苹果酸-乳酸酶基因克隆 及其在酿酒酵母中的表达.doc

Oenococcus oeni苹果酸－乳酸酶基因克隆
及其在酿酒酵母中的表达*

中国生物工程杂志China Biotechnology, 2005, 25(12):50～55
刘延琳1蒋思欣2何秀萍2李华1张博润2**
（1 西北农林科技大学葡萄酒学院杨凌7121002 中国科学院微生物研究所北京100080）

摘要苹果酸－乳酸酶是苹果酸－乳酸发酵过程中负责苹果酸转化为乳酸的功能酶。在进行酒酒球菌SD2a的苹果酸－乳酸酶基因(mleA)克隆测序基础上, 以PGK1强启动子和ADH1终止子为调控元件，以大肠杆菌－酵母菌穿梭质粒YEp352为载体，构建了重组表达质粒并转化酿酒酵母YS58。酵母转化子用SD/Ura平板筛选鉴定。斑点杂交检测表明目的基因mleA转化到受体菌中, SDSPAGE检测表明获得的转化子表达了约60kDa的目标蛋白。获得的转化子在添加了L苹果酸的培养基中培养4d；取培养液上清用HPLC检测L苹果酸及L乳酸含量，采用t检验进行差异显著性分析，结果表明mleA基因进行了功能性的表达，将L苹果酸转化成L乳酸，L苹果酸和L乳酸含量分别与对照差异极显著和显著，苹果酸的相对降低率平均为20.95%。 在有选择压力条件下，重组质粒相对稳定，而在无选择压力条件下，传代培养10d后大约有65%的重组质粒丢失。
关键词酒酒球菌苹果酸－乳酸酶基因转化表达

收稿日期：20050802修回日期：20050909
*陕西省自然科学基金及西北农林科技大学青年学术骨干支持计划资助项目
** 通讯作者，电子信箱：zhangbr@葡萄酒的酿造包含酒精发酵和苹果酸－乳酸发酵（malolactic fermentation, MLF）两个生化过程,分别由酵母菌和乳酸菌在不同条件下完成。由于葡萄酒乳酸菌是在高酒精含量、低pH值及存在有SO2的环境中生长繁殖，MLF的过程往往比较缓慢，常出现迟滞现象，甚至引发微生物病害［1~3］。如果能把乳酸菌参与MLF过程的基因通过遗传转化导入酵母菌中，使酒精发酵和MLF由重组酵母单独完成，则可减少细菌引发的葡萄酒酸败，避免乳酸菌在MLF过程中产生不必要的代谢副产物，缩短葡萄酒的酿造周期。
苹果酸－乳酸酶（malolactic enzyme, MLE）是MLF过程中降解苹果酸的功能酶［1,3］。不同来源的苹果酸－乳酸酶基因在酿酒酵母表达研究［3~11］取得了一些进展。酒酒球菌（Oenococcus oeni）是优良的葡萄酒乳酸菌，关于O. oeni苹果酸－乳酸酶基因（mleA）的克隆及转换酿酒酵母的研究报道只有1例［3］，且表达的效率较低。本研究进行我国自行筛选的优良酒酒球菌菌系SD2a的mleA基因的重组表达质粒的构建及其在酿酒酵母中的转化和表达，进一步探索提高酿酒酵母重组菌株降酸效率的途径。
1材料与方法1.1材料
1.1.1菌株与质粒大肠杆菌DH5α、酿酒酵母YS58（MATα,ura3，trp1，leu2，his4）、质粒YEp352（amp，URA3，YeastE.coli穿梭载体）、pVC7276、pEA1（YEp352：：TADHI，何秀萍构建）、pLmleA（YEp352：：mleA，刘延琳构建），均由作者所在实验室保存。
1.1.2工具酶、抗生素及试剂RNase购自华美生物工程公司； T4 DNA连接酶、限制性内切酶购自宝生物工程有限公司；Taq DNA聚合酶、氨苄青霉素购自北京鼎国生物技术发展中心。分析纯L苹果酸购自北京化学试剂公司，色谱纯L苹果酸和L乳酸均购自Sigma公司。
1.1.3培养基及培养条件 大肠杆菌DH5α保存和培养用LB培养基，加入氨苄青霉素、IPTG和Xgal的LB培养基用于筛选重组转化子［12］，37℃静置或振荡培养；酿酒酵母完全培养基为YEPD培养基，转化子用含有色氨酸、亮氨酸、组氨酸的YNB选择培养基［13］进行筛选鉴定，28℃静置或振荡培养。
1.1.4引物根据已发表的酒球菌mleA基因的核苷酸序列［3］，设计相应的寡核苷酸引物P1/P2进行目的基因的PCR鉴定。下划线处分别是引入的EcoRI和KpnI酶切位点。P1：5′CGGAATTCATGACAGATCCAGTAAGT
AT3′;P2：5′TAGGTACCACACTCTCAACACTCGTAAT3′；以上引物均委托上海生工公司合成。
2005, 25(12)刘延琳 等：Oenococcus oeni苹果酸－乳酸酶基因克隆及其在酿酒酵母中的表达
中国生物工程杂志 China Biotechnology Vol.25 No.12 2005
1.2方法
1.2.1基因操作质粒抽提、酶切反应、DNA片段回收、连接反应、细菌转化等操作均参照“分子克隆”第3版［12］略加修改。
1.2.2重组表达质粒的PCR鉴定分别以重组表达质粒及其菌液为模板，用Taq酶进行PCR反应，验证重组表达质粒的正确性。反应条件：94℃/5min；94℃/ 40s，56℃/2min，72℃/3min，共29次循环；72℃/ 15min。琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物。
1.2.3酵母转化及转化子筛选酵母转化采用醋酸锂转化法［13］，转化子用SD/Ura（含有色氨酸、亮氨酸、组氨酸的YNB）平板筛选。
1.2.4酵母转化子鉴定参照文献［13］进行转化子的营养缺陷型鉴定。参照文献［14,15］进行转化子的交配型鉴定。参照文献［12］进行酵母转化子的PCR鉴定。
1.2.5DNA斑点杂交鉴定提取酵母转化子的基因组DNA，参照文献［12］进行。
1.2.6SDSPAGE检测参照文献［12］进行。
1.2.7酵母转化子的功能检测将转化子以相同的接种量接于添加了6.5g/L L苹果酸的YEPD培养基中，28℃振荡培养5d，取上清，用高效液相色谱（HPLC）检测L苹果酸和L乳酸含量。
1.2.8重组质粒的遗传稳定性检测参照文献［14,15］进行。
2结果与讨论2.1mleA基因重组表达质粒的构建
前期研究对O.oeni SD2a的mleA基因进行了克隆测序［16,17］，所得包含mleA基因的重组质粒命名为pLmleA。用EcoRI和KpnI双酶切的质粒pLmleA，用低熔点琼脂糖回收目的基因片段，与来源于pVC7276的PGK1启动子和来源于pEA1的ADH1终止子连接，共同插入穿梭质粒YEp352，构建了重组表达质粒pYELmleA（图1）。图1mleA基因重组质粒和重组表达质粒的构建
Fig.1Construction of the recombinant plasmid and recombinant expressing plasmid of mleA
通过Amp抗性筛选及a－互补（蓝白筛选）获得单菌落，进行质粒快速抽提、质粒碱提、酶切等验证，获得重组表达质粒pYELmleA。以pYELmleA的阳性克隆为模板，以P1/P2为引物进行PCR扩增，得到了约1.6kb的特异性片段（图2），与mleA基因的大小相符。回收PCR扩增片段，用EcoRV进行酶切，得到约0.4kb和1.2kb的两个片段，用PvuII酶切，得到约0.6kb和1.0kb的两个片段（图3），结果同目的基因的酶切位点相符［17］，证明插入的目的基因片段正确，pYELmleA的构建正确。
图2重组表达质粒的菌落PCR验证
Fig. 2Verified of transformants by colony PCR
M：DGL2000 Marker；1~6：Result of colony PCR
图3PCR扩建产物的酶切分析
Fig.3Verified with restriction enzyme
digestion of PCR product
M:DGL2000 Marker;1:EcoRV;2.PvuⅡ
2.2酵母转化及转化子鉴定
将重组表达质粒及空载体YEp352分别转化酿酒酵母YS58，转化子用SD/Ura培养基平板上筛选。获得的重组转化子YSA进行PCR鉴定，得到了预期的目的基因片段（图略）。获得的重组转化子进而进行交配型和营养缺陷型鉴定, 结果重组转化子与受体菌同是α交配型（表1）。由于重组转化子弥补了受体菌的尿嘧啶缺陷, 因而可在SD/Ura培养基平板上生长（表1）。
表1酵母转化子营养缺陷型和交配型鉴定
Table 1Mating type and auxotrophic test of yeast transformants

菌株〖〗Mating type test〖〗Auxotrophic testα〖〗a〖〗SD/Ura 〖〗YNB+Leu+Trp+His受体菌YS58〖〗〖〗+〖〗〖〗+空载体转化子YS352〖〗〖〗+〖〗+〖〗+重组表达质粒转化子YSA〖〗〖〗+〖〗+〖〗+
2.3酵母转化子的斑点杂交检测
分别提取酵母转化子YSA 和YS352（CK）的质粒DNA，以回收的mleA基因为探针，进行斑点杂交检测。杂交结果（图4）显示，标记的探针与O.oeni SD2a的总DNA及重组转化子的质粒DNA有明显的杂交信号，而与宿主菌YS58及空载体转化子DNA没有可见的杂交信号，说明得到的重组酵母转化子是阳性转化子。
图4点杂交结果
Fig.4Results of dot bloting hybridization
1：O.oeni SD2a tatal DNA；2：YS58 plasmid DNA；
3~5: YSA plasmid DNA；6: YS352 plasmid DNA
2.4目的基因在酿酒酵母中表达的蛋白检测
进行转化子的SDSPAGE检测（图5），结果表明YSA表达了约60kDa的目标蛋白。
2.5mleA基因在酿酒酵母中表达的功能检测
对酵母转化子培养上清液进行HPLC检测，采用t检验进行L苹果酸含量及L乳酸含量与对照的差异显著性分析。重组表达质粒的转化子经过在添加了L苹果酸的培养基中培养4d，培养液上清中L苹果酸的剩余含量比对照极显著降低（表2）。对照未检出乳酸的生成，而供试转化子的乳酸生成量平均为1064mg/L，二者差异显著。L苹果酸的相对降低率平均为2095%。以上结果表明mleA基因进行了功能性的表达，将培养基中的L苹果酸转化成L乳酸，使得培养液中的L苹果酸含量降低。
2.6重组表达质粒的遗传稳定性问题
对重组转化子的遗传稳定性进行了研究，将YSA分别在有选择压力（SD/Ura）及无选择压力（YEPD）的液体培养基中连续传代培养10d，每天取样检测质粒的丢失情况，结果表明（图6），在有选择压力条件下，质粒相对稳定，而在无选择压力条件下，传代培养10d后丢失65%左右的重组质粒。这可能是由于表达所用的载体是附加体类型所致。
图5酵母转化子的SDAPAGE检测
Fig.5SDAPAGE yeast transformants
M: Protein marker; 1: YS352; 2: YSA
表2酵母转化子培养液中L苹果酸和L乳酸含量的检测分析
Table 2Detection and analysis of Lmalate and Llactic contents in culture supernatant of yeast transformants
菌株〖〗L苹果酸(mg/L)〖〗L乳酸(mg/L)〖〗苹果酸降低率（%）〖〗苹果酸相对降低率（％）YSA1〖〗4876〖〗1106〖〗25.07〖〗22.34YSA2〖〗5075〖〗1002〖〗21.71〖〗19.16YSA3〖〗4893〖〗1082〖〗24.82〖〗21.73YSA4〖〗5012〖〗1032〖〗22.99〖〗20.18YSA5〖〗4938〖〗1099〖〗24.12〖〗21.36YS352〖〗 6279**〖〗 未检出*〖〗3.51〖〗-Blank〖〗6508〖〗-〖〗-〖〗-
图6转化子YSA 质粒稳定性
Fig. 6Stability of plasmids in yeast transformants
2.7讨论
MLF是L苹果酸在乳酸菌（lactic acid bacteria, LAB）的苹果酸－乳酸酶（malolactic enzyme, MLE）催化下直接转变成L乳酸的过程。比较表2中L乳酸的生成量和L苹果酸的降低量，其当量关系基本符合MLF途径中L苹果酸和L乳酸的当量关系。这说明L乳酸的生成，是通过MLF途径，是mleA基因在酿酒酵母中功能表达的结果。与已有的报道相比［3,5,6,9~11］，本研究使乳酸菌的苹果酸－乳酸酶基因在酿酒酵母中表达的效率有所提高。这可能与采用PGKI强启动子且所构建的重组表达质粒的结构有关。
尽管如此，重组酵母降解外源L苹果酸效率并不高。其主要原因是由于酿酒酵母体内缺乏L苹果酸的转运蛋白,苹果酸盐的转运效率受到限制［9~11］。如果使苹果酸通透酶与苹果酸－乳酸酶协同作用，将会大大降低培养液中的L苹果酸含量。因此进行苹果酸通透酶基因与苹果酸乳酸酶基因在酿酒酵母中共转化和共表达的研究，有望进一步提高酿酒酵母重组菌株进行生物降酸的能力。而采用整合型载体，将目的基因整合到酵母的基因组DNA上，将会解决质粒遗传稳定性问题。
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Cloning of Malolactic Enzyme Gene from Oenococcus oeni

and Expression in Saccharomyces cerevisiae

LIU Yanlin1JIANG Sixin2HE Xiuping2LI Hua1ZHANG Borun2
(1 College of Enology, Northwest A & F UniversityYangling712100, China)
( 2 Institute of Microbiology，Academia SinicaBeijing100080, China)

AbstractMalolactic enzyme is the function enzyme to turn Lmalic acid into Llactic acid during malolactic fermentation (MLF). mleA gene encoding for Malolactic enzyme from pLmleA, PGK1 promoter from plasmid pVC7276 and ADH1 terminator from plasmid pEA1 were ligated and inserted into YEp352, resulted the expression plasmid. Yeast transformants were screened on SD/Ura (YNB medium containing leucine, histidine and tryptophan). The target gene was detected in the yeast transformants by dot blotting hybridization. The target protein was expressed by SDSPAGE detecting. After transformants were cultured in media containing Lmalate for 4d, the culture supernatant was collected and Lmalate and Llactic acid content were detected by HPLC. The result indicated that functional expression of mleA gene was achieved in recombinant S. cerevisiae, turning Lmalic acid into Llactic acid. Lmalate contents of the transformants show extra significant difference with the control ones in t test, while Llactic contents of the transformants show significant difference with the control ones. Average amount of 1064mg/L Llactic acids were detected and the comparative average drop rates of Lmalate were 20.95%, while no Llactic was detected from control transformants. The yeast transformants containing the foreign gene of mleA were stable relatively under selective pressure, but about 65% of the recombined plasmid were lost in 10 days subculture.
Key wordsOenococcus oeniMalolactic enzyme geneExpressionSaccharomyces cerevisiae