Pro-inflammatory cytokinechemokine production1.doc

呼肠病毒是一种双链RNA病毒nonenveloped是在人口高度流行但产生一些临床症状。大的兴趣，包围了呼肠孤病毒作为一种溶瘤代理，因为它能够感染和诱导肿瘤范围的人类正常细胞死亡，而保留使用。此外呼肠孤病毒已完成了早期临床试验的次数，也是目前在第三阶段的测试设置。初步研究表明，肿瘤特异性溶瘤活性后，激活的Ras信号通路的存在有关，尽管最近的数据表明，易感性呼肠孤病毒感染可能会影响其他复杂的机制

本实验室以前的工作表明，人类黑色素瘤细胞系，以及新鲜手术切除肿瘤，进行呼肠孤病毒引起的一Ras/RalGEF/p38依赖性细胞死亡，而这种死亡是由炎性趋化因子和细胞因子释放的陪同下。的炎症介质的释放以下病毒感染肿瘤细胞已被观察到，如单纯疱疹病毒（HSV）[8]和新城疫病毒（NDV）其他溶瘤病毒。

和不论是自然或通过诱导免疫激活基因直接插入溶瘤，一些病毒，已被证明，以刺激抗肿瘤免疫反应，表明其潜在的免疫治疗和细胞毒性药物。我们以前曾表明，呼肠孤病毒可以通过直接激活施加直流先天刺激NK / T细胞对肿瘤细胞免疫细胞毒性作用，并呼肠孤病毒诱导肿瘤细胞死亡促进先天免疫和适应性抗肿瘤反应在小鼠和人体模型吸系统。然而，由呼肠孤病毒感染的黑色素瘤细胞（病毒本身可迅速清除体内的影响独立）产生的促炎症环境的免疫原性，在发起细胞因子/趋化因子在肿瘤细胞中参与制作的信号通路，还没有得到解决。

趋化因子可以在感染和炎症参与由指挥免疫在宿主反应
效应细胞迁移。趋化因子的四个家庭被描述的基础上，保守的半胱氨酸残基的位置。多趋化因子受体可以共享一个共同的，每个趋化因子有可能绑定到几个不同的受体，从而使多种生物的成果后，趋化因子和环境构成的细胞内环境而定。此外，在炎症部位，趋化因子能形成heteromers，有可能诱导协同行动，增强白细胞的迁移和活化。因此，在一个多趋化因子诱导免疫抑制肿瘤微环境有可能诱发免疫效应细胞，以提高治疗效果有力。例如，在小鼠黑色素瘤模型，异位表达和肿瘤细胞的IP- 10分泌增加在肿瘤部位和延长生存依赖NK细胞的NK细胞的数量。数据还显示之间CXCR3表达对T细胞和改进的第三阶段黑色素瘤患者的临床疗效较好的相关性。

目前的研究进一步探讨趋化因子和细胞因子（包括I型干扰素）的reoviral溶瘤诱导的信号通路，为这些炎症介质的产生负责。我们还确定具体的活动性病毒缺乏reoTCM的影响，以排除病毒免疫激活对趋化，NK细胞，DC和CTL的激活和效应功能，直接的后果。

材料和方法
细胞培养和呼肠孤病毒
Skmel - 28、Mel- 624、Mel- 888和MeWo细胞生长在Dulbecco的改良Eagle培养基（DMEM培养基）（Invitrogen公司，佩斯利，英国），加入10％（体积/ V）的胎牛血清（FCS）的（BioSera，帕特里克下，英国）和1％（v / V）L -谷氨酰胺（Sigma Aldrich公司）。
获得外周血液单个核细胞（PBMC），经当地伦理学批准，采用Ficoll - Hypaque密度梯度离心从健康献血者棕黄色大衣。人类骨髓未成熟树突状细胞（DC）产生的人类PBMC经MACS CD14 +选择（Miltenyi公司生物技术）或者单核细胞粘附，如前所述。
单核细胞培养在RPMI 1640培养基中，加入10％胎牛血清，1％L -谷氨酰胺（完整的媒体），800 U / ml的GM - CSF的和500 U / ml的IL - 4的，培养5天。
使用MACS negative depletion kits从人类PBMC中分离得到NK细胞（90％纯度） 。NK细胞常规培养于DMEM，10％（体积/ V）的人AB血清、5％（体积/ V）的胎牛血清和1％（v / V选择）L -谷氨酰胺的。用病毒感染Mel- 888细胞（moi 0.1），以如下方法详细分析得知，14天后产生细胞毒性T淋巴细胞（CTL）。
对于趋化实验，NK细胞、DC和CTL的悬浮于RPMI/0.5％的人AB / 1 LGlutamine 中。所有细胞株生长在37℃，含5％二氧化碳条件下，并定期检查，证实无支原体存在。另有说明黑色素瘤细胞用2.5mM 2 -氨基嘌呤（2 -美联社）或50μM的咖啡酸苯酯（CAPE）处理1小时之前，期间，与呼肠孤病毒治疗。无论是2 - AP，还是CAPE，都没有在使用的剂量凯普直接黑色素瘤细胞毒性（数据未显 示）。迪林呼肠孤病毒3型菌株生物技术公司是由Oncolytics提供的病毒滴度测定用标准的牌匾L929细胞检测。

酶联免疫吸附试验，点阵仪和流式细胞仪
使用配对抗体检测IL - 8。IFN-ß的检测使用IFN-ß kit。趋化因子和IP- 10的检测采用点阵仪检测技术（Biosource）。为了评估NK细胞表型的活化作用，以CD69-APC/CD56-PE/CD3PerCP抗体标记NK细胞（屋宇署Pharmingen公司，R和D系统）。用FACS-Calibur仪器，以CD56-PE+ve/CD3-PerCP-ve populations确定CD69的表达。

免疫印迹Western Blotting
黑色素瘤细胞株接种于10厘米的菜肴和未经处理或离开四呼肠病毒感染与10pfu/cell，8，12，16，20和24小时以前，向全细胞裂解物的准备。准备使用核分数主动母题核提取试剂盒根据制造商鈥指示。全细胞裂解液准备使用RIPA缓冲与蛋白酶抑制剂的鸡尾酒（25渭升/毫升，sigma）的补充。 10渭总加载每克蛋白质的全细胞裂解液为巷。 20渭加载G蛋白每核分数线。分离蛋白，10％的聚丙烯酰胺凝胶转移至硝酸纤维素膜。对膜进行探讨与总巴基斯坦卢比（蓝光转导实验室），我- B型（圣克鲁斯）和p65核因子- B型（上州）抗体。抗体结合使用奥德赛检测系统（李西科生物科学英国，剑桥，英国）。平等巷装载证实使用针对β-肌动蛋白（Sigma公司）单克隆抗体。

RNA干扰（RNAi）技术研究
购自Ambion公司的siRNA和重组，以20μM浓度根据制造商的指示。是对巴基斯坦卢比（PKRV）和无关（绿色荧光蛋白专用）对照siRNA的siRNA寡核苷酸被使用。该序列，PKRV5'AAGGUGAAGGUAGAUCAAAGA-3'，控制5'AAGGACGACGGAAACUACAAG-3'。黑色素瘤
在24孔板和10 cm菜细胞，转染100纳米（这是由初始浓度滴定实验优化）的siRNA。对照siRNA转染浓度相当于使用包括在每个实验。转染，进行了血清免费使用6小时OligofectAMINE（Invitrogen公司）媒体。媒体得到了补充和补充，并与血清中细胞的siRNA过夜培养的继续存在。隔夜培养后预先存在的媒体被排除在24孔板和一毫升正常生长介质取代，细胞不及时治疗或呼肠孤病毒（0-10pfu/cell）感染。从这些细胞上清在24和48小时呼肠病毒感染。对于10厘米菜前被拆除现有的媒体和全细胞裂解液的制备和SDS - PAGE电泳前总巴基斯坦卢比抗体探测分开。平等巷装载证实使用针对β-肌动蛋白的单克隆抗体。

引发的MEL -888细胞毒（CTL）的T淋巴细胞
梅尔- 888细胞接种于培养瓶中，并允许组织坚持。直流，悬浮在媒体50:50的直流混合/ reoTCM（由梅尔- 888），非reoTCM，或直流媒体/ DMEM培养完成，增加了在1:3（DC到梅尔- 888细胞：肿瘤细胞）过夜。悬浮细胞，吸气，使肿瘤的单分子层完整，细胞颗粒如前所述。肿瘤直流，然后装在CTL媒体[悬浮的RPMI与7.5％（v / V选择）人AB血清（Sigma公司），1％（v / V选择）L -谷氨酰胺，1％（v / V选择），丙酮酸钠（生命技术为辅），1％（v / V选择）非必要的氨基酸（生命技术），1％（体积/ v）的培养基含（生命技术），20μmol/ L的2 -巯基乙醇（Sigma公司），和混合的比例在1:10至1:30自体外周血单个核细胞。文化中分别添加5毫微克/毫升的IL -7（研发系统）由第1天，30天4只ü/毫升的IL -2（研发系统）。文化被重新刺激的7天使用相同的协议。细胞收获第14天，铬释放，CD107细胞脱颗粒和干扰素- G的评估，详情如下。

NK细胞，DC和CTL的趋
1.5 × 105个黑色素瘤细胞接种于6孔板和左过夜。前被拆除现有的媒体的DMEM / 2％/ 1％L -谷氨酰胺和细胞用1或10pfu/cell 48小时呼肠病毒感染的现场总线所取代。收集上清通过0.2微米Acrodisc注射器过滤器（颇尔生命科学版），然后通过ViresolveNFR过滤器（纯水）删除病毒。趋化评估采用Transwell小系统
650μL的过滤中医从四个黑色素瘤各
细胞株添加到下腔一式三份
在24孔板中井和一个5微米（NK细胞和CTL）或8微米（直流）Thincert™膜（格雷纳生物之一）在有条件。5 × 105 NK细胞，直流或CTL（反梅尔- 888的CTL，这些趋化实验中使用了以前使用引呼肠病毒感染的梅尔- 888负载DC的描述[12]），在100μl的低血清培养基悬浮被安置在上院和板分别在37℃孵育3小时C。在较低的井收集细胞，在流式细胞仪缓冲洗净，用3μL的CD56的，聚乙烯（Serotec）和标记3微升外周血CD3 - FITC标记（蓝光生物科学）（NK细胞），素CD11c -聚乙烯（蓝光生物科学）（DC）或3微升外周血CD3 - FITC标记和CD8 - PerCP（CTL）的30分钟在4 ° C细胞洗涤，悬浮于300μL的缓冲区和流式细胞仪转移到超铀数™管（屋宇署Biosciences公司），其中包含一个已知数量的荧光珠，提供内部计数控制。A至珠细胞比例确定每个管和一个迁移指数是由这个比例正常化的对照组中，中医收获感染肿瘤细胞（'nonreoTCM'）被用来计算。
CD107细胞脱颗粒和干扰素- G的染色
CD107是一种溶酶体颗粒胞吐的标记，并作为一种NK细胞和CTL细胞脱颗粒标记如前所述[14]使用。 NK细胞和CTL孵育在与肿瘤的目标（K562细胞，梅尔-888或卵巢癌SKOV- 3）按1:1的比例，在CD107a- FITC和CD107b- FITC标记抗体（屋宇署生命科学）的存在。布雷菲德菌素A（10微克/毫升）加入后1小时，细胞的进一步4小时培养。细胞标记，然后与CD8 PerCP（用于煤制油）或CD56- PE的和CD3- PerCP和死亡细胞的鉴别（Miltenyi公司生物技术）的NK细胞培养，并在1％PFA固定。分析是由门对CD8人口（CTL）的CD56的+已经或人口，不包括标有死细胞鉴别和FL3通道（NK细胞）外周血CD3细胞。对于细胞内干扰素- G的测定，细胞被视为以上，其中0.3％皂素permeabilised
并贴上干扰素的G - FITC标记（蓝光Pharmingen公司）前流式细胞仪分析。
51Chromium细胞毒试验
CTL的细胞毒性测定采用标准的4小时51Cr法[21]对梅尔- 888或无关的卵巢癌SKOV- 3的目标。裂解百分比计算公式为：％溶解= 100 ×（CPM的实验 -CPM的自发释放）/ CPM的最大释放-CPM的自发释放。
结果
呼肠病毒感染的黑色素瘤细胞分泌趋化因子IP - 10和IFN- ß
之前我们已经表明，呼肠病毒感染的人类黑色素瘤细胞株可能会诱导细胞死亡的免疫原性，伴随着中RANTES（CCL5的）、IL - 8、MIP- 1A型（CCL3）和MIP- 1ß（CCL4）的释放。此外，以病毒感染的黑色素瘤细胞脉冲作用于树突细胞，会分泌趋化因子CCl2，3，4，5，7，8，11（嗜酸细胞激活趋化因子）和CXCL10（IP - 10），而这些细胞培养的上清液会诱导NK细胞的趋化。
我们首次测试了黑色素瘤细胞株中趋化因子的大范围分泌，试图以评估其对直接病毒感染的应答。
曾观察到通过直流脉冲reovirus-infected的Mel888细胞会分泌IFN-ß(但不是IFN-α)，我们也测试过reovirus-infected黑色素瘤细胞中1型IHN的产量。
在此前的IFN- 的（但不是干扰素- ）由直流呼肠病毒感染的Mel888观察细胞分泌的脉冲，我们还测试1型呼肠病毒感染的黑色素瘤细胞干扰素的生产。虽然有缺陷的抗病毒干扰素对肿瘤细胞的溶瘤病毒的反应可以解释肿瘤特异性溶瘤，这种反应可能不会完全废止。干扰素，特别是B可能在肿瘤微环境功能重要，因为它由reovirusinfected Mel888负载直流分泌激活，增强NK细胞的细胞毒作用。
除了趋化因子RANTES和MIP- 1A型和MIP-1β和IL- 8，我们发现趋化因子和IP- 10（但不重态CCl2，第7和
8 -数据未显示在所有四个细胞系）进行测试。的趋化因子水平相对较低（图1A），而IP - 10的是在所有细胞系（图1B）分泌较高水平。趋化因子是一种趋化因子CC家族的成员，可以有选择地聘请嗜酸性粒细胞，并已增加生存相关的一系列的癌症。的IP- 10是一种趋化因子，并为单核细胞，T淋巴细胞和NK细胞，这些细胞已被证实在体内引起免疫介导的抗肿瘤效应细胞趋化。
1型干扰素是由正常细胞分泌的削弱
病毒性感染，影响和调解多个先天和适应性反应，包括表型和功能成熟的DC在抗肿瘤免疫防御机制中的职能。干扰素在肿瘤细胞功能失调性途径已被提议作为其中一个复制和细胞裂解的病毒，如水泡性口炎病毒（VSV），牛痘病毒（维维），麻疹和NDV仅限于在溶瘤病毒治疗肿瘤细胞的机制。此外，干扰素- B已经进入溶瘤病毒基因工程，以改善与正常和恶性细胞的治疗指数，并支持抗肿瘤免疫启动。因此，我们测试是否1型干扰素是由呼肠病毒感染的黑色素瘤细胞分泌，并发现，干扰素- B型（图1C），但不干扰素一（数据未显示），是生产的全部4个细胞系。这些数据表明，黑色素瘤细胞趋化因子呼肠孤病毒感染引起发炎的免疫效应细胞的招聘能力，以及γ- B，它可以支持抗肿瘤免疫吸溶瘤病毒治疗的范围内。
呼肠孤病毒感染激活黑色素瘤细胞NF -？乙导致的趋化因子/细胞因子的分泌
接下来，我们研究了趋化因子/细胞因子产生的黑色素瘤细胞的参与下呼肠病毒感染的信号通路。我们着重对NF -？乙，作为呼肠孤病毒感染诱导的NF -？乙核易位激活HeLa细胞的促凋亡基因的表达。此外，趋化因子/在这个系统产生细胞因子如IL - 8，数，RANTES和干扰素- B的，是已知的NF -？乙依赖基因。核因子-？乙居住在一个无效的细胞质结合的形式与I - B君接着我-？乙降解和NF -？的核乙translocates启动转录。所以，I？乙退化和增加表达的p65的NF -？B的核分数亚基可作为对NF -？乙激活使用的间接指标。在所有4个黑色素瘤细胞的I -？乙退化是在16呼肠孤病毒感染，这与在核p65的增加同时发生小时观察线的NF -？B表达（图2A，B）的。要确认的NF -？B的角色，我们作为代表趋化因子/细胞因子IL - 8和IFN - B和预处理的黑色素瘤细胞系的NF -？B小分子抑制剂凯普[34]同前呼肠病毒感染。在所有细胞株前用50μM的凯普孵化导致IL - 8水平显着跌幅在所有剂量使用的呼肠病毒性（P“0.05）（图2c）。干扰素- B的分泌类似的抑制，观察以下凯普前处理（未显示）。两者合计这些数据证实，呼肠孤病毒感染诱导黑色素瘤细胞的NF -？乙激活趋化因子和细胞因子启动转录。

趋化因子和呼肠孤病毒感染的黑色素瘤细胞介导的细胞因子的产生是由一个巴基斯坦卢比依赖的途径

双链RNA的基因组是由呼肠孤病毒数它可以激活多种信号通路的分子细胞检测。经确定，呼肠孤病毒感染诱导的NF - B活性，接下来我们试图找出上游调节因子可能提供的检测之间的双链RNA和NF - B活性的链接。一个主要的候选人是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶PKR的，其中结合，由，双链RNA激活。巴基斯坦卢比可以通过抑制翻译起始因子的起始因子- 2A和rasrelated缺陷巴基斯坦卢比信号已在呼肠孤病毒复制和肿瘤特异性溶瘤病毒牵连磷酸化的翻译。巴基斯坦卢比也参与了抗病毒1型干扰素反应，这至少在我们的系统部分功能，如干扰素分泌展示- B的呼肠病毒感染后（图1C）。值得注意的是，公正党参与了典型的NF - B信号转导通路，可通过诱导的I-二磷酸化的NF - B活性.我们调查的炎性趋化因子/由呼肠病毒感染的细胞因子分泌的黑色素细胞巴基斯坦卢比的作用，再次使用读数IL-8/IFN-b为代表。Western blot分析初步证实，所有细胞系表达的基准水平和磷酸化的总巴基斯坦卢比，这没有改变呼肠孤病毒感染（数据未显示）。细胞，然后预先处理与巴基斯坦卢比抑制剂2- AP的前呼肠孤病毒感染与IL - 8的大幅减少性（P“0.05）（图3A）和IFN- B型（未显示）在3个4细胞观察线。为了进一步证实这些结果，我们使用专门的siRNA表达巴基斯坦卢比击倒。梅尔- 624细胞被利用，以下初步优化研究，因为这些被发现有4个细胞系的转染效率最高（数据未显示）。巴基斯坦卢比的siRNA减少约50％的总PKR的表达较对照siRNA处理的细胞（图3B）。这是发现关联击倒为近似40％的IL - 8的分泌减少24小时后呼肠感染（P“0.05）（图3c）。这些数据证实了巴基斯坦卢比作用，除了与NF- B，在炎性趋化因子诱导/对呼肠孤病毒感染和溶瘤细胞因子.
病毒过滤从reovirustreated黑色素瘤细胞瘤（reoTCM）条件培养基诱导的NK细胞和CTL细胞趋化反应区

先前发现的部件，如按揭保险计划的reoTCM- 1A型，和MIP-1β，RANTES的，[7]，图1B）是一种免疫细胞趋化多种类型。我们测试是否reoTCM能诱导免疫效应相关细胞（NK细胞，直流，CTL）的趋化反应。为了解决潜在的趋化因子和细胞因子的病毒本身的直接后果独立免疫旁观者效应，reoTCM是通过一个ViresolveNFR过滤器，呼肠孤病毒被成功切除一个对L929细胞的负斑法（数据未显示）确认。
NK细胞迁移隔离积极向reoTCM（图4a），在一个约2-3倍，增加移民中的34细胞系（P“0.05）进行。类似的趋化反应，观察与reoTCM从三个相同的细胞系（P“0.05）（图4B），推导了直流。抗肿瘤效应CTL的产生，在选举事务处启动感染梅尔- 888出现了类似的结果（图4C），在细胞迁移升幅分别为MeWo观察，SKMEL- 28性（P“0.05）和梅尔- 888（虽然这没有达到统计学意义）。梅尔- 624 reoTCM不能诱导在任何类型的细胞趋化反应明显。有趣的是，该细胞系表现出的MIP- 1a的较低水平和MIP- 1B和IP - 10的分泌呼肠孤病毒感染后（[7]，图1B）。虽然这些数据并不精确定义单/多趋化因子的趋化负责，他们表明，NK细胞和CTL直流对黑色素瘤是积极进行reoviral迁移诱导的细胞死亡细胞的能力。
从呼肠孤病毒治疗的黑色素瘤细胞表型和功能ReoTCM诱导的NK细胞的活化

在我们实验室先前的工作已经证明，γ-分泌直流b呼肠病毒感染加载梅尔- 888刺激NK细胞活性对黑色素瘤的目标[14]细胞。经证明，reoTCM包含干扰素- B和该病毒可免费reoTCM的免疫效应细胞趋化因子（图1C，4A）条，我们研究了关于对NK细胞的活化和天生的抗肿瘤免疫吸了reoTCM免疫原性的潜力。文化在梅尔- 888 reoTCM上调表达的NK细胞活化标志CD69的（图5a）和NK细胞脱颗粒和干扰素-克（图5b）继合作和Mel- 888的目标培养分离NK细胞水平的提高。 ReoTCM处理NK细胞脱颗粒也表现出对K562目标（虽然没有在目标的缺席 -数据未显示）显示了这种先天反应的非特定的性质。因此，促炎症环境由呼肠病毒感染引起的黑色素瘤细胞的能力，即使在复制的裂解活性和细胞内诱导干扰素活化NK细胞中的病毒，庚型，缺失，从而有可能支持在治疗先天性抗肿瘤作用肿瘤。
肿瘤细胞培养的脉冲总理在reoTCM人天真抗树突状细胞的黑色素瘤的CTL

我们以前曾表明，reoTCM可诱导成熟的DC表型，而直流装有感染梅尔- 888细胞在呼肠孤病毒的继续存在肿瘤特异性CTL可以首相。为了解决自适应virusfree reoTCM免疫潜能，培养于reoTCM直流（或从感染非reoTCM控制中），和Mel- 888细胞负载，并添加到外周血。其抗肿瘤的CTL超过14天的一代当时评定为文献[13]。 PBMC增殖测定采用台盼蓝排斥，确定可行的细胞数量，并在reoTCM吸比非reoTCM控制（图6A）文化更大。此外，这种扩散是与干扰素在吸上清克的水平的提高，具有适应不断变化的Th1型T细胞反应（图6b）相一致。铬细胞毒试验来确定的CTL细胞溶解能力的reoTCM和非reoTCM治疗的肿瘤产生的直流负载。虽然一些具体的反Mel888 CTL活性直流条件下nonreoTCM看到，杀水平显着较高时reoTCM空调直流分别为CTL的启动使用（约70％与30％相比，溶解）性（P“0.05）（图6c） 。没有不相干的卵巢癌SKOV- 3杀伤肿瘤指标进行了观察。此外，CD107的CTL细胞脱颗粒及干扰素- g在对Mel888目标（但不是卵巢癌SKOV- 3，数据未显示），存在，也高于后reoTCM吸相比，其非reoTCM同行（图6D条）。虽然这些毒性实验没有解决的MHC I类限制或抗原特异性杀（这是潜在的混杂因素时，以此作为人类的CTL吸异体抗原的肿瘤细胞源线），曾表明我们在这个系统，具体的反- Mel888的CTL细胞，包括T识别肿瘤相关抗原集市- 1 [12,13]，表明这些对策包括相关抗原的抗肿瘤靶向治疗。因此，除了先天激活NK细胞活性antimelanoma，无病毒reoTCM能够支持一个特定的适应CTL反应的有效启动。
讨论
呼肠病毒是一种肿瘤特异性溶瘤病毒在临床研究[39,40]目前。我们和其他人，已经表明，呼肠病毒是几种治疗病毒可通过其活动的抗肿瘤免疫反应介导的激活，以及直接溶瘤病毒复制的作用于肿瘤细胞之一[10]。无论是对病毒的免疫反应治疗是有问题，由于快速的代理系统失活，或积极治疗，通过一个'危险'信号的规定，否则免疫抑制肿瘤内的微环境，可能对多种因素而定。这些措施包括病毒交付（intratumoural与静脉注射）的路线，以前存在的免疫状态的病人和病毒的机制，自然，或通过基因改造，目标肿瘤细胞。因此，各种免疫策略已被用来改善溶瘤病毒治疗，从免疫范围，以改善血液循环病毒持续存在[41]，通过对免疫活性增强，如GMCSF通过转基因，插入到病毒基因组中，[42] 。
之前我们已经表明，我）呼肠孤病毒诱导人黑色素瘤细胞凋亡的死亡和死亡，这是与炎症趋化因子/细胞因子的分泌有关[7]，二）呼肠孤病毒直接激活肿瘤细胞的情况下直流[11]，和三）reovirusinfected能激活黑色素瘤细胞的抗肿瘤免疫反应[12-14]先天免疫和适应性武器。然而，这些数据中产生的活性病毒的继续存在。由于本身是直接呼肠孤病毒免疫刺激[11]，从reoTCM通过过滤清除病毒，专门调查，使我们的额外的，旁观者可能在治疗肿瘤的炎症环境产生免疫效果。人类reoviral治疗免疫成分可能有呼肠孤病毒复制水平，因为在新鲜切除黑色素瘤细胞的特殊的临床相关性，可能是低[7]。此外，从抑制炎症肿瘤切换到环境可能持续，即使病毒已被清除[43]。
我们扩大了我们的趋化因子和呼肠孤病毒感染人类的细胞因子产生的黑色素瘤线前面的分析，并表明趋化因子和IP- 10还分泌（图1）。有趣的是，我们也发现干扰素- B的（但不是干扰素- a）根据这些条件，这说明，反病毒1型干扰素反应在这些部分肿瘤细胞的功能。这是特别为干扰素- B的重要的是先天免疫的活化有关直流装有呼肠病毒感染的细胞[14]。此外，干扰素- B已经被设计成其他溶瘤病毒的增加和正常细胞之间的恶性的治疗指数，增强抗肿瘤免疫激活[30]。
虽然机制的肿瘤细胞炎症反应的呼肠病毒感染的责任人至今没有解决，以前的研究，因为我有牵连的NF -？B的角色）呼肠病毒感染引发的p50/p65的NF -？B亚基到易位细胞核并激活促凋亡基因的表达[32,44]，二）呼肠孤病毒诱导黑色素瘤细胞凋亡[7]，及iii）的NF -？B在趋化因子和细胞因子如IL - 8和参与生产干扰素- B的[33]。这项研究证实，呼肠孤病毒感染激活黑色素瘤细胞的NF -？乙，正如我评估-？乙p65的降解和核积累，并封锁与小分子抑制剂凯普的NF -？乙显着降低IL - 8的生产和干扰素- B（图2）。重要的是，这种效果是在所有4个细胞系，这表明共同的信号通路被激活后黑色素瘤呼肠孤病毒感染。为了解决病毒的检测和信号分子，可能在于上游的NF -？B，我们研究了IL - 8和干扰素- B对巴基斯坦卢比生产的依赖作为候选双链RNA的传感器数量之一。巴基斯坦卢比参与了肿瘤特异性溶瘤的reoviral（但确切机制尚未完全阐明），以及抗病毒1型干扰素反应[35]。我们发现，通过小分子封锁和siRNA敲除，即公正党是在黑色素瘤细胞的炎症反应呼肠孤病毒感染后（图3）参与。虽然我们已全部或磷酸巴基斯坦卢比无法检测到任何重大变化后黑色素瘤细胞系呼肠病毒感染（数据未显示），这些数据表明，到巴基斯坦卢比启动的NF -？乙依赖趋化因子和细胞因子活化双链RNA在肿瘤检测细胞。这些发现与以前的意见一致后直流[11]直接感染。然而，进一步的工作是要充分刻画信号通路为呼肠孤病毒诱导肿瘤细胞免疫原性溶瘤性负责。
过滤reoTCM诱导NK细胞趋化反应中，DC和抗肿瘤的CTL（以前使用呼肠病毒引感染肿瘤细胞）（图4），表明在治疗肿瘤免疫环境有潜在的招募范围内的免疫细胞的能力病毒检测和先天/自适应效应功能。关于改善催芽的CTL进入肿瘤，这一发现与先前的小鼠显示肿瘤溶瘤内发生VSVmediated继转移更多的持久性抗原特异性T细胞的数据相一致[45]。迄今为止，我们还没有具体确定哪些分泌趋化因子（S）的NK细胞，DC和CTL的迁移工作。这可能是多个行为结合趋化因子可能参与了受体诱导多种特殊的生理反应[16]。对reoTCM能够支持先天激活（图5）和自适应（图6）对人黑色素瘤细胞的免疫反应表明，呼肠孤病毒诱导细胞死亡的免疫效果是不存在的病毒继续依赖曾经是一个危险的信号启动已经交付。因此，即使患者病毒复制是有限的，例如中和后，重复给药[46]，肿瘤细胞的免疫反应呼肠孤病毒感染可能是足以吸引持续抗肿瘤作用。
总体而言，目前的研究表明，人类黑色素瘤细胞呼肠病毒感染诱导的趋化因子和细胞因子能够诱导NK细胞中，直流趋引的CTL反应和范围。这种炎症反应时的NF - B和公正党的依赖，正在有足够的活病毒的情况下，支持先天和适应性抗肿瘤免疫启动。该数据支持了旁观者人类抗癌免疫激活肿瘤细胞的杀伤呼肠孤病毒的潜力，即使病毒持续复制是由抗病毒免疫反应有限。