基因诊疗和基因治疗专家讲座.pptx

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,第十八章,基因诊疗与基因治疗,(gene diagnosis and therapy),1,基因诊疗和基因治疗,第1页,本章讨论二大方面内容,基因诊疗,基因治疗,2,基因诊疗和基因治疗,第2页,一.基因诊疗,概念,：,利用当代分子生物学和分子遗传学技术方法，,直接检测基因结构及其表示水平是否异常,，从而对疾病作出诊疗方法。,第一节 基 因 诊 断,3,基因诊疗和基因治疗,第3页,二.基因诊疗,特点,：,针对性强，特异性高,检测灵敏度和准确性高,实用性强，诊疗范围广,4,基因诊疗和基因治疗,第4页,三.基因诊疗惯用技术方法,核酸分子杂交技术,聚合酶链反应（PCR）技术,生物芯片,基因测序,5,基因诊疗和基因治疗,第5页,（一）核酸分子杂交技术,核酸分子杂交,是指单链核酸分子（DNA或RNA）在特定条件下，与另一条互补特异核酸链形成稳定双链过程。,主要依据：,碱基互补、变性和复性,DNA与DNA杂交：,A=T、GC;,DNA与,RNA杂交:,A=U、,GC;,变性：,在一定温度下，使核酸双链解开为两条单链；,复性：,随温度逐步恢复，变性两条单链重新形成互补双链,碱基互补,6,基因诊疗和基因治疗,第6页,hybridization,DNA:DNA 5 A T G C C G A T,3,T,A C G G C,DNA:RNA 5 A T G C G T A,3,U,A C G C A U,RNA:RNA 5 A U G C U A C G,3,U,A C G A U G C,7,基因诊疗和基因治疗,第7页,利用核酸双链,碱基互补、变性和复性,原理，能够,用已知碱基序列单链核酸片段,作为,探针,，与待测样本中单链核酸互补配对，以判断有没有互补同源核酸序列存在。,核酸探针,是指带有标识某一特定DNA或RNA片断，能与待测样本中单链核酸分子互补配对结合，进而检测同源序列。,探针标识物,有,放射性核素,或,非放射性核素,（生物素、地高辛、荧光素等）两大类。,8,基因诊疗和基因治疗,第8页,1.核酸分子杂交分类,液相杂交,：,待测核酸样本与特异性探针同时溶于杂交液中进行杂交反应；,固相杂交,：,待测核酸样本先结合到固相支持物上，再与溶液中特异性探针进行杂交反应。,惯用固相杂交支持物：,硝酸纤维素膜、尼龙膜等,9,基因诊疗和基因治疗,第9页,2.核酸分子杂交（固相杂交）操作程序,制备待测核酸样品,分离、变性、转移、固化DNA片段,杂交,加入标识核酸探针,检测杂交信号,标识核酸探针,预杂交,制备核酸探针,漂洗去除未参加杂交标识探针,10,基因诊疗和基因治疗,第10页,3.惯用固相核酸杂交方法,Southern 印迹杂交法,（Southern blotting）,Northern 印迹杂交法,（Northern blotting）,斑点杂交或狭缝杂交法,（Spot/Slot blot hybridization）,菌落杂交,（colony hybridization）,夹心杂交法（sanwich hybridization）,原位杂交,（nucleic acid hybridization in situ）,11,基因诊疗和基因治疗,第11页,(1)Southern 印迹杂交法,（,Southern blotting,）,限制性内切酶酶切,检测杂交信号,提取DNA,Southern 法可用于检测特异DNA序列片断、基因定位、分子量测定等。,12,基因诊疗和基因治疗,第12页,（2）Northern 印迹杂交法,（Northern blotting）,（其基本过程类似于上述Southern法）,提取RNA样本RNA变性琼脂糖凝胶电泳分离转移至膜探针（标识DNA或RNA）与之杂交显影或显色检测信号。,Northern法可用于检测组织细胞中总RNA或mRNA,13,基因诊疗和基因治疗,第13页,（3）斑点杂交或狭缝杂交法：,基本过程：,将变性DNA或RNA直接点到固相支持滤膜上用标识探针与之杂交自显影或显色反应检测杂交信号分析结果。,优点：,简便、快速、灵敏、样本用量少；,缺点：,特异性不高，有一定百分比假阳性。,14,基因诊疗和基因治疗,第14页,（4）菌落杂交,（colony hybridization）,该法可从大量细菌中筛选含特异DNA序列及基因工程重组体。,15,基因诊疗和基因治疗,第15页,（5）夹心杂交法,（sanwich hybridization）,A,B,RE,RE,A,B,A,B,固相支持物,片段B捕捉探针,片断A 检测探针,本法优点：,特异性强，对样本纯度要求不高，定量较准确。,16,基因诊疗和基因治疗,第16页,（6）原位杂交,（nucleic acid hybridization in situ）,将标识探针与细胞或组织切片中核酸进行杂交，进而检测特异DNA或RNA序列。,细胞原位杂交,组织切片原位杂交,DNA-DNA,RNA-DNA,三类杂交,RNA-RNA,该法优点：,不需提取核酸，,故可完整保持组织或细胞形态，因而更能准确地反应组织细胞功效状态。,有,17,基因诊疗和基因治疗,第17页,（二）聚合酶链反应(,PCR，,polymerase chain reaction,)技术,PCR是体外基因扩增技术。它利用体内DNA复制原理和DNA变性与复性性质进行目标基因DNA大量扩增。,1.,PCR基本原理：,PCR技术,在模板、dNTP、Mg,2+,等条件下，用耐热Taq酶代替,DNA聚合酶,，用合成DNA引物代替RNA,引物,，经过DNA变性、,引物与,模板结合（复性）和延伸3个步骤循环过程（25,30个循环），目标DNA可,扩增100万倍以上。,18,基因诊疗和基因治疗,第18页,（1）DNA模板,变性,将待扩增DNA加热到95,0,C左右，使双链DNA解开成为单链,（即：使模板DNA或延伸后双链DNA发生热变性,），,并游离于反应体系中作为模板；,（2）模板与引物结合（,退火或复性,）,将体系温度降至适当温度（55,0,C左右），使加入引物与模板DNA两端（3端）碱基序列互补结合。,（因为加入引物量远多于模板量，所以引物与模板结合百分比远大于模板本身复性）；,19,基因诊疗和基因治疗,第19页,（3）引物,延伸,将体系温度升到72,0,C左右，Taq聚合酶催化dNTP按碱基互补标准连接在DNA引物3端，使引物延伸，形成两条与模板互补新链。,以上为一次PCR循环,（变性、复性和延伸）,（新合成链可作为下一轮循环模板）,按照上述步骤重复操作，PCR产物呈指数扩增。模板DNA 扩增倍数,T=2n,(n:,循环次数,)。,20,基因诊疗和基因治疗,第20页,PCR技术原理示意图,21,基因诊疗和基因治疗,第21页,2.PCR各要素及其作用,（1）模板,PCR模板能够是DNA或RNA。,以线性DNA模板为佳，量适中，普通为10,2,10,5,个拷贝；,RNA作为模板时，,需要：,RNA cDNA PCR,称此为,RT-PCR.,（2）耐热DNA聚合酶(,Taq DNA聚合酶,),是从耐热细菌体内提取一个DNA聚合酶，可在95,稳定30分钟。从而确保PCR在,94,变性,55,退火71延伸,循环30次过程中不变性失活。,在PCR中，Taq DNA聚合酶应用最广泛。,逆转录,22,基因诊疗和基因治疗,第22页,（3）引物,引物是依据已知序列模板DNA待扩增区两端而设计一对寡核苷酸小片断，长度普通为15,30个碱基。,引物是,确保PCR扩增产物大小和特异性关键原因，其设计与合成对PCR成功至关主要。,引物设计标准以下：,23,基因诊疗和基因治疗,第23页,引物设计应符合以下基本标准：,长度适宜，普通为15,30个碱基；,G+C含量，普通为40,60；,4种碱基应随机性分布；,引物本身不应存在互补序列；,两个引物之间不应有多于4个碱基互补；,引物3端不应有任何修饰；,引物5能够修饰。,24,基因诊疗和基因治疗,第24页,（4）缓冲溶液与Mg,2+,PCR技术惯用10,50mmol/L Tris-HCl、Ph8.38.88、偏碱缓冲液；并含有一定量,Mg,2+,浓度；,（5）dNTP浓度,PCR普通用50,200,mol/LdNTP；而且4种dNTP浓度应相等；,25,基因诊疗和基因治疗,第25页,（6）参数,变性温度与时间,普通选择：94,0,C，30秒,退火温度与时间,取决于引物长度、浓度 和G+C含量，,普通选择：Tm-5,延伸温度与时间,普通选择：70,75,循环次数,取决于模板浓度，普通循环：30次,26,基因诊疗和基因治疗,第26页,PCR操作,各种PCR反应操作基本相同，只是依据 引物与靶序列不一样，选择不一样反应体系和循环参数。,将PCR反应管置于DNA自动化热循环仪上，输入各种循环参数，使DNA扩增在热循环仪上很方便地完成。,PCR技术优点,特异性强、灵敏度高、操作简便、省时，对样本质量要求不高，能快速、特异地扩增任何DNA片断。,PCR缺点,因为高灵敏度，使易出现假阴性或假阳性结果。,27,基因诊疗和基因治疗,第27页,3.PCR产物分析,（1）凝胶电泳分析法,可用琼脂糖（Agrose）或聚丙烯酰胺（PAGE）凝胶电泳检测PCR扩增产物大小。,同时应以标准DNA分子量作平行对照，凝胶中加入溴化乙锭，电泳后，紫外检测仪下观察结果并拍照。,（,在待检靶序列拷贝数多、且仅扩增出一条带时，用此法即可满足检测要求。,）,28,基因诊疗和基因治疗,第28页,（2）点杂交分析法,该法有2种：,将扩增产物直接固定在膜上，每一个探针制备一张膜，然后用不一样特异探针进行杂交；,将不一样探针固定在膜上，再用有标识PCR产物 与之杂交。,本法有利于检测突变DNA类型，用于人类遗传病诊疗合一些基因分析。,(,当扩增产物时多条带时，用此法更适当。,),29,基因诊疗和基因治疗,第29页,(三)生物芯片,DNA芯片或基因芯片属于生物芯片一类。,30,基因诊疗和基因治疗,第30页,(四)基因测序,即，DNA碱基序列分析，这是最确切、最直接基因诊疗方法。,当前惯用方法为Maxam-Gilbert建立,化学裂解法,和Sanger建立,双脱氧末端终止法,。,31,基因诊疗和基因治疗,第31页,四.基因诊疗临床应用,(一)遗传病基因诊疗,(二)肿瘤基因诊疗,(三)感染性疾病基因诊疗,32,基因诊疗和基因治疗,第32页,举例：,镰刀状红细胞贫血,珠蛋白基因第六个密码子,A,T,表示产物：,谷,氨酸,缬,氨酸,一个碱基突变,缺失,1个,Mst内切酶,位点,正常人,：,1.1kb,患者：1.3kb,33,基因诊疗和基因治疗,第33页,5,3,5,3,1.1 kb,1.3kb,M,st,II酶切位点,（CCTNATG）,正常基因,突变基因,1.3kb,1.1kb,0.2kb,1,2,3,1、正常人,2、突变携带者,3、患者,34,基因诊疗和基因治疗,第34页,第二节 基因治疗,基因治疗概念,基因治疗总体策略,基因治疗基本程序,基因治疗现实状况与展望,35,基因诊疗和基因治疗,第35页,一、基因治疗概念,狭义概念,将含有正常功效基因置换或增补患者体内有缺点基因，从而到达治疗疾病目标。,广义概念,将某种遗传物质转移到患者细胞内，使其在体内发挥作用，最终到达治疗疾病目标。,36,基因诊疗和基因治疗,第36页,二、基因治疗总体策略,基因矫正,基因置换,基因增补,基因失活,“自杀基因”应用,免疫基因治疗,耐药基因治疗,37,基因诊疗和基因治疗,第37页,（一）基因矫正,（gene correction）,对于致病基因中,异常碱基,进行准确修复，使其恢复正常功效；,（二）基因置换,（gene replacement）,用正常基因在原位,替换,致病基因，使细胞DNA完全恢复正常状态；,38,基因诊疗和基因治疗,第38页,（三）基因增补,（gene augmentation）,将正常基因导入患者体细胞内，使其整合到染色体中一起表示，以赔偿缺点基因功效，但致病基因未去除。,（四）基因失活,（gene inactivation）：,指将特定反义核酸导入细胞，经过碱基互补作用与mRNA结合，阻断肿瘤细胞中基因异常表示，以抗肿瘤、抗病毒。,反义RNA:,干扰mRNA互补RNA;,反义DNA:,干扰DNA互补DNA.,39,基因诊疗和基因治疗,第39页,（五）“自杀基因”应用,自杀基因,这种基因导入受体细胞后可产生一个酶，它可将,原无细胞毒性或低毒药品前体转化为细胞毒物质，将,细胞受体细胞杀死，这种基因被称为,“,自杀基因,”,。,自杀基因,导入肿瘤细胞后，可将肿瘤细胞杀死。,但对正常细胞则无伤害作用。,40,基因诊疗和基因治疗,第40页,（六）免疫基因治疗,将一些细胞因子（IL-2、GM-CSF等）基因导入肿瘤患者体内，以增强患者抵抗力。,（七）耐药基因治疗,在肿瘤化疗过程中，把产生抗药品毒性基因导入患者体内，从而使患者能耐受更大剂量化疗。,41,基因诊疗和基因治疗,第41页,三、基因治疗基本程序,（一）治疗性基因取得,在了解疾病发生分子机制基础上，选择对疾病有治疗作用特定基因。,如，对单基因缺点遗传病，可用野生型（非突变）基因即可用于治疗；,对于肿瘤，最好选择一些与该类肿瘤亲密相关癌基因或抑癌基因用于基因治疗。,治疗性基因取得方法很多：,用酶切或探针杂交法从基因组DNA文库取得，从cDNA文库获取，PCR扩增，人工合成等。,42,基因诊疗和基因治疗,第42页,（二）基因载体选择,基因治疗关键步骤之一，是将治疗基因高效转移,入患者体内、并能调控其适度表示。,惯用载体有两类：,病毒载体和非病毒载体。,病毒载体,：逆转录病毒载体，腺病毒载体，,腺相关病毒载体等；,非病毒载体,：,与病毒载体主要区分在于：采取理化方法将治疗基因转移入患者体内。,43,基因诊疗和基因治疗,第43页,（三）靶细胞选择,基因治疗受体细胞有生殖细胞和体细胞两大类。,对生殖细胞进行基因治疗，可使该生殖细胞分化发育成长个体及其后代均含有正常基因，理论上讲是根治遗传病理想方法。,但因为包括安全性和伦理学问题，,当前基因治疗中禁止使用生殖细胞作为靶细胞，只限于使用体细胞。,44,基因诊疗和基因治疗,第44页,人类基因治疗中，将治疗基因导入靶细胞有两种,路径。,一个,为,直接体内疗法（in vivo）：,即，将治疗基因直接导入体内相关组织细胞；,另一个,为,间接体内疗法（ex vivo）,：,即，在体外先将治疗基因导入培养靶细胞内，再将已取得表示外源基因遗传修饰细胞回输入病人体内，到达治疗目标。,45,基因诊疗和基因治疗,第45页,治疗基因,导入受体细,胞方法,化学方法,物理方法,膜融正当,病毒载体法,质粒DNA直接转移法,（四）基因转移方法,磷酸钙法,DEAE葡聚糖法,电穿孔法,粒子轰击法（基因枪法）,46,基因诊疗和基因治疗,第46页,(五)转导细胞选择判定,标识基因技术,基因缺点型受体细胞技术,基因共转染技术,分子杂交技术,外源基因表示判定,(六)回输体内,将治疗性基因修饰细胞以不一样方式回输体内。,47,基因诊疗和基因治疗,第47页,四、基因治疗应用与展望,(一)基因治疗应满足条件：,1、单基因缺点疾病,2、仅限体细胞基因治疗,3、靶细胞易获取、培养、及回输体内。,4、治疗效果应胜过对病人危害。,5、表示水平无需调控且无副作用。,6、需经动物试验验证安全可行。,48,基因诊疗和基因治疗,第48页,（二）基因治疗有待处理问题,1、难以取得真正有治疗作用基因。,2、外源基因表示难以在体内准确调控。,3、体细胞经体外培养后，其生物学特征会有,改变。,4、过多外源蛋白对机体带来可能影响。,5、随机整合潜在威胁。,49,基因诊疗和基因治疗,第49页,50,基因诊疗和基因治疗,第50页,Eggs are coaxed to mature in a culture dish.Each has a remnant egg cell called the polar body and cumulus cells from the ovary clinging to it.,51,基因诊疗和基因治疗,第51页,While an egg is held still with a pipette,a needle is used to drill through the zona pellucida,removing a plug.,52,基因诊疗和基因治疗,第52页,After ejecting the zona plug,the needle is inserted back in the egg through the hole to withdraw and discard the polar body and the eggs genetic material.,53,基因诊疗和基因治疗,第53页,A cumulus cell from another egg is taken up into the needle.Cells called fibroblasts(or their nuclei)can also be used in this step.,54,基因诊疗和基因治疗,第54页,The cumulus cell is injected deep into the egg that has been stripped of its genetic material.,55,基因诊疗和基因治疗,第55页,The injected egg is exposed to a mixture of chemicals and growth factors designed to activate it to divide.,56,基因诊疗和基因治疗,第56页,After roughly 24 hours,the activated egg begins dividing.The cells contain genetic material only from the injected cumulus cell.,57,基因诊疗和基因治疗,第57页,By the fourth or fifth day,a hollow ball of roughly 100 cells has formed.It holds a clump of cells called the inner cell mass that contains stem cells.,58,基因诊疗和基因治疗,第58页,The blastocyst is broken open,and the inner cell mass is grown in a culture dish to yield stem cells.,59,基因诊疗和基因治疗,第59页,The stem cells,in turn,can be coaxed to grow into a variety of cells that might one day be injected into patients.,-,60,基因诊疗和基因治疗,第60页,基因诊疗与基因治疗（课堂练习）,1.核酸分子杂交主要内容有,制备核酸样本 B.制备与标识特异探针,C.核酸样本分离、变性、转移和固定,预杂交、杂交和漂洗 E.检测杂交信号,以下是惯用核酸杂交方法用途，错误是,Southern 印迹杂交法可用于检测特异RNA序列片断,Southern 印迹杂交法可用于检测特异DNA序列片断,Northern印迹杂交法可用于检测DNA或RNA,Northern印迹杂交法可用于检测RNA,原位杂交法可用于检测组织细胞中DNA或RNA,61,基因诊疗和基因治疗,第61页,3.以下是关于PCR技术叙述，错误是,PCR技术进行体外DNA扩增，其过程不一样于体内DNA复制过程,需要目标DNA两条链为模板,需Taq 酶代替DNA聚合酶,需RNA引物代替DNA引物,PCR需要DNA变性、复性和延伸3个步骤重复循环,基因诊疗惯用技术有,核酸分子杂交 B.聚合酶链反应,基因芯片 D.基因测序,E.以上都能够,62,基因诊疗和基因治疗,第62页,