转录组数据分析揭示非洲猪瘟病毒感染后的宿主免疫应答机制及关键效应因子.pdf

Vol.9 No.4Aug.2023生物化工Biological Chemical Engineering第 9 卷 第 4 期2023 年 8 月文章编号：2096-0387（2023）04-05转录组数据分析揭示非洲猪瘟病毒感染后的宿主 免疫应答机制及关键效应因子陈涛1，苟士学2，郑伟1，金银戈1，蒋美玲1，罗贤1，周小青1*（1.五邑大学 生物科技与大健康学院，广东江门 529020；2.中国科学院 广州生物医药与健康研究院，广东广州 510530）摘 要：目的：利用生物信息学和公共转录组数据揭示非洲猪瘟病毒（African Swine Fever Virus,ASFV）感染后宿主的免疫应答机制，并筛选出潜在的关键效应因子。方法：使用数据集GSE132905进行差异分析，对差异基因进行聚类和功能富集分析，并对聚类基因进行蛋白互作网络分析。结果：共鉴定出 918 个差异基因；富集分析结果表明这些基因与干扰素的生成、先天免疫反应、抗病毒机制等通路相关；蛋白互作网络分析鉴定出9个关键基因，这些基因在对抗病毒感染的过程中扮演着重要的角色。结论：通过生物信息学分析和蛋白互作数据库筛选，可鉴定出有助于揭示 ASFV 潜在致病机制的关键基因，为 ASFV 的疫苗和药物开发提供新的候选靶点。关键词：非洲猪瘟病毒；生物信息分析；差异基因；蛋白互作网络；基因表达综合数据库中图分类号：S852.65 文献标识码：ATranscriptomeDataAnalysisRevealstheHostImmuneResponseMechanismandKeyEffectorFactorsafterAfricanSwineFeverVirusInfectionCHEN Tao1,GOU Shixue2,ZHENG Wei1,JIN Yinge1,JIANG Meiling1,LUO Xian1,ZHOU Xiaoqing1*(1.School of Biotechnology and Health Sciences,Wuyi University,Jiangmen 529020,China;2.Guangzhou Institutes of Biomedicine and Health,Chinese Academy of Sciences,Guangzhou 510530,China)Abstract:Objective:The aim of this study is to use bioinformatics and public transcriptome data to reveal the mechanism of host immune response to African swine fever virus(ASFV)infection,and to screen out potential key effectors.Methods:Firstly,the data set GSE132905 is used for differential analysis,then clustering and functional enrichment analysis are performed for differential genes,and finally,protein interaction network analysis is performed for clustering genes.Results:A total of 918 differential genes are identified.Enrichment analysis show that these genes are related to interferon production,innate immune response,antiviral mechanism and other pathways.Protein interaction network analysis identify nine key genes that play important roles in the fight against viral infection.Conclusions:Through bioinformatics analysis and protein interaction database screening,key genes contributing to the potential pathogenesis of ASFV can be identified,providing new candidate targets for vaccine and drug development of ASFV.Keywords:African swine fever virus;bioinformation analysis;differential gene;protein interaction network;Gene Expression Omnibus非 洲 猪 瘟（African Swine Fever，ASF）是 一 种高传染性出血性疾病，主要感染对象是家猪和野猪。猪感染 ASF 后的临床症状表现不尽相同，从死亡率100%的急性症状到慢性甚至无症状均有1。非洲猪瘟病毒（African Swine Fever Virus，ASFV）是一种具有包膜的大型 DNA 病毒，是非洲猪瘟病毒科非洲猪瘟病毒属的唯一成员。ASFV 基因组信息量巨大，具有颗粒结构复杂、免疫逃逸手段多样高效、定期重组自身基因组等特点，这些都给疫苗的研制造成了很大困难2。迄今为止，人们还没有研发出可用于预作者简介：陈涛（1997），男，安徽阜阳人，硕士在读，研究方向为生物信息学。通信作者：周小青（1988），女，湖南长沙人，博士，讲师，研究方向为基因编辑、干细胞。E-mail：。16生物化工2023 年防或治疗非洲猪瘟的有效疫苗和抗病毒药物，因此对 ASFV 的传染机制和致病机制进行深度探索具有十分重要的意义3。本研究利用生物信息学方法，对非洲猪瘟感染样本的转录组数据进行分析，旨在探究与非洲猪瘟感染机制和致病机制相关的关键基因，为ASFV 的疫苗和药物开发提供新的候选靶点。1 材料与方法1.1 数据来源基因表达综合（Gene Expression Omnibus，GEO）公共数据库（https:/www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）收录了全世界大部分的表达谱数据及高通量测序数据。本研究通过筛选下载了 GSE132905（GPL26793）的转录组数据，该数据包含感染 ASFV 后 3 h、6 h、9 h、12 h、15 h、18 h 的 6 个时间点的转录组数据，每个时间点有 3 个重复。1.2 主成分分析本研究利用主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）对各时间样本之间的情况进行分析。PCA 是一种常用的多元数据分析方法，在生物信息学领域中被广泛应用。它可以将高维数据映射到低维空间，并保留数据的主要特征。这种方法可以用于寻找数据的主要变化模式，帮助研究人员更好地理解数据。1.3 差异基因针对 GSE132905 数据，首先根据 GPL26793 平台提供的注释文件，将探针 ID 转换为对应的基因 ID，并根据数据集中提供的差异倍数值|log FC|1 作为条件筛选差异基因。1.4 聚类分析本研究所选择的数据集中的所有样本都是以不同时间点为实验条件进行测序的，所以可以选择采用基于时间变量的聚类分析模块 DEG-Patttern 分析方法进行差异基因的分析，该分析是使用 DEGreport包中的 degPatterns 函数区分差异基因的不同表达模式。1.5 功能富集分析为了描述感兴趣基因列表的分子功能或通路，使用 gprofiler2 进行功能富集分析。gprofiler2 是一个生物信息学工具包，用于对基因和蛋白质序列进行功能和富集分析，它可以帮助研究人员在大规模基因表达数据中寻找生物学过程、代谢途径、信号通路等方面的富集。1.6 PPI 互作网络分析为了探究关键基因潜在的相互作用，对各时间点的差异基因取交集，并将交集基因上传到 STRING 数据库（https:/cn.string-db.org/）构建蛋白质互作网络（PPI）的可视化结果。2 结果与分析2.1 差异分析对数据集中的各样本进行主成分分析（PCA），结果表明感染初期的样本较集中，感染后期的样本聚类较集中，反映出实验样本具有可靠性（图 1）。根据|log FC|1 的条件筛选得到 918 个差异基因，并以柱状图的形式展示各时间点的差异基因数量，发现差异基因主要集中在感染后期，说明感染的时间越长，样本之间的差异越大，差异基因的数量越多（图 2）。图 1 主成分分析图差异基因数图 2 差异基因柱状图第 4 期17陈涛等：转录组数据分析揭示非洲猪瘟病毒感染后的宿主免疫应答机制及关键效应因子2.2 聚类和富集分析对筛选得到的差异基因，使用DEGreport包（https:/rdrr.io/github/lpantano/DEGreport/man/degPatterns.html）的 degPatterns 函数进行 DEG-Pattern 聚类分析，聚类结果显示聚类 4 的 535 个基因和聚类 2 的 258 个 基因表达分为两个趋势：一种是随着感染时间的增加，基因的表达逐渐下调；另一种是随着时间的增加，基因的表达逐渐上调，说明该部分的基因具有研究意义（图 3、图 4）。然后利用 gprofiler 包4中的 gost 函数对聚类中的差异基因进行富集分析，富集分析结果发现聚类 4 的基因主要与抗病毒反应和免疫反应等通路相关，符合在感染初期由于病毒的入侵迅速激起免疫反应，而随着感染时间的增加，病毒会对免疫系统产生影响从而降低基因的表达。聚类 2 的基因主要与免疫细胞的增殖相关，猜测是由于随着感染时间的增加，体内病毒载量增加，生物体会促进免疫细胞的增殖（图 5、图 6）。Z-基因丰度评分图 3 DEG-Pattern 聚类 2 结果图Z-基因丰度评分图 4 DEG-Pattern 聚类 4 结果图图 5 DEG-Pattern 聚类 2 富集分析图图 6 DEG-Pattern 聚类 4 富集分析图2.3 关键基因筛选对各时间点的差异基因取交集，共获得 12 个关键基因，表明这些基因参与病毒入侵的全程，对于病毒入侵机制的研究具有一定的意义。用柱状图对这些基因在各时间的表达进行展示，发现基因的表达与聚类的结果一致。UBE2L6、ISG15、ISG20、HERC6基因的表达在感染初期逐渐升高，随后保持不变；APOL3、IL1RN、DOX58、IFIT1、IFIT2、RSAD2、RHPN2、CXCL10 基因的表达在感染的初期高表达，随着感染时间的增加表达逐渐降低，猜测这部分基因可能在感染初期产生反应，基因的表达快速升高，随着感染时间的增加，病毒对免疫系统产生影响，导致基因的表达下调（图 7）。3h6h9h12h15h18h3h6h9h12h15h18h3h6h9h12h15h18h3h6h9h12h15h18h3h6h9h12h15h18h3h6h9h12h15h18h图 7 关键基因在各实验组的表达图18生物化工2023 年2.4 关键基因鉴定利用 STRING 蛋白互作网络在线数据库（https:/cn.string-db.org/）分析筛选得到的 12 个关键基因潜在的相互作用。蛋白质互作网络图（图 8）结果表明，在 12 个关键基因中有 9 个关键基因存在相互作用，这 9 个 基 因 分 别 是 IFIT1、IFIT2、ISG15、ISG20、CXCL10、DDX58、HERC6、UBE2L6、IRG6（RSAD2）。查阅 NCBI 数据库发现，这 9 个基因的表达主要与细胞的抗病毒作用和先天免疫反应及免疫细胞的增殖相关：IFIT1、IFIT2 是编码干扰素诱导的四肽重复蛋白；ISG15、ISG20 是干扰素刺激基因，与免疫系统的信号通路相关；HERC6、UBE2L6 是泛素酶，与免疫蛋白的合成相关；CXCL10 是编码趋化因子，与 NK细胞、T 细胞的迁移相关；DDX58 可编码 RNA 受体RIG-I，与先天免疫系统和干扰素的产生相关；IRG6（RSAD2）可编码抗病毒蛋白，能够在细胞抗病毒反应和先天免疫中发挥作用。图 8 关键基因蛋白互作网络分析图3 讨论综合当前的研究发现，干扰素相关基因在宿主抵抗病毒时发挥着至关重要的作用3,5。HEIDEGGER等6 揭示了 DDX58 编码的 RNA 受体 RIG-I 蛋白能够诱导促炎性细胞因子和 IFN-I 产生；PICHLMAIR 等7发现 IFIT 家族蛋白能够调节转录起始、细胞增殖与细胞迁移等多种生命活动；BOGUNOVIC 等8发现干扰素刺激基因 ISG15、ISG20 能够刺激 T 淋巴细胞与 NK 细胞释放 IFN-，在抵抗病毒、细菌等先天免疫和适应性免疫中发挥重要作用；FREITAS 等9发现病毒在复制的过程需要泛素结合酶 E2 等多种酶的参与；GAO 等10证实 UBE2L6 可能被干扰素上调，从而产生抗病毒作用。本研究对公用数据库的数据进行挖掘，首先对数据进行主成分分析，发现感染后不同时间的样本聚类明显，反映了转录组数据的可靠性。使用差异分析和DEG-Pattern 聚类分析相结合，共筛选出 918 差异基因，对这些差异基因进行聚类分析，发现第一部分差异基因在刚感染时表达量增加，随着感染时间的增加表达量呈现逐渐减少的趋势，第二部分差异基因在感染后表达量呈现逐渐增加的趋势。对这两部分的差异基因进行富集分析，结果表明第一部分的差异基因主要与细胞的抗病毒反应及免疫反应等通路有关，第二部分的差异基因主要与免疫细胞的增殖通路有关。对不同时间点的差异基因取交集，得到了 12 个关键基因。将这些基因上传到 STRING 蛋白互作网络在线数据库进行分析，蛋白互作网络分析结果显示有 9个基因存在相互作用，并通过检索 NCBI 数据库发现这 9 个基因大多数都参与干扰素的生成、泛素酶的合成、先天免疫反应、抗病毒机制、病毒的复制、免疫细胞的增殖等。这些基因的异常表达很可能是由于非洲猪瘟病毒的入侵对其产生了干预。笔者筛选出来的多个表达异常的基因，如 DDX58、IFIT1、IFIT2、ISG15、ISG20 和 UBE2L6 等，已经在非洲猪瘟相关文献有过类似报道9，说明这些基因是研究非洲猪瘟感染机制和致病机制的潜在靶点基因。综上所述，通过生物信息学分析和蛋白互作数据库筛选，可鉴定出有助于揭示 ASFV 潜在感染机制和致病机制的关键基因，为 ASFV 的疫苗和药物开发提供新的候选靶点。虽然本研究得到的关键基因需要进一步通过实验进行验证，但基于数据库进行的生物信息学的数据挖掘还是提供了可靠的方法，缩小了对于关键基因的筛选范围，节省了大量的资源成本和人力成本。参考文献1 伍 国 军.防 控 非 洲 猪 瘟,助 力 乡 村 振 兴 J.农 业 开 发 与 装备,2022(12):241-242.（下转第30页）30生物化工2023 年的影响 J.饲料研究,2022,45(17):17-21.12 沈玲,张均田.人参增强免疫研究新进展 J.中草药,1996,27(8):499-502.13 徐俞悦,尹超,陈波,等.人参超微粉对正常和免疫力低下小鼠免疫功能的影响 J.中国现代应用药学,2018(11):1665-1669.14 LIOU C J,HUANG W C,TSENG J.Long-term oral administration of ginseng extract modulates humoral immune response and spleen cell functionsJ.American Journal of Chinese Medicine,2005,33(4):651-666.15 郭奕维,郭秀臣,张静波,等.人参皂苷 Rg3 增强 PD-1 抑制剂对弥漫大 B 细胞淋巴瘤免疫治疗作用的体外研究 J.中医药学报,2018,46(5):24-29.16 郑厚胜,郑斯文,王英平,等.人参皂苷 Rg3 对环磷酰胺致免疫功能低下小鼠的免疫调节作用 J.中成药,2021,43(11):3202-3206.17 何昕.人参皂苷 Rg3 对食管癌放疗患者体外免疫增强作用的探讨 J.实用中西医结合临床,2022,22(18):1-4.18 MA X,CHI X,YUAN L,et al.Immunomodulatory effect of ginseng stem-leaf saponins and selenium on Harderian gland in immunization of chickens to Newcastle disease vaccineJ.Veterinary Immunology and Immunopathology,2020,225:110061.19 张双庆,崔亚娟,张彦,等.保健食品检验与评价技术指南 M.北京:北京科学技术出版社,2017.20 涂玥,倪光夏,万毅刚,等.经典名方及其有效成分调节免疫衰老的作用机制研究进展J.中国实验方剂学杂志,2021,27(18):190-197.21 付颖.中药富硒酵母复合物的功能作用研究 J.山东化工,2020,49(23):57-59.22 辛成龙.富硒酵母破壁灵芝孢子粉的功能及安全性研究 J.生物化工,2020,6(6):1-5.23 ZHANG S Q,ZHANG H B,ZHANG Y.Quantification of selenomethionine in plasma using UPLCMS/MS after the oral administration of selenium-enriched yeast to ratsJ.Food Chemistry,2018,241:1-6.24 HAMAD A,KRISHAN M M,HEJAZIN R K,et al.The relative bioavailability of sodium selenite and high selenium yeast in humanJ.Pakistan Journal of Nutrition,2009,52(7):7653-7668.2 ARIAS M,JURADO C,GALLARDO C,et al.Gaps in African swine fever:analysis and prioritiesJ.Transboundary&Emerging Diseases,2018,65(S1):235-247.3 佚名.研究揭示非洲猪瘟病毒抑制宿主天然免疫应答新机制 J.甘肃畜牧兽医,2021,51(7):21.4 RAUDVERE U,KOLBERG L,KUZMIN I,et al.g:Profiler:a web server for functional enrichment analysis and conversions of gene lists(2019 update)J.Nucleic Acids Reserach,2019,47(W1):W191-W198.5 董慧君,李彤,庄辉,等.干扰素刺激基因与新型冠状病毒相互作用的研究进展 J.微生物学报,2023,63(4):1329-1339.6 HEIDEGGER S,WINTGES A,STRITZKE F,et al.RIG-I activation is critical for responsiveness to checkpoint blockadeJ.Blood,2019,134(S1):624.7 PICHLMAIR A,LASSNIG C,EBERLE C A,et al.IFIT1 is an antiviral protein that recognizes 5-triphosphate RNAJ.Nature Immunology,2011,12(7):624-630.8 BOGUNOVIC D,BOISSON-DUPUIS S,CASANOVA J L.ISG15:leading a double life as a secreted moleculeJ.Experimental&Molecular Medicine,2013,45(4):e18.9 FREITAS F B,FROUCO G,MARTINS C,et al.African swine fever virus encodes for an E2-ubiquitin conjugating enzyme that is mono-and di-ubiquitinated and required for viral replication cycleJ.Scientific Reports,2018,8(1):3471.10 GAO J,LI C,LI W,et al.Increased UBE2L6 regulated by type 1 interferon as potential marker in TBJ.Journal of Cellular&Molecular Medicine,2021,25(24):11232-11243.（上接第 18 页）