年 11 月第 51 卷第 11 期多发性骨髓瘤（MM）是一种血液系统恶性肿瘤，其特征是肿瘤性浆细胞的异常增殖和积累1。目前蛋白酶体抑制剂如硼替佐米已被广泛用于MM治疗，虽显著提高了MM患者的生存率，但由于耐药性及初始治疗后复发率较高，该病仍无法治愈2-3。研究MM的耐药机制和寻找新的治疗靶点对改善MM化疗敏感性具有重要意义。环状RNA BTB域名和CNC同系物1（CircBACH1）可作为miR-656-3p的海绵，提高纤溶酶原激活物抑制剂1 RNA结合蛋白1表达，加速肝癌进展4，但其在 MM 中的作用还未知。许多miRNA的异常表达与MM的发展有关，如miR-140-5p 在 MM 中表达下调，上调 miR-140-5p可通过靶向血管内皮生长因子A抑制MM细胞增殖，其也可以通过被Linc00515靶向上调抑制MM细胞的自噬和化学耐药性5-6。鼠双微体2（MDM2）是一种E3泛素连接酶，与白血病和淋巴瘤等血液系统恶性肿瘤的放化疗耐药相关，在MM中过表达，可增强MM细胞的增殖和存活能力7。研究显示，miR-140-3p 可以通过调节 KLF5/N-cadherin/MDM2/Slug轴促进多能间充质干细胞在椎间盘退变中的再生作用8，但CircBACH1、miR-140-5p与MDM2三者间的靶向关系尚不明确。本研究旨在分析CircBACH1对MM细胞增殖、凋亡和化疗敏感性的影响，以及对miR-140-5p/MDM2轴的靶向调节机制。1材料与方法1.1样本和细胞选取2021年1月2022年12月荆州市中心医院收治的未接受放化疗的18例MM患者（MM组）骨髓，其中男11例，女7例，年龄5075岁。同时抽取18例骨髓移植健康供者骨髓作为正常对照组，其中男10例，女8例，年龄4268岁。所有临床检验样本的采集均经受检者知情同意并获得医院伦理学委员会批准（批号：202001136）。人MM细胞系U266细胞购自于武汉普赛诺生命科技有限公司。1.2试剂与仪器EDTA.2K抗凝剂（上海源叶生物科技有限公司）；人全血单个核细胞分离液（Ficoll配制，上海吉至生化科技有限公司）；FITC标记抗人CD138抗体（艾美捷科技有限公司）；RNA提取试剂、一步法实时荧光定量PCR（qRT-PCR）试剂盒（南京诺唯赞生物科技股份有限公司）；All-in-OneTMmiRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit 和 All-in-OneTMmiRNA qPCR Kit（美 国 GeneCopoeia 公 司）；LipofectamineTM2000 转染试剂（北京百奥创新科技有限公司）；CCK-8细胞增殖检测试剂盒（上海雅吉生物科技有限公司）；Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒（武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司）；硼替佐米（正大天晴药业集团股份有 限 公 司，国 药 准 字 H20204018）；si1-CircBACH1、si2-CircBACH1及阴性对照（NC）、miR-140-5p mimic及NC、anti-miR-140-5p 及 NC、p-mirGLO-CircBACH1-WT、p-mirGLO-MDM2-WT及p-mirGLO-CircBACH1-MUT、p-mirGLO-MDM2-MUT质粒构建（上海吉凯基因公司）；qRT-PCR引物合成（上海生工生物工程股份有限公司）；B细胞淋巴因子2（Bcl-2）、Bcl-2 相 关 X 蛋 白（Bax）、裂 解 的 胱 天 蛋 白 酶（cleaved caspase）-3兔单克隆抗体（英国Abcam公司）；辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG二抗（沈阳万类生物科技有限公司）；MiniMACSTM磁珠细胞分选仪（德国Miltenyi公司）；SpectraMax iD5 多功能酶标仪（美谷分子仪器有限公司）；CFX96 Touch 实时荧光定量 PCR 仪（美国伯乐公司）；CytoFLEX流式细胞仪（美国贝克曼库尔特公司）。1.3研究方法1.3.1免疫磁珠分离骨髓液中 CD138+浆细胞取加入EDTA-K2抗凝剂的骨髓液3 mL，使用Ficoll分离液分离骨髓单个核细胞，然后利用CD138标记磁珠抗体进行孵育，并加入磁珠分选缓冲液，经过MACS磁珠分选器分离CD138+浆细胞，通过流式细胞术验证浆细胞。剩余细胞离心后，TRIzol法提取总RNA，并放置-20 保存，用于后续实验。1.3.2细胞培养将人MM细胞系U266细胞接种于含10%胎牛血清（FBS）和 1%双抗的 PMI-1640 培养基中，并置于37、5%CO2的培养箱中培养，待细胞汇合率生长至80%后bortezomib.The expression levels of B-cell lymphofactor 2(Bcl-2),Bcl-2 associated X protein(Bax)and cleaved caspase-3 were detected by Western blot assay.Dual luciferase reporter gene assay was used to verify the targeting relationship ofCircBACH1,miR-140-5p and MDM2.ResultsCompared with the normal control group,the mRNA expression levels ofCircBACH1 and MDM2 were increased in bone marrow plasma cells and U266 cells in the MM group,while the expressionof miR-140-5p was decreased(P0.05).Compared with the control group and the si-NC group,the mRNA expression ofCircBACH1 and MDM2,cell proliferation activity and Bcl-2 protein expression were decreased in the transfected si-CircBACH1 group.The expression of miR-140-5p,cell apoptosis rate,chemotherapy sensitivity,cleaved caspase-3 andBax expressions were increased(P0.05).In the anti-miR-140-5p supplementation experiment,the effect of si-CircBACH1 on MM cells was reversed,and the expression of MDM2 was increased(P0.05).Dual luciferase gene reportingexperiment verified the targeting relationship between CircBACH1 and MDM2 and miR-140-5p.ConclusionKnock downof CircBACH1 can up-regulate the expression of miR-140-5p,down-regulate the expression of MDM2,inhibit theproliferation of MM cells,promote the apoptosis of MM cells and improve the chemosensitivity.Key words:multiple myeloma;cell proliferation;apoptosis;CircBACH1;miR-140-5p;mouse double minute 2;chemosensitivity1171Tianjin Med J,November 2023,Vol.51 No.11进行传代。1.3.3qRT-PCR 检 测 细 胞 中 CircBACH1、miR-140-5p、MDM2 mRNA的表达分别收集MM组和正常对照组的浆细胞以及U266细胞，用TRIzol法提取总RNA。miRNA逆转录试 剂 盒（All-in-One miRNA First-Strand cDNA SynthesisKit）进行逆转录，生成 miRNA 对应的 cDNA 第一链，再以cDNA 为模板使用 miRNA qPCR 定量试剂盒（All-in-OnemiRNA qPCR Kit）对 miR-140-5p 进行定量，随后以总 RNA为模板，按照一步法qRT-PCR试剂盒对CircBACH1和MDM2进行定量。qRT-PCR反应体系：2One Step SYBR Green Mix10 L，Enzyme 1 L，上下游引物各 0.5 L，RNA 1 L，补ddH2O 至总体积20 L。反应程序：95 预变性30 s；二步法，95 变性10 s，60 退火30 s，40个循环。CircBACH1、MDM2 以 GAPDH 为内参，miR-140-5p 以 U6 为内参，采用2-Ct法计算细胞中 CircBACH1、miR-140-5p、MDM2 mRNA的相对表达量，引物序列见表1。所有实验均重复3次。1.3.4细胞转染和分组先构建两个靶向 CircBACH1 的siRNA 质 粒，分 别 为 siRNA1-CircBACH1 和 siRNA2-CircBACH1，将两个不同敲低位点的质粒利用Lipofectamine2000转染试剂转染至U266细胞中，记为si1-CircBACH1组和si2-CircBACH1组，同时以未转染（Control组）和转染空载体（si-NC组）作为阴性对照。然后通过qRT-PCR检测各组CircBACH1 的表达来确定最优敲低位点，并在转染 si-CircBACH1 的 基 础 上 进 行 回 补 实 验，将 细 胞 分 为 si-CircBACH1+anti-miR-NC 组（共转染 si-CircBACH1 和 anti-miR-NC）和 si-CircBACH1+anti-miR-140-5p 组（共转染 si-CircBACH1和anti-miR-140-5p），转染48 h后收集各组细胞分别提取RNA和蛋白，并按照1.3.3的方法检测各转染组细胞中CircBACH1、miR-140-5p、MDM2 mRNA的表达。1.3.5CCK-8法检测细胞增殖活性将转染48 h后的细胞以1103个/孔接种至96孔板中，加入100 L PMI-1640培养基并置于37、5%CO2培养箱中培养48 h，然后在每孔中加入10 L的CCK-8溶液继续培养4 h，用酶标仪检测450 nm波长处的光密度（OD）值，并计算细胞存活率，细胞存活率（%）=（OD实验组-OD空白组）/（OD对照组-OD空白组）100%。1.3.6流式细胞术检测细胞凋亡及化疗敏感性凋亡检测：将转染48 h后的各组细胞接种至6孔板中（1104个/孔），加入普通培养基培养48 h后，重悬细胞，4，300g离心5 min收集细胞。然后分别加入5 L Annexin V-FITC和10 L PI，室温避光孵育15 min。化疗敏感性检测：另取转染48 h后的各组细胞接种至6孔板，加入含有20 nmol/L硼替佐米的培养液培养24 h11，然后收集细胞，其余步骤同上，用流式细胞仪分别检测加入硼替佐米前后的细胞凋亡情况。1.3.7Western blot检测细胞中Bax、Bcl-2、cleaved caspase-3蛋白的表达收集转染后神经元并用PBS清洗，加入RIPA裂解液提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。然后将蛋白样品经SDS-PAGE凝胶电泳后转移到PVDF膜中。将膜用5%脱脂奶粉室温孵育1 h，然后加入Bax、Bcl-2、cleaved caspase-3兔单克隆抗体稀释液（1 2 000）在4 下孵育过夜，再加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG二抗稀释液（1 500）在室温下孵育1 h，用ECL发光试剂显色，用凝胶成像仪成像，以GAPDH为内参，用Image J软件分析并计算蛋白表达量。1.3.8双 萤 光 素 酶 报 告 基 因 实 验 验 证 miR-140-5p 与CircBACH1、MDM2之间的靶向关系先通过ENCORI（https:/）进行生物信息预测 miR-140-5p 在CircBACH1、MDM2 的 3UTR 上的结合位点。然后利用pmirR-GLO 载体分别构建野生型质粒 CircBACH1-WT、MDM2-WT和突变型质粒CircBACH1-MUT、MDM2-MUT，再将野生型和突变型质粒分别与 miR-140-5p mimic 或 miR-140-5p mimic-NC共转染细胞，48 h后用双萤光素酶活性检测试剂盒检测萤光素酶活性。1.4统计学方法采用Graphpad prism 8.0分析数据。计量资料以xs表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用Tukey s检验。P0.05为差异有统计学意义。2结果2.1CircBACH1、miR-140-5p、MDM2 mRNA 在细胞中表达水平比较与正常对照组相比，MM组的骨 髓 浆 细 胞 及 U266 细 胞 中 CircBACH1、MDM2mRNA表达升高，miR-140-5p表达降低（P0.05），见表2。2.2不同位点敲低细胞中CircBACH1的表达水平比较Control组、si-NC组、si1-CircBACH1组和si2-CircBACH1 组细胞 CircBACH1 表达水平分别为0.990.04、0.980.05、0.430.02和0.560.03，组间比较差异有统计学意义（n=3，F=184.148，P0.01）；与Tab.2Comparison of mRNA expression levels ofCircBACH1,miR-140-5p and MDM2between three groups表2各组CircBACH1、miR-140-5p、MDM2 mRNA表达水平比较（n=18，xs）P0.01；a与正常对照组比较，P0.05。组别正常对照组MM组U266细胞FCircBACH11.020.071.970.15a2.010.12a405.689miR-140-5p0.980.060.370.03a0.340.03a1304.333MDM20.960.051.610.11a1.680.10a346.024Tab.1qRT-PCR primers表1qRT-PCR引物基因名称CircBACH1MDM2GAPDHmiR-140-5pU6引物序列（53）上游：GCTGTCGCAAGAGAAAACTTGA下游：AAACTCCACACATTTGCACACT上游：CAGTAGCAGTGAATCTACAGGGA下游：CTGATCCAACCAATCACCTGAAT上游：CAGAACATCATCCCTGCCTCTAC下游：TTGAAGTCAGAGGAGACCACCTG上游：CAGTGGTTTTACCCTA下游：GTGCAGGGTCCGAGGT上游：CTCGCTTCGGCAGCACA下游：AACGCTTCACGAATTTGCG产物大小/bp198139216142891172天津医药 2023 年 11 月第 51 卷第 11 期Control组和si-NC组相比，si1-CircBACH1组和si2-CircBACH1 组细胞中 CircBACH1 的表达水平均降低，且si1-CircBACH1组中CircBACH1的表达水平低于si2-CircBACH1组（P0.05），选用效率更高的si1-CircBACH1进行后续实验。2.3各转染组细胞中 CircBACH1、miR-140-5p、MDM2 mRNA 的表达与 Control 组和 si-NC 组相比，si-CircBACH1组CircBACH1、MDM2 mRNA表达降 低，miR-140-5p 表 达 升 高（P0.05）；与 si-CircBACH1+anti-miR-NC 组 相 比，si-CircBACH1+anti-miR-140-5p组CircBACH1表达差异无统计学意义，miR-140-5p表达降低，MDM2 mRNA表达升高（P0.05），见表3。2.4细胞增殖活性比较Control组、si-NC组、si-CircBACH1组、si-CircBACH1+anti-miR-NC组和si-CircBACH1+anti-miR-140-5p组细胞增殖活性（%）分别为 82.656.57、80.196.24、31.184.24、32.674.47、63.485.12，组间比较差异有统计学意义（n=3，F=63.860，P0.01）；与 Control 组和 si-NC 组相比，si-CircBACH1 组细胞增殖活性降低（P0.05）；与si-CircBACH1 组和 si-CircBACH1+anti-miR-NC 组相比，si-CircBACH1+anti-miR-140-5p 组细胞增殖活性升高（P0.05）。2.5敲低 CircBACH1 对细胞凋亡的影响Control组、si-NC组、si-CircBACH1组、si-CircBACH1+anti-miR-NC 组和si-CircBACH1+anti-miR-140-5p组细胞凋亡率（%）分别为28.961.37、29.121.41、65.692.17、66.782.25 和 43.821.87，组间比较差异有统计学意义（n=3，F=305.487，P0.01）；与Control组和si-NC 组相比，si-CircBACH1 组细胞凋亡率增加（P0.05）；与 si-CircBACH1 组 和 si-CircBACH1+anti-miR-NC组相比，si-CircBACH1+anti-miR-140-5p组细胞凋亡率降低（P0.05），见图1。2.6敲 低 CircBACH1 对 细 胞 化 疗 敏 感 性 的 影响见图2。加入硼替佐米后，Control组、si-NC组、si-CircBACH1组、si-CircBACH1+anti-miR-NC组和si-CircBACH1+anti-miR-140-5p组细胞凋亡率（%）分别51.182.73、52.292.62、84.744.68、83.374.35和69.251.08，组间比较差异有统计学意义（n=3，F=102103104101102103104101PIAnnexin V-FITC100100Control组102103104101102103104101PIAnnexin V-FITC100100si-NC组102103104101102103104101PIAnnexin V-FITCsi-CircBACH1组100100102103104101102103104101PIAnnexin V-FITC100100si-CircBACH1+anti-miR-NC组102103104101102103104101PIAnnexin V-FITC100100si-CircBACH1+anti-miR-140-5p组Fig.2The apoptosis of cells in each group after adding bortezomib detected by flow cytometry图2流式细胞术检测加入硼替佐米后各组细胞的凋亡率102103104101102103104101PIAnnexin V-FITCControl组100100102103104101102103104101PIAnnexin V-FITCsi-NC组100100102103104101102103104101PIAnnexin V-FITCsi-CircBACH1组100100102103104101102103104101PIAnnexin V-FITCsi-CircBACH1+anti-miR-NC组100100102103104101102103104101PIAnnexin V-FITCsi-CircBACH1+anti-miR-140-5p组100100Fig.1Apoptosis of cells in each group detected by flow cytometry图1流式细胞术检测各组细胞的凋亡率Tab.3Comparison of mRNA expression levels ofCircBACH1,miR-140-5p and MDM2 between fivegroups of cells表3各转染组细胞中CircBACH1、miR-140-5p、MDM2mRNA表达水平比较（n=3，xs）组别Control组si-NC组si-CircBACH1组si-CircBACH1+anti-miR-NC组si-CircBACH1+anti-miR-140-5p组FCircBACH11.000.000.980.050.460.03ab0.440.020.460.03276.128miR-140-5p1.000.001.020.051.930.13ab1.910.141.320.08c69.823MDM21.000.001.010.060.390.02ab0.410.030.770.05c187.459P0.01；a与 Control 组 比 较，b与 si-NC 组 比 较，c与 si-CircBACH1+anti-miR-NC组比较，P0.05；表4同。1173Tianjin Med J,November 2023,Vol.51 No.1169.638，P0.01）；与Control 组和si-NC 组相比，si-CircBACH1 组细胞凋亡率升高（P0.05），敲低CircBACH1表达后细胞对硼替佐米的化疗敏感性升高；与si-CircBACH1组和si-CircBACH1+anti-miR-NC组相比，si-CircBACH1+anti-miR-140-5p组细胞凋亡率明显降低（P0.05），敲低CircBACH1表达的同时抑制miR-140-5p表达，细胞对硼替佐米的化疗敏感性降低。2.7敲低 CircBACH1 对细胞凋亡相关蛋白的影响与Control组和si-NC组相比，si-CircBACH1组细胞中Bcl-2蛋白表达降低，Bax、cleaved caspase-3蛋白表达升高（P0.05）；与 si-CircBACH1+anti-miR-NC 组 相 比，si-CircBACH1+anti-miR-140-5p组细胞中Bcl-2蛋白表达升高，Bax、cleaved caspase-3蛋白表达降低（P0.05），见图3、表4。2.8CircBACH1、miR-140-5p和MDM2之间的靶向关 系ENCORI 分 析 结 果 显 示，miR-140-5p 与CircBACH1、MDM2 均存在靶向结合位点，见图 4。双 萤 光 素 酶 报 告 基 因 实 验 结 果 发 现，转 染CircBACH1-WT或MDM2-WT后，共转染miR-140-5p mimic 的细胞相对萤光素酶活性低于共转染miR-140-5p mimic-NC 的细胞（0.420.03 vs.1.020.07，t=13.650；0.430.02 vs.1.000.07，t=19.810；n=3，P0.05），而 转 染 CircBACH1-MUT 或 MDM2-MUT后，共转染miR-140-5p mimic的细胞与共转染miR-140-5p mimic-NC的细胞相对萤光素酶活性差异无统计学意义（0.990.05 vs.0.970.05，t=0.490；1.020.06 vs.1.010.07，t=0.188；n=3，P0.05）。3讨论MM是一种无法治愈的浆细胞恶性肿瘤，患者表现出非特异性症状，如疲劳、贫血和骨痛。在确诊MM时，患者一般处于肿瘤晚期，其病因难以评估，对其发病机制的深入了解非常重要9。目前的治疗方法主要基于使用蛋白酶体抑制剂、双膦酸盐、皮质类固醇、免疫抑制剂和外周血干细胞移植，但目前的治疗方法对部分患者仍然无效，生存率较低10。CircRNA是一类具有共价闭环结构的非编码RNA，已被揭示与多种肿瘤的进展有关，包括 MM11-12。CircPSAP通过充当miR-331-3p海绵来调节组蛋白去乙酰化酶4（HDAC4）表达来调节人MM细胞的增殖、凋亡和对硼替佐米的敏感性13，CircBACH1可以通过靶向let-7a-5p调节环磷腺苷效应元件结合蛋白5，增强结直肠癌细胞的增殖和转移14。本研究结果显示，CircBACH1在MM患者的浆细胞和U266细胞中的表达高于正常对照组，表明CircBACH1可能参与 MM 的发展过程。因此，本研究进行了CircBACH1敲低实验，结果显示，转染si-CircBACH1后细胞中CircBACH1的表达和细胞的增殖活性降低，细胞凋亡率和对硼替佐米的敏感性升高，且细胞中凋亡相关蛋白cleaved caspase-3、Bax表达升高，Bcl-2表达降低，提示敲低CircBACH1能够抑制MM细胞的增殖，促进细胞凋亡并提高对化疗的敏感性，从而提升MM的治疗效果，抑制其发展。CircRNA可以通过充当miRNA海绵来调节基因转录和翻译，从而与某些miRNA结合，影响细胞发育、凋亡、增殖和其他生物活性。circ_0058058可以充当 miR-338-3p 的海绵上调自噬相关蛋白 14（ATG14）表达以促进MM细胞生长和转移15。Wu等16研究发现了MM发病机制中的miRNAs网络：miR-145-3p通过靶向HDAC4 mRNA起作用，从而增强MM细胞自噬、凋亡以及硼替佐米的抗MM活Fig.3Bcl-2,Bax,cleaved caspase-3 protein expression in each group图3各组细胞中Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3蛋白表达情况Bcl-2Baxcleaved caspase?3GAPDHControlsi-NCsi-CircBACH1si-CircBACH1+anti-miR-NCsi-CircBACH1+anti-miR-140-5pBcl-2Baxcleaved caspase-3GAPDHABCDEA：Control组；B：si-NC组；C：si-CircBACH1组；D：si-CircBACH1+anti-miR-NC组；E：si-CircBACH1+anti-miR-140-5p组。Tab.4Comparison of expression levels of Bcl-2,Bax,andcleaved caspase-3 between five groups of cells表4各组细胞中Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3蛋白表达水平比较（n=3，xs）组别Control组si-NC组si-CircBACH1组si-CircBACH1+anti-miR-NC组si-CircBACH1+anti-miR-140-5p组FBcl-21.020.051.010.050.410.02ab0.420.020.720.04c182.493Bax0.970.040.950.041.520.06ab1.510.061.210.05c89.791cleaved caspase-30.920.040.930.051.440.06ab1.450.071.170.05c67.2225-UAACAAUGCAAUA