24种食用植物酵素功能成分分析与生物活性初步研究.pdf

62JOURNALOSCIENCEANDVol.42lssue82023研究论文24种食用植物酵素功能成分分析与生物活性初步研究靳素媛，耿燕，周琦，品吕琪琪，曹刚刚？，贾友彬？，李李宣衡？，史劲松！（1.江南大学药学院，江苏无锡2 14 12 2；2.安徽养生天下生物科技有限公司，安徽亳州2 3 6 8 3 1）摘要：为探究2 4 种食用植物酵素的功能成分及生物活性，作者采用分光光度法对不同药材果蔬复合发酵产品的总黄酮和总多酚质量浓度进行了测定，利用超高效液相色谱检测了酵素产品中的6 种有机酸。通过测定菌液OD值评价酵素对金黄色葡萄球菌生长的影响，并比较了不同酵素产品对人肝癌细胞HepC2的生长抑制作用。结果表明，2 4 种酵素产品中枸杞酵素的总黄酮质量浓度最高，玫瑰酵素和丁香酵素的总多酚质量浓度显著高于其他酵素产品的质量浓度。不同酵素产品所含的有机酸种类大致相同，但不同有机酸的质量浓度差异比较大，其中余甘子酵素的总酸质量浓度最高。2 4 种酵素对金黄色葡萄球菌的生长均有较强的抑制作用，对人肝癌细胞HepG2的生长也表现出一定的抑制作用。作者比较了2 4 种酵素产品中多酚、黄酮和有机酸的质量浓度以及其生物活性，为功能性酵素产品的后续研发提供理论依据。关键词：酵素：超高效液相色谱；有机酸；抑菌；抗肿瘤中图分类号：TS2522文章编号：16 7 3-16 8 9（2 0 2 3）0 8-0 0 6 2-0 6 DDOl:10.3969/j.issn.1673-1689.2023.08.008Analysis of Functional Components of 24 Fermented Juice of Edible Plant andPreliminary Study on Their Biological ActivitiesJINSuyuan,GENG Yan*I,ZHOUQil,LYUQiqil,CAOGanggang,JIAYoubin,LLI Xuanheng,SHI Jinsongl(1.School of Pharmacy,Jiangnan University,Wuxi 214122,China;2.Anhui Yangsheng Tianxia BiotechnologyCo.,Ltd.,Bozhou 236831,China)Abstract:To investigate the functional components and biological activities of 24 fermented juiceof edible plants,the contents of total flavonoids and total polyphenols were determined by UV/Visspectrophotometry,and 6 organic acids in the fermented juice were determined by Ultra PerformanceLiquid Chromatography(UPLC).The optical density(OD)value was measured to evaluate the effectof fermented juice on the growth of Staphylococcus aureus,and compared the inhibitory effects of thefermented juice on the cell growth of human liver cancer cell line Hep G2.The results showed thatthe total flavonoid content in Lycium barbarum fermented juice was the highest among the 24fermented juice.The total polyphenol content of Rosa rugosa fermented juice and Syzygiumaromaticum fermented juice was significantly higher than that of others.The types of organic acids收稿日期：2 0 2 1-0 8-17基金项目：国家自然科学基金项目（3 197 0 7 4 6）：江苏高校 青蓝工程 资助项目*通信作者：耿燕（198 4 一）.女，博士，教授，硕士研究生导师，主要从事分子营养研究。E-mail：g e n g y a n j i a n g n a n.e d u.c n63会品5 生物技术学报2 0 2 3 年第4 2 卷第8 期靳素媛，等中食用植物酵素功能成分分析与生物活性初步研究研究论文contained in different fermented juice were similar,but their content was quite different.Amongthem,the total acid content of Phyllanthus emblica fermented juice was the highest.All the 24fermented juice had strong inhibitory effects on the growth of Staphylococcus aureus,and had aninhibitory effect on the growth of Hep G2 cells.In conclusion,the contents of polyphenols,flavonoids,organic acids and biological activities of the 24 kinds of fermented juice were compared,which provided direction for further research and development of functional fermented juiceproducts.Keywords:fermented juice,ultra performance liquid chromatography,organic acids,bacteriostatic,anti-tumor酵素是一种通过微生物发酵动、植物或菌类而成的功能型发酵产品。我国标准酵素产品分类导则（QB/T5324）界定的食用植物酵素是“以可用于食品加工的植物为主要原料，添加或不添加辅料，经微生物发酵制得的含有特定生物活性成分可供人类食用的酵素产品。酵素起源于日本，始于2 0世纪初，现流行于日本、中国台湾、欧洲等地，一般以乳酸菌、酵母菌、醋酸菌等益生菌协同作用于果蔬、食用菌、药食同源植物2。现代药理学研究表明其具有抗氧化13 、调节免疫4 、润肠通便 5-6 、保健护肝 7 等功能。果蔬和药材经过微生物发酵后含有丰富的生物活性物质，其中多酚和黄酮这类天然的抗氧化活性物质是酵素产品发挥抗氧化作用的关键物质8 9。众多研究表明，酵素产品含有丰富的多酚类和黄酮类化合物。发酵过程中经醋酸菌和乳酸菌等的代谢产生的有机酸，能够增加发酵产品浓厚的风味和酸爽的口感，因此发酵液中的有机酸种类和相对含量是决定产品风味和品质的重要因素。微生物发酵产生的某些的抑菌成分，在抑制有害微生物防止腐败等方面具有重要作用。研究显示酵素对一些常见有害微生物如金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌具有较好的抑制作用I-I21。此外，研究发现果蔬中药发酵液能够降低癌症的患病率，抑制癌细胞的生长。吴胜莲等和刘阿文的研究结果均表明发酵液对某些癌细胞表现出了较好抑制效果113-14 。作者对2 4 种酵素产品中的部分功能成分及其生物活性进行了探究，测定了酵素产品总黄酮和总多酚的质量浓度，然后利用超高效液相色谱进行检测，确定了产品中的草酸、乳酸、琥珀酸、苹果酸、乙酸、丙酸6 种有机酸的质量浓度。作者选择常见的食源性致病菌金黄色葡萄球菌对酵素产品的抑菌活性进行了初步研究，并采用CCK-8法测定细胞活性，通过比较酵素产品对人肝癌细胞HepG2生长抑制作用探究其抗肿瘤活性。本研究结果为后续产品开发提供了理论依据材料与方法1.1材料与试剂发酵原料：枸杞、黄精、槐花、荷叶、金银花、蒲公英、鱼腥草、玫瑰、小茴香、广藿香、紫苏、马齿苋、余甘子、桑叶、红枣、乌梅、丁香、桔梗、花椒、佛手、白扁豆、白芷、砂仁共2 4 种。亚硝酸钠、硝酸铝、氯化钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钠、氯化钾、氢氧化钠、硫酸亚铁、酒石酸钾钠：购于国药集团化学试剂有限公司；儿茶酚标准品：购于美国sigma公司；芦丁标准品：购于生工生物工程（上海）股份有限公司；无水草酸、琥珀酸（丁二酸）、DL-苹果酸、DL-乳酸、冰乙酸、丙酸：购于上海麦克林生化科技有限公司；DMEM高糖培养基、胎牛血清：购于美国GibcoInvitrogen公司；胰蛋白酶、青霉素-链霉素、CCK-8(CellCountingKit)试剂盒：购于上海碧云天生物技术有限公司1.2仪器与设备酶标仪：Tecan公司产品；电子天秤、FE20pH计：梅特勒-托利多国际有限公司产品；AQ-C18色谱柱（1.9m，2.1mmx 15 0 mm）：沃特世科技（上海）有限公司产品；超高效液相色谱仪NexeraUHPLCLC-30A：日本岛津株式会社产品；电热恒温培养箱：上海精宏实验设备有限公司产品；DK-8D三温三控水槽：上海博迅实业有限公司医疗设备厂产品；二氧化碳恒温细胞培养箱：美国ThermoFisher公司产品64JOURNALOFSCIENGEANDVol.42lssue82023ActivitiesEdiblePlantandPreliminaryStudyonTheirBiologicalAREEARCHJiN Suyuan,etal:Analysisof Functional Components of 24 Fermented Juice of1.3酵素产品制备方法将原料进行预处理（浆果类直接进行打浆处理，根茎类等药材按质量比1:2 加水浸泡后打浆）后配料装罐，每立方米发酵罐加入原料（以干制计）120kg，加人质量分数10%的红糖，然后接种体积分数5%酵母菌液后密闭常温发酵15 0 d，然后过滤除渣制得酵素初液；向所述蔬菜、水果酵素初液中添加质量分数10%醋酸菌液，打开密闭容器，常温发酵5 0 7 0 d，每周搅拌1次，至乙醇体积分数低于0.5%然后过滤除渣制得酵素1.4实验方法1.4.1总黄酮质量浓度的测定采用NaNO2-Al(NO3)-NaOH比色法15)测定总黄酮质量浓度。黄酮类化合物是一类具有苯并吡喃环结构的天然化合物的总称，能在碱性条件下与铝离子反应生成红色络合物，该物质在5 10 nm波长处有最大吸收。利用硝酸铝作为测定黄酮类化合物的显色剂，通过在510nm波长处测定样品的吸光度，与芦丁标准品比较，对样品中总黄酮质量浓度进行测定。以芦丁标准液的质量浓度(mg/mL)为横坐标，吸光度(A）为纵坐标，得到的标准曲线方程为：y=1.4962x+0.0014，标准曲线的相关系数R?=0.999。在96 孔板中加入200L待测样品溶液，用酶标仪在5 10 nm波长处测定吸光度，每组样品做3 次平行，然后根据芦丁标准曲线得出酵素样品中总黄酮的质量浓度（mg/mL）1.4.2总多酚质量浓度的测定采用酒石酸亚铁法 6 测定总多酚质量浓度。多酚是一类结构中带有多个酚羟基的化合物的总称，能与酒石酸亚铁产生络合反应，生成稳定的深紫色络合物，该物质在540nm波长处有最大吸收。通过在5 4 0 nm波长处测定样品的吸光度，并与儿茶酚标准品比较，对样品中总多酚质量浓度进行定量测定。以儿茶酚标准液的质量浓度（mg/mL)为横坐标，吸光度(A）为纵坐标，通过测定得到的标准曲线方程为：y=0.1966x+0.0073，标准曲线的相关系数R2=0.997。每组样品做3 次平行，根据儿茶酚标准曲线计算出样品中总多酚的质量浓度(mg/mL)。1.4.3有机酸质量浓度的测定取酵素样品1.5 mL，经0.2 2 m滤膜过滤处理后，装入标记好的进样瓶备用。色谱分离柱：沃特世公司AQ-C18色谱柱(1.9m，2.1mmx 15 0 mm）；流动相A：乙睛；流动相B:20mmol/LpH2.2的磷酸盐缓冲液；柱温：4 0；流量0.5 mL/min；进样量为10 L；检测波长：210nm。根据相应标准品标准曲线计算有机酸的质量浓度(mg/mL)。1.4.4体外抑菌活性分析取酵素样品，经无菌0.22m微孔滤膜过滤处理后，装人标记好的灭菌管中，按5%的接种体积分数将金黄色葡萄球菌液接种于酵素样品中，每个样品设置3 组平行实验作为实验组；按同样比例将金黄色葡萄球菌液接种于LB培养基中作为对照组。3 7 恒温培养，分别测定实验组和对照组的0 h和2 4 h的OD600，以对照组的抑制率为0，通过计算对比实验组对金黄色葡萄球菌的生长的抑制率，对不同药材果蔬发酵产品的抑菌活性做出初步评价1.4.5体外抗肿瘤活性分析采用CCK-8法检测细胞存活率 7。用胰酶消化贴壁生长的人肝癌细胞(HepG2），细胞计数调整其浓度为5 x104个/mL的细胞悬液。取96 孔板，每孔加人10 0 L细胞悬液，即按5 0 0 0 个细胞/孔铺板，边缘孔用无菌DPBS填充，然后置于含体积分数5%CO2的3 7 培养箱中培养。细胞铺板培养12 h后，弃去细胞培养液，空白组加入2 0 0 L细胞培养液，实验组加人2 0 0 L按照1:10 0 0 比例稀释的含药（酵素样品）培养液，每组设6 个副孔。加药培养2 4 h后，每孔加人10 LCCK-8试剂，在避光条件下将孔板置于含体积分数5%CO,的3 7 培养箱中孵育2 h，用酶标仪检测450nm波长处的吸光度1.5数据统计分析使用GraphPadPrism软件进行单因素方差分析（ANOVA）和Duncans多重比较差异显著性检验，数据表示为平均值标准差（Mean+SD），*P0.05）。图5 2 4 种酵素的抗肿瘤活性评价Fig.5Anti-tumor activity of 24 different fermented juice3结语实验结果表明，在2 4 种酵素产品中含有生物活性物质种类众多，成分复杂，除了含有黄酮类化合物和多酚类化合物，还含有多种有机酸类。这些活性成分的种类和含量与酵素产品的功效密切相关。枸杞酵素和玫瑰酵素分别是总黄酮和总多酚质量分数最高的酵素产品。不同酵素产品所含的有机67品与生物技术学报2023年第4 2 卷第8 期靳素媛，等种食用植物酵素功能成分分析与生物活性初步研究研究论文酸种类大致相同，但不同有机酸的质量分数差异比较大，余甘子酵素的质量分数是2 4 种酵素产品中最高的。由于发酵起始原料的物质成分和质量分数不同，所得酵素产品在生物活性物质质量分数和种类上也存在不少区别。这2 4 种酵素产品对金黄色葡萄球菌生长均有显著的抑制作用，其中黄精酵素和白扁豆酵素对金黄色葡萄球菌生长抑制作用的最大，抑制率分别为94.5%和96.3%。体外抗肿瘤活性评价结果显示，沙棘酵素、槐花酵素、丁香酵素、广藿香酵素和桔梗酵素这5 种酵素产品对人肝癌细胞的生长影响较大，其抑制率高于2 0.0%。本研究结果为新型功能性酵素产品的研发提供了一定的理论依据，能够为抗衰老和抗癌保健品的研发提供新思路。参考文献：【1 中华人民共和国工业和信息化部.酵素产品分类导则：QB/T5324-2018S.北京：中国轻工业出版社，2 0 18.【2 许蓬娟，李悠悠，孙梓翔.酵素在生物作用中的研究进展 .食品与发酵科技,2 0 17,5 3(1)：8 3-8 5+97.【3 樊秋元，朱丹，牛广财，等.黑加仑酵素有机酸分析及其体外抗氧化性能研究 .中国酿造，2 0 19,3 8(5)：15 9-16 3.【4 张瑞雪，方磊，刘艳，等.三种果蔬发酵液抗氧化和免疫调节功能研究 .粮油食品科技，2 0 19,2 7(2)：3 9-4 4.【5 张艾青.苹果酵素复合型羊乳的制备及抗氧化活性研究 J.食品与生物技术学报,2 0 2 1,4 0(6):10 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