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肾脏的外缘弯弯地向外凸出。内缘又弯弯地向内凹陷．这个地方称做肾门。血管、神经、淋巴管、输尿管都由这里(肾门)进出肾脏。其排列顺序为：肾静脉在前、肾动脉居中、输尿管在后，该处合称为肾蒂。肾门向肾内延续为由肾实质围成的肾窦，窦内含有肾动脉、肾静脉的主要分支和属支、肾小盏、肾大盏、肾盂和脂肪组织等。肾的构造可以分为被膜和肾实质两部分以及双肾顶部的肾上腺。肾的被膜自内向外可分为三层： （1）纤维膜：为贴于肾实质表面的一层结缔组织膜，薄而坚韧，由致密结缔组织和少数弹力纤维构成。在正常状态下，容易与肾实质剥离。但在某些病理情况下，由于与肾实质粘连，而不易剥离。 （2）肾脏外面披着一层厚厚的黄色外衣，是由脂肪构成的．称做肾脂肪囊，起着固定、保护肾脏的作用。 （3）肾筋膜：位于脂肪囊的外面，由腹膜外组织发育而来。肾筋膜分前后两层，包绕肾和肾上腺。向上向外侧两层互相融合。向下两层互相分离，其间有输尿管通过。肾筋膜向内侧，前层延至腹主动脉和下腔静脉的前面，与大血管周围的结缔组织及对侧肾筋膜前层相续连；后层与腰大肌筋膜相融全。自肾筋膜深面还发出许多结缔组织小束，穿过脂肪囊连至纤维膜，对肾起固定作用。肾的内部结构又分两部分，周围称皮质，深部为髓质。 肾的解剖生理单位称为肾单位，由肾小球和肾小管组成。每个肾约有130万个肾单位。在正常情况下，肾单位交替地进行活动，因此肾具有很大的储备代偿能力。 肾小球由毛细血管丛和肾球囊构成，是血浆滤过的器官。肾小球毛细血管壁分3层，中间为基底膜，内侧有内皮细胞覆盖，外侧为脏层上皮细胞。毛细血管基底膜厚约320nm，可分为三层，中间为致密层，内侧和外侧各为内疏松层和外疏松层。毛细血管基底膜内面由一层扁平的内皮细胞覆盖。内皮细胞胞浆很薄，布满许多直径约70～100nm的小孔。脏层上皮细胞（又称足细胞）在基底膜外侧，胞浆丰富形成许多细长的分枝状突起称为足突。上皮细胞由这些足突附着于基底膜外疏松层。足突之间形成许多间隙，宽约20～30nm，称为滤过隙。距基底膜表面约60nm，在相邻的足突之间有一层薄膜称为滤过隙膜。毛细血管壁包括内皮细胞、基底膜、上皮细胞，共同组成肾小球的滤过膜。肾小球的滤过除与毛细血管的结构和滤过物质的分子大小有关外，并与基底膜的生物化学组成及其电荷有关。基底膜主要由Ⅳ型胶原和一些糖蛋白如层连蛋白、纤维连接蛋白和多聚阴离子多糖蛋白等组成。其中尤其是硫酸类肝素多糖蛋白带大量负电荷分布于内、外疏松层。此外，在毛细血管内皮细胞和脏层上皮细胞表面也有带负电荷的唾液酸糖蛋白。肾小球的负电荷可阻止血液中带负电荷的分子如白蛋白滤过。当肾小球多聚阴离子减少时滤过的蛋白质可增加。 在肾小球毛细血管之间有少量组织支持毛细血管网，并将毛细血管联系在一起，称为肾小球系膜，由系膜细胞和系膜基质组成。系膜基质充填在各叶毛细血管之间。系膜细胞散在于系膜基质内。系膜细胞有收缩功能，可参与调节肾小球毛细血管的血流。系膜细胞还具有吞噬功能，可吞噬进入肾小球的大分子物质。系膜细胞可产生血管活性物质、细胞因子和生长因子，并可产生系膜基质和胶原纤维，对清除肾小球滤过的物质以及与肾小球炎症和损伤时的增生和修复都有重要关系。
各位战友好：
本人把大鼠原代肾小管上皮细胞的取材、培养方法进行了总
结，请分享！
取材：1.肾小管节段的分离(机械网筛滤过法)：
①取 Wistar 大鼠断颈法处死，立即置入碘伏液中浸泡 5 分钟。
②将大鼠转移入超净工作台，取腰部切口迅速取出肾脏，置于盛有生理盐水的培养皿中清洗并除去包膜和肾蒂组织。
③取皮质置于80目筛网上，剪碎成1-2mm3大小组织块，网下放盛有少量生理盐水的培养皿。
④用玻璃注射器内芯于80目网上充分研磨组织。
⑤收集 80 目网下液体转移至 100 网筛上，用生理盐水冲洗。
⑥将100目网上组织用生理盐水冲洗入另一培养皿中，收集置入离心管中。1500 转/分钟离心5分钟，弃去上清。
2 肾小管节段的消化及培养
①用1.5ml 0.25%胰蛋白酶重悬沉淀，37℃温箱中消化约10分钟。
②加入3ml(双倍量)含有10%胎牛血清RPMI1640中止消化，1500 转/分离心8分钟，弃上清。
③加入约3ml RPMI1640 悬浮沉淀，并用吸管充分吹打混匀，接种于培养瓶中。
④分离肾小管节段接种于培养瓶后，第一天加入少量培养基，置入37℃,5%CO2孵育箱中静置培养。
⑤培养过夜后，第二天加入足量的培养基，静置培养。
⑥培养 72 小时后首次换液，以后每两天换液一次。
⑦约第六到七天细胞生长基本融合成单层。

（缩略图，点击图片链接看原图）

能否介绍下 这张图片
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通过严格的肾皮质取材、研磨、筛网分离，可以将肾小球结构滤过而使肾小球上皮细胞与肾小管上皮细胞分开，同时也使成纤维细胞和肾间质细胞与肾小管充分分离，仅保留肾小管节段(收集物中肾小管节段纯度可达90%以上)，达到纯化的目的。然后使用胰蛋白酶对肾小管节段进行消化，由于胰蛋白酶对肾小管节段的损伤是可逆的，经过一定时间的修复传代后，细胞能继续保持其正常形态和功能。本图片就是筛网法结合酶消化法，取的肾小管节段在200倍倒置显微镜下的照片，请分享！

（缩略图，点击图片链接看原图）

这种培养属于肾小管节段释放细胞法，我们可以从图片中可以看出，模糊的结构就是肾小管节段，周围为释放的肾小管上皮细胞，形状为多边鹅卵石状。

（缩略图，点击图片链接看原图）

是否 发帖 滞后？出现了重复帖！
把所有帖全集中到此帖。

对肾小管上皮细胞的鉴定主要采用免疫组化法，主要根据肾小管上皮细胞胞浆中特异表达角化蛋白ck-18而利用抗角化蛋白抗体进行鉴定
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原代大鼠肾小管上皮细胞的形态呈鹅卵石铺路状！
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照片好呀
好详细

he很好》请问，肾脏方面的研究你做有 哪些实验。。。阿霉素肾病大鼠模型，以及细胞的选择培养？？

我也在做肾小管上皮细胞的原代，请教：我是用80gSD大鼠做的，贴壁效果不好，请问您的Wistar 大鼠是多大的？另外分离肾皮质的具体方法是怎样？谢谢！

家兔肾脏内髓集合管细胞的分离与原代培养
文章来源： 　　　　 2006-7-19 18:23:04

家兔肾脏内髓集合管细胞的分离与原代培养
中国应用生理学杂志 2000年第1期第16卷 技术方法
作者：夏前明　黄坚　肖贞良　钱桂生
单位：夏前明　肖贞良(成都军区总医　院呼吸科，成都　610083)；黄坚　钱桂生(第三军医大学新桥医院呼吸研究所，重庆　400037)
关键词：家兔；肾脏；内髓集合管细胞；细胞培养
　　摘要 目的：为了分离、培养肾脏内髓集合管（IMCD）细胞。方法：本 文采用胶原酶消化和低渗溶解等步骤分离家兔肾脏加IMCD细胞；分离的细胞置DMEM／F 12培养基、37℃、5％CO2的空气环境中培养；经透射电镜和角蛋白抗体免疫细胞化学等 鉴定。结果：几乎所有的培养细胞均被染为棕黄色；电镜观察培养的细胞核 大，呈圆形或椭圆形。胞浆少，细胞器少见。细胞膜表面存在许多短而粗的微绒毛。与天然 的IMCD细胞的形态和免疫细胞化学特征相符。结论：本文培养的细胞为家 兔肾脏IMCD细胞。
　　中图分类号：　R3334文献标识码：B　　　　文 章编号：1000-6834(2000)01-0092-04
ISOLATION AND PRIMARY CULTURE OF INNER MEDULLARY COLLECTING DUCT CELLS FROM RABBIT KIDNEY
XIA Qian-ming1, HUANG Jian2, XIAO Zhen-liang1， QIAN Gui -sheng2
　　(2.Institute of Respiratory Medicine, Xinqiao Hospital, Th ird Military Medical University, Chongqing 400037;1.Department of Resp iratoty Medicine, Chengdu Army General Hospital, Chengdu 610083)
　　ABSTRACT
　　Aim: To isolate and culture inner medullary collectig duct(IMCD) cells f rom kidney.Methods: The measures of collagenase incubation and h ypotonic lysis were adopted to isolate IMCD cells from rabbit kidney. The isolat ed cells were cultured with DMEM/F12 medium under 37℃, 5%CO2/95% air atmosph ere. The primary cultured cells were identified with the immmunocytochemistry of monoclone antibody against keratin and transmission electron. Results:Light brown positive staining of monoclone antibody against keratin presents almost all cultured cells. Transmission electron micrograph shows that the cell has a large round or oval nucleus and very light cytoplasm that is almost devoi d of organelles, and many small stubby microvilli are present on the cell membra ne. which are compatible with the native IMCD cell. Conclosion:The p rimary cultured cell in this study, is IMCD cell of rabbit kidney.
　　KEY WORDS:　 rabbit kidney;　inner medullary collecti ng duct cell;　 cell culture
　　内髓集合管(IMCD)是哺乳动物肾小管的最后一段。IMCD的结构中主要包含间质细 胞、血管内皮细胞、血细胞、髓袢薄部细胞、直管细胞和IMCD细胞等几种细胞，而直接参 与渗透平衡和酸碱平衡调节的是IMCD细胞［1］。1978年，Grenier和Smith首先成功 地分离、培养出IMCD细胞，为体外利用IMCD细胞进行细胞生物学及细胞病理学研究开辟了 道路。近20年来，许多学者致力于IMCD细胞培养的研究，分离、培养方法逐渐完善，但国内 迄今尚未见有IMCD细胞培养的研究报告。为此，我们尝试进行家兔肾脏IMCD细胞分离、培养 ，为利用培养的IMCD细胞进行有关的研究奠定基础。
　　1　材料与方法
　　1.1　材料
　　一月龄新西兰大白兔，购自第三军医大学实验动物中心，体重350～400 g，雌雄不拘。DNa se I、胶原酶Ⅱ、HEPES为美国Sigma公司产品，DMEM/F12为美国Gibco公司产品，小牛血清 购自华西医科大学。链霉菌抗生物素蛋白一过氧化酶免疫组化染色试剂盒为福州迈新公司产 品。其余试剂为国产分析纯商品。青霉素、链霉素和乙醚为国产医用药品。
　　1.2　IMCD细胞的分离
　　主要参照Husted等的方法［2］，加以改进而成，主要步骤如 下：家兔用乙醚麻醉，无菌开腹取肾，剪取肾乳头内侧约1 mm宽的组织块，在生理溶液中反 复剪碎后，吸入无菌试管内，室温下28 g离心5 min，弃上清。沉淀加入0．1％胶原酶Ⅱ溶 液2　ml混匀，5％CO2、37℃孵育。每隔15 min用吸头抽吸混匀一次，共孵育90～120 mim 。取出试管加2倍体积的0．01％DNase Ⅰ溶液低渗溶解非IMCD细胞，轻轻摇匀。5％CO2、 37℃孵育。每15 min用吸头抽吸混匀一次，共孵育45～60　min。消化好的细胞悬液经100目 不锈钢筛网过滤。滤液室温下112 g离心5 min，弃上清。分别用10 ml生理溶液和10 ml小牛 血清溶液洗涤两次。细胞沉淀用20 ml培养液悬浮，IMCD细胞的分离过程完成。
　　1.3　细胞活性检测
　　取9滴细胞悬液滴入另一清洁试管，加0．4％台盼蓝1滴染色2～3 min，以细胞核拒染作为 活性良好细胞。取1滴已染色的细胞悬液滴入血细胞计数板，倒置显微镜下观察，可见有2～ 3个细胞相连形成弧形，也有10多个细胞相连的肾小管节段。镜下观察拒染率＞95％，细胞 纯度＞95％。
　　1.4　IMCD细胞的种植与培养
　　用培养液将分离一只家兔肾脏所得的IMCD细胞稀释成20×105/ml的细胞悬液，按5×102 ／ml接 种于75 cm2玻璃培养瓶，放入CO2恒温孵箱(37℃、5％CO2)静置培养。一般于第3～5 d约有的60％～80％的IMCD细胞贴壁，故常于第4 d首次更换培养液，以后每2～3 d换液一 次，7～10 d IMCD细胞融合成细胞单层。
　　1.5　上皮细胞角蛋白免疫组化
　　用福州迈新公司的链霉菌抗生物素蛋白一过氧化酶免疫组化染色试剂盒进行，细胞被染成棕 黄色者为阳性。
　　1.6　透射电镜观察
　　将培养的IMCD细胞收集在一个离心管内，离心成团，弃上清，按1∶5的比例直接向离心管 内加入3％戊二醛固定液，以后按常规方法制样观察。
　　2　结果
　　2.1　上皮细胞角蛋白免疫组化

Fig.1 Immunocytochemical microg raph of the primary cultured IMCD cell of the rabbit
　　Light brown positive staining of anti-keratin monoclone antibody in c ell membrane, cytoplasm,and nuclear membrane(×200)
　　2.2　透射电镜观察

Fig.2 Transmission electron micro graph of primary cultured IMCD cell of the rabbit
　　The cell has a large round or oval nucleus(↑) and very light cytoplas m that is almost devoid of organelles（×8000）
　　2.3　胶原酶孵育最佳时间(见右表1)
　　2.4　离心力对IMCD细胞分离效果的影响(见右表2)
　　3　讨论
　　由于IMCD细胞所处的环境特别， IMCD细胞具有几个显著的特点： (1)细胞体积大， 多 大于10 μm;(2)对渗透压变化适应范围宽，低于200 mosmol/L或高于2 000 mosmol/L都能耐 受；(3)对氧的需求不高，PO2可低至1．33 kPa。因而，IMCD细胞的分离方法主要围绕这些 特点设计的，大致可分为低渗溶解非IMCD细胞和等渗离心沉淀IMCD细胞两类。Grenier和Smi th首创IMCD细胞原代培养即采用低渗溶解法，但该法使用胰蛋白酶消化细胞，对IMCD细胞的 损 伤较大。Stokes等则采用等渗离心法以避免低渗对IMCD细胞的可能损伤，但此法低速离心时 ，离心力仅为28 g，一些IMCD细胞不能沉淀下来，使细胞收获量明显减少。Nonaka用等渗组 织块培养进一步简化操作，我们亦用此法分离培养IMCD细胞，发现细胞纯度稍差。Husted等 用显微取材法分离末段IMCD细胞［2］，是目前较为理想的IMCD细胞分离方法。我们 参照 Husted等的方法分离培养家免肾脏IMCD细胞。倒置显微镜观察培养的细胞融合时，呈 多角形，可见半囊。细胞核大居中，圆形或椭圆形。透射电镜显示培养的细胞核大居中，圆 形或椭圆形。胞浆内细胞器相对较少，可见散在的线粒体。细胞膜上可见微绒毛。抗角蛋白 抗体免疫组化染色使几乎所有的培养细胞都呈阳性反应。这些结果与文献报道的天然IMCD 细胞特征相符［2～4］，说明我们培养的细胞为IMCD细胞。

Fig.3 Transmission electron mic rograph of primary cultured IMCD cell of the rabbit.
　　Many small stubby microvilli are present on the cell membrane (↑）（× 15000)
Tab.1 Optimal incubation time of collag enase
Time(min)
IMCD cell(×105/ml)
　30
　41*
　60
　84*
　90
112
120
138
150
　97
180
　65
　　* Tissue masses were observed with naked eyes
Tab.2 Effect of centrafugal force on I MCD cells
Centrafugal
　　force(g)
IMCD cell
　　(×105/ml)
non-IMCD
　　cell(%)
　28
　34
-
　56
　76
　2
112
　98
　4
252
128
11
447
83
16
　　要达到胶原酶消化法的较好效果，关键的因素是控制离心力和胶原酶的消化时间。消 化酶的作用时间与酶的种类、单一酶或几种酶复合消化、孵育温度及pH等因素有关。我们用 0．1％胶原酶、pH 7.4、37℃孵育的结果显示，90～120 min效果较好，既无肉眼可见的组 织块，又无明显的IMCD细胞破坏。我们的结果还显示，当离心力为28 g，无杂细胞，但IMCD 细胞产量较少；当离心力为252 g，细胞产量有所增加，但有杂细胞掺入；离心力为447 g， 细胞产量反而减少，可能是离心力过大，使IMCD细胞破坏。因此，分离IMCD细胞，离心力 最好控制在112 g,细胞的产量和纯度均较理想。
　　分离细胞达到比较满意的产量后，如何保证细胞的纯度则是另一个突出的问题。除了上 述适当离心力的措施外，还根据IMCD细胞的特性采取低渗溶解非IMCD细胞。有实验表明通过 加入2倍体积的蒸馏水，持续4～5 min，即可完全溶解非IMCD细胞，从而达到纯化IMCD 细胞的目的［2］。我们采用低渗溶解非IMCD细胞，并加用DNase降解DNA。不同 的孵育时间显示，孵育45 min后即无粘性带出现。通过此处理，我们分离的IMCD细胞纯度 多在95％以上。台盼蓝染色结果显示拒染率多在95％以上。故加入低渗DNase溶液的孵育时 间以孵育45～60 min为宜。其原因可能是随着非IMCD细胞的破裂，释放 出大量的基因组DN A,形成一些粘性带，粘附部分IMCD细胞，使IMCD细胞的产量减少。加用DNase降解DNA ，就能减少基因组DNA粘性带所造成的IMCD细胞损失。
　　IMCD细胞必须贴壁后才能生长、增殖、细胞数量增加，因而，细胞贴壁是细胞培养成功 的标志。影响细胞贴壁的因素很多，参考有关文献，我们采取的主要措施包括：(1)选择1月 龄家兔作供体；(2)DMEM／F12混合培养基加10％小牛血清；(3)接种后绝对静置培养4 d ，首次换液时才移动培养瓶。实验结果较为满意，说明这些措施对家兔IMCD细胞培养是合适 的。其原因可能是：(1)1月龄家兔供体细胞年龄较轻，相对容易培养；(2)小牛血清中含有 促细胞贴壁成分，同时，不必另外处理培养瓶而简化操作；(3)接种后频繁移动培养瓶，或 较早换液，均可影响细胞贴壁。而静置培养4天，绝大多数分离细胞都能贴壁。作者简介：夏前明，（1955-），男，四川泸州人，副主任医师，博 士，从事呼吸系统疾病的基础与临床研究
我主要是参照 "谌贻璞，高进，邢宝才，等. 肾小球系膜细胞培养. 北京医科大学学报，1989，21：335"的方法做的,培养成功了,不过,中间也遇到了好多问题.谈几点我个人的体会:
1.我用的是体重100g左右的SD大鼠,用了两只大鼠,接种了1瓶细胞(25cm2)。 不过接种的瓶数要根据收获细胞的数量来决定。
2.很多文献报道用肾脏灌洗法获得的细胞较纯，容易养活。我也试验过这个方法，不过系膜细胞原代培养的步骤本来就挺烦琐，再加上灌洗，增加了工作量，增加了污染机会，操作也挺不方便。后来我就没用。不过有条件的实验室可以试验一下。
3.取肾的过程尽可能快，但要保证无菌。取出的肾脏要始终保持在D-Hank‘s液或培养液中，即使在剥离肾包膜，切取肾皮质的过程中也要注意不时滴些D-Hank‘s液或培养液。
4.过筛时，我是把三层网筛上下重叠（按由上到下150，80，200目的顺序），坐落于一个无菌玻璃皿或小烧杯上。将剪碎的肾组织移至最上层网上，用玻璃注射器的针芯在上面轻轻碾压，不断用PBS或D-Hank‘s液冲洗网筛，直到把几乎所有的组织都碾过网筛。然后把最上层网去掉，冲洗第二层网筛，再去第二层网筛，彻底冲洗第三层网筛，因为我们需要的肾小球细胞就在这层网上，所以要彻底冲洗祛除杂质。冲洗这层网筛时几乎是看不见肾小球的，所以要把这层网筛尽量倾斜，将所用的肾小球都冲到网的一边，最后在这层网筛上收集肾小球（就是冲洗以后，将留在网筛一边的残留液体收集到一个无菌离心管中，要多次重复这个过程，尽可能多收集肾小球）。
5. 主要操作过程中所用的网筛，剪刀，针芯等不要老在酒精灯上烤，没有足够冷却或烧焦的物质会影响细胞活力。
6.消化时要掌握好时间，我是用0.1%IV胶原酶在37℃消化半小时，期间震荡几次。这个过程要自己多次摸索。做预实验时可在不同时间点取些消化液滴于载玻片上于显微镜下观察肾小球情况。消化过度的肾小球会过度松散甚至破碎，背景中的碎细胞很多；而肾小球紧缩成团可能是消化不够；消化适度的肾小球松紧适度，表面有种毛糙，颗粒状的感觉。这是我总结出来的，请指正。
7.接种时培养液不要放太多（我的25cm2的培养瓶放了3ml），以免影响贴壁。我之前做了好多次，细胞也没污染，但就是肾小球不贴壁，后来用多聚赖氨酸包被培养瓶底的那一次就贴壁成功了）。培养前5天别动培养瓶。以后每2—3天换液一次。以后细胞就长得旺旺了。
8.我的细胞长满瓶底用了4周时间，接下来就是传代，冻存这些常规操作了。但记得要始终留一瓶细胞在外面养，因为万一冻存有问题，也不至于全军覆没呀。
9.我请教过一些做过的人，他们养的第一瓶也是用了近1月才长满。很多文献报道是10天左右，不知缘由。所以，只要细胞没污染没全死，就被轻易放弃它。
以上是本人的一些经验教训，愿与同行们共勉！

中性树胶，作为一种粘合剂，用于将载玻片和盖玻片粘合在一起，把生物组织切片封起来长久保留。
编辑本段中性树胶的特点
　　它有几个特点符合物镜粘合剂的需求：
　　1、透明度高，几乎和光学玻璃一样清晰。
　　2、不腐蚀玻璃，因为它是中性的，而玻璃最怕碱性，如果不放心可以在粘合以前用盐酸酒精泡泡晾干再粘可能会更好。
　　3、不容易长霉，可能是因为中性树胶的溶剂二甲苯有杀霉菌作用。
　　不过中性树胶有些缺点，它是以二甲苯为溶剂的，封合后挥发很慢，制作的玻片起码在通风处晾一两个月才没有二甲苯的味道。可能在烈日下暴晒会快点。
　　封片方法很简单，在载玻片中央滴2-3滴树胶液（注意要滴在一起否则容易有气泡），然后把盖玻片慢慢放上去，轻轻挤压，树胶液会向外侧扩散至整个镜片，通风晾几个小时后用棉球粘上二甲苯或者松节油把镜片边缘多余的树胶擦洗干净。然后再放在通风处晾2个月。