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实验肿瘤学基本概念实验肿瘤学基本概念医学全在线医学全在线 肿瘤发生发展的一般过程肿瘤发生发展的一般过程正常细胞正常细胞 癌细胞癌细胞 原位癌原位癌 浸润癌浸润癌 转移癌转移癌 休休 眠眠 预防预防 诊断诊断 治疗治疗肿瘤细胞的生物学特点肿瘤细胞的生物学特点自我满足的生长信号自我满足的生长信号 对生长抑制信号不敏感对生长抑制信号不敏感 逃避凋亡逃避凋亡 无限增殖的潜能无限增殖的潜能 血管生成血管生成 浸润和转移浸润和转移实验肿瘤模型的要求实验肿瘤模型的要求忠实地重现人类肿瘤的生物学特性忠实地重现人类肿瘤的生物学特性实验肿瘤学的研究方法实验肿瘤学的研究方法直接研究直接研究建立细胞系建立细胞系建立动物模型建立动物模型细胞系的基本概念细胞系的基本概念组组织织培培养养和和细细胞胞培培养养：模模拟拟体体内内环环境境在在体体外外培培养养机机体体组组织和细胞，使之生存和生长。织和细胞，使之生存和生长。原原代代培培养养（primary primary cultureculture）:从从体体内内取取出出组组织织和和细细胞胞的的第一次培养。第一次培养。传传代代（passagepassage）：细细胞胞长长满满培培养养瓶瓶后后，细细胞胞分分成成2-32-3瓶瓶继继续培养。续培养。细细胞胞系系（cell cell lineline）:原原代代培培养养细细胞胞首首次次传传代代成成功功后后的的细细胞胞，称称细细胞胞系系。Finite Finite cell cell line,line,continuous continuous cell cell line,established cell lineline,established cell line细细胞胞株株(cell(cell strain):strain):通通过过选选择择或或克克隆隆，从从亲亲代代细细胞胞系系选选出的带有特定标志的细胞群。出的带有特定标志的细胞群。瘤株：在动物体内可传代的肿瘤细胞系。瘤株：在动物体内可传代的肿瘤细胞系。ATCC American Type Culture Collection ATCC American Type Culture Collection 美国模式培养美国模式培养物收集中心物收集中心,美国菌种保存中心美国菌种保存中心培养细胞的生长方式培养细胞的生长方式贴附生长型细胞：细胞附着于支持物表面生长。贴附生长型细胞：细胞附着于支持物表面生长。上上皮皮细细胞胞型型：来来源源于于外外胚胚层层和和内内胚胚层层的的细细胞胞，细细胞胞为为扁扁平平多多角形，细胞之间紧密相靠成片。角形，细胞之间紧密相靠成片。成成纤纤维维细细胞胞型型：来来源源于于中中胚胚层层的的细细胞胞，细细胞胞呈呈梭梭形形，排排列列成成漩状、放射状、栅栏状。漩状、放射状、栅栏状。悬浮生长型：造血系统的细胞悬浮生长型：造血系统的细胞培养细胞的生长特点培养细胞的生长特点贴贴附附生生长长：支支持持物物可可为为玻玻璃璃、塑塑料料、胶胶原原、其其他他细细胞胞等等。停停泊泊或贴壁依赖性细胞（或贴壁依赖性细胞（anchorage-dependent cell)anchorage-dependent cell)接接触触抑抑制制(contact(contact inhibition)inhibition)：正正常常细细胞胞相相互互接接触触后后，细细胞胞将向另一个方向移动，从而使细胞不会重叠生长。将向另一个方向移动，从而使细胞不会重叠生长。密密度度抑抑制制(density(density inhibition)inhibition)：正正常常细细胞胞汇汇合合成成片片后后细细胞胞分分裂裂停停止止，在在静静止止状状态态下下细细胞胞存存活活一一段段时时间间 汇汇合合 confluentconfluent培养条件培养条件基基本本营营养养成成分分 RPMI1640 RPMI1640 DMEM DMEM(Dulbeccos(Dulbeccos modified modified Eagle medium)Eagle medium)谷氨酰胺谷氨酰胺生生长长因因子子 小小牛牛血血清清 胎胎牛牛血血清清 灭灭活活补补体体 56 56 30min30min 环境环境 37 pH 7.2-7.4 37 pH 7.2-7.4 渗透压渗透压 无污染无毒无污染无毒 细菌、支原体细菌、支原体 体外培养的优点体外培养的优点优点：优点：1.1.活细胞，活细胞，2.2.对对象象均均匀匀，易易控控制制实实验验条条件件，易易于于观观察察和和纪纪录录实验结果实验结果 3.3.易易研研究究单单个个细细胞胞的的结结构构和和功功能能，易易于于进进行行分分子子生物学水平研究，生物学水平研究，4.4.实验周期短，成本低，细胞系可长期保存。实验周期短，成本低，细胞系可长期保存。体外培养的缺点体外培养的缺点 1.1.在体外细胞生物学行为与在体内不完全一样，在体外细胞生物学行为与在体内不完全一样，G1 G1 G0 G0 终末分化终末分化肿瘤细胞肿瘤细胞 M SM S介质细胞介质细胞 G2G22.2.转转化化（transformationtransformation）:在在体体外外培培养养过过程程中中细细胞的遗传性状发生变化。分为一般转化和恶性转化。胞的遗传性状发生变化。分为一般转化和恶性转化。一般转化：指细胞获得不死性。一般转化：指细胞获得不死性。恶恶性性转转化化：指指出出现现在在软软琼琼脂脂培培养养基基中中浸浸 润润生生长长；在在动动物物体体内内成成瘤瘤；血血清清依依赖赖性性降降低低；生生长长密密度度依依赖赖性降低。性降低。3.3.体外实验结果不能外推到体内实验体外实验结果不能外推到体内实验细胞培养的应用细胞培养的应用研究细胞与环境的相互作用研究细胞与环境的相互作用细胞间的相互作用细胞间的相互作用细胞内胞质活动细胞内胞质活动细胞质与细胞核之间的流动细胞质与细胞核之间的流动建立细胞系的基本要求建立细胞系的基本要求细胞在体外培养半年以上，生长稳定，保持细胞特征并能传细胞在体外培养半年以上，生长稳定，保持细胞特征并能传代。代。建系方法建系方法1.1.原原代代培培养养：无无菌菌操操作作，取取肿肿瘤瘤组组织织，切切成成小小片片，小小于于0.50.5毫毫米米，进进行行培培养养，或或用用胰胰酶酶、胶胶原原酶酶消消化成单细胞悬液，血清灭活酶，培养化成单细胞悬液，血清灭活酶，培养2.2.传传代代：待待细细胞胞长长满满培培养养瓶瓶，胰胰酶酶消消化化，按按1 1：2-32-3传代传代3.3.去除杂细胞去除杂细胞4.4.冻存细胞冻存细胞 10%DMFO+90%10%DMFO+90%胎牛血清，胎牛血清，4 4 30min,30min,-20-20 2hrs,2hrs,-70-70 过过夜夜,液氮，长期保存。液氮，长期保存。登记，定期复苏细胞。登记，定期复苏细胞。复苏：复苏：37 37 水浴，加培养基洗一次，培养水浴，加培养基洗一次，培养 5.5.鉴定鉴定鉴鉴 定定细胞形态观察细胞形态观察 癌细胞多角型，重叠生长，癌细胞多角型，重叠生长，核浆比例失调，多核巨细胞核浆比例失调，多核巨细胞染色体分析染色体分析 数量和核型、核带，标记染色体数量和核型、核带，标记染色体细胞生长曲线和细胞周期细胞生长曲线和细胞周期集落形成率集落形成率动物接种动物接种 成瘤，成瘤，组织形态学与原发肿瘤相似组织形态学与原发肿瘤相似污染污染 无病毒、支原体污染、细胞间交叉污染无病毒、支原体污染、细胞间交叉污染 Hela cell:1951Hela cell:1951年年 Henrietta Lack Henrietta Lack 宫颈癌宫颈癌 实验动物基础知识实验动物基础知识法法 规规19881988年年 中华人民共和国实验动物管理条例中华人民共和国实验动物管理条例19891989年年 医学实验动物管理实施细则医学实验动物管理实施细则19941994年年 关关于于在在全全国国医医疗疗卫卫生生系系统统实实行行实实验验动动物物合合格格证证制制度度得得通通知知 （医医学学实实验验动动物物合合格格证证书书，医医学学实实验验动动物物环环境境设设施施合合格格证证书书，医医学学实实验验动动物物全全价价营营养养饲饲料料合合格格证证书书，医医学学实验动物饲料生产条件合格证书）实验动物饲料生产条件合格证书）19881988年年 广东省实验动物管理办法广东省实验动物管理办法基本概念基本概念 实实验验动动物物（laboratory laboratory animalanimal）:指指人人工工培培育育的的、对对其其携携带带微微生生物物实实行行控控制制、来来源源清清楚楚、遗遗传传背背景景清清晰晰、可可用于科学实验得动物。用于科学实验得动物。实实验验用用动动物物（animal animal for for researchresearch）:能能用用于于科科学学实实验验的的动动物物，包包括括实实验验动动物物、野野生生动动物物、经经济济动动物物和和观观赏赏动动物。物。标标准准化化实实验验动动物物：有有明明确确的的遗遗传传背背景景、繁繁殖殖方方法法、饲饲养养环环境境、饲饲料料成成分分均均达达到到标标准准的的实实验验动动物物。在在科科学学研研究究中中必须使用标准化实验动物。必须使用标准化实验动物。实验动物的分类实验动物的分类(遗传背景遗传背景)近近交交系系（纯纯系系）：连连续续2020代代以以上上兄兄妹妹交交配配或或亲亲子子交交配配 而获得的遗传上达到一致的动物群。如而获得的遗传上达到一致的动物群。如BLAB/cBLAB/c小鼠。小鼠。杂杂交交群群:两两个个近近交交系系动动物物间间有有计计划划进进行行交交配配获获得得的的第第一一代动物。代动物。封封闭闭群群：由由同同一一血血缘缘品品系系进进行行自自由由交交配配，在在固固定定场场所所保保存繁殖存繁殖5 5年以上得动物群，如年以上得动物群，如Wistar Wistar 大鼠、大鼠、SDSD大鼠。大鼠。突突变变系系：正正常常染染色色体体基基因因突突变变导导致致遗遗传传缺缺陷陷的的动动物物，如如裸鼠裸鼠按微生物控制分类按微生物控制分类一级：普通动物，不携带人畜共患疾病病原体的动物。一级：普通动物，不携带人畜共患疾病病原体的动物。二二级级：清清洁洁动动物物，不不携携带带人人畜畜共共患患疾疾病病病病原原体体和和动动物物传传染染病病病原体的动物。病原体的动物。三三 级级：无无 特特 定定 病病 原原 体体 的的 动动 物物（specific specific pathogen pathogen free,SPFfree,SPF）,动动物物体体内内不不存存在在特特定定病病原原微微生生物物和和寄寄生生虫虫的的实验动物。实验动物。四级：无菌动物，不存在微生物和寄生虫的实验动物。四级：无菌动物，不存在微生物和寄生虫的实验动物。一一级级动动物物只只能能用用于于教教学学和和某某些些研研究究的的预预实实验验，卫卫生生部部以以上课题和研究生课题必须使用二级以上动物上课题和研究生课题必须使用二级以上动物免疫缺陷动物免疫缺陷动物裸小鼠（裸小鼠（nude micenude mice）19621962年英国发现。鼠年英国发现。鼠1111号染色体裸基因号染色体裸基因nunu是隐性突变基因。是隐性突变基因。裸基因纯合子（裸基因纯合子（nu/nunu/nu）鼠的特征）鼠的特征:1.1.全身无毛，裸体外表。全身无毛，裸体外表。2.2.胸腺上皮细胞不能增殖，胸腺上皮细胞不能增殖，T T细胞发育受阻，细胞发育受阻，T T细胞免疫缺陷。细胞免疫缺陷。3.B 3.B 细细胞胞形形态态正正常常，功功能能较较差差，免免疫疫球球蛋蛋白白以以 Ig Ig M M 为为主主，少少量量Ig G Ig G，类似于人原发细胞免疫缺陷。，类似于人原发细胞免疫缺陷。随着鼠龄增加，随着鼠龄增加，T T细胞增加，移植实验一般用细胞增加，移植实验一般用4-84-8周鼠。周鼠。4.4.裸裸小小鼠鼠抵抵抗抗力力差差，易易患患病病毒毒性性肝肝炎炎和和肺肺炎炎，应应饲饲养养在在SPF SPF 环环境。境。5.5.纯纯合合型型雌雌鼠鼠不不能能生生育育，/nu/+/nu/+和和/nu/nu/nu/nu交交配配可可获获 1/2 1/2 纯纯合子鼠。合子鼠。常用常用BALB/c nu/nu,Swiss nu/nu,NC nu/nu BALB/c nu/nu,Swiss nu/nu,NC nu/nu。应应 用用建立人肿瘤的裸鼠移植瘤模型建立人肿瘤的裸鼠移植瘤模型 研究致癌机理：研究致癌机理：1 1在裸鼠体内诱发人类肿瘤：在裸鼠体内诱发人类肿瘤：EBV EBV 2 2生生物物因因素素的的致致瘤瘤性性：多多瘤瘤病病毒毒只只在在新新生生鼠鼠或或幼幼鼠鼠诱诱发发肿肿瘤瘤，而而在在成成年年裸裸鼠鼠也也可可在在远远离离注注射射部部位位诱诱发发肿肿瘤瘤，在在雌雌鼠为乳腺癌，雄鼠为骨肉瘤。鼠为乳腺癌，雄鼠为骨肉瘤。裸大鼠裸大鼠(nude rat)(nude rat)19531953年苏格兰在远交系年苏格兰在远交系hoodedhooded大鼠中发现，因饲养不当而绝种。大鼠中发现，因饲养不当而绝种。19751975年重新发现纯合子大鼠。纯合子年重新发现纯合子大鼠。纯合子 rnu/rnu rnu/rnu 鼠无胸腺，缺鼠无胸腺，缺乏功能性乏功能性T T细胞，抵抗力低下。细胞，抵抗力低下。严重联合免疫缺陷鼠严重联合免疫缺陷鼠 (severe combined immune deficiency(severe combined immune deficiency mice,SCID)mice,SCID)19821982年美国发现于年美国发现于C.B-17/ICRC.B-17/ICR品系。品系。ScidScid位于位于1616号染色体，是隐性突变基因。号染色体，是隐性突变基因。纯纯合合子子scid/scid scid/scid T T细细胞胞和和B B细细胞胞功功能能缺缺陷陷，血血清清中中无无免免疫疫球球蛋蛋白白，外外周周血血淋淋巴巴细细胞胞数数量量明明显显减减少少。NK NK 细细胞胞功功能能正正常常。接接受受单单克克隆隆抗抗体体杂杂交交瘤瘤移移植植后后易易形形成成腹腹水水瘤瘤，可可获获得得高高纯纯度度的的单克隆抗体。单克隆抗体。SCID SCID 鼠被毛发正常，雌雄可生育。鼠被毛发正常，雌雄可生育。动物肿瘤模型动物肿瘤模型自发肿瘤：动物自然发生的肿瘤，发病过程与人类肿瘤相似，自发肿瘤：动物自然发生的肿瘤，发病过程与人类肿瘤相似，但发病时间早晚不一，不易在短期内得到实验结果。但发病时间早晚不一，不易在短期内得到实验结果。诱诱发发肿肿瘤瘤：用用化化学学、物物理理、生生物物等等因因素素在在动动物物体体内内诱诱发发的的肿肿瘤瘤。物物理理、生生物物因因素素诱诱发发肿肿瘤瘤的的潜潜伏伏期期长长，发发生生率率不不稳稳定定，常用化学因子诱发肿瘤。常用于肿瘤病因、化学预防的研究常用化学因子诱发肿瘤。常用于肿瘤病因、化学预防的研究诱发肿瘤模型的基本要求诱发肿瘤模型的基本要求简单易行、易重复简单易行、易重复选择对特定致癌物敏感的动物种系：选择对特定致癌物敏感的动物种系：多多环环方方香香烃烃-皮皮肤肤/小小鼠鼠；甲甲基基卞卞肼肼亚亚硝硝胺胺-食食道道癌癌/大大鼠鼠；甲基氨基偶氮苯甲基氨基偶氮苯-肝癌肝癌/大鼠大鼠恰当的致癌物剂量：恰当的致癌物剂量：动物存活率高，诱发周期短。动物存活率高，诱发周期短。诱发的肿瘤类似于人类肿瘤诱发的肿瘤类似于人类肿瘤原原位位诱诱发发：如如：0.250.25二二已已基基亚亚硝硝胺胺 0.250.251 1 ml ml 灌灌胃胃6 6月，月，7070发生肝癌发生肝癌异异位位诱诱发发：将将与与致致癌癌物物作作用用过过的的器器官官或或组组织织移移植植于于自自体体或或同同系系、同同基基因因正正常常动动物物皮皮下下，诱诱发发所所需需的的肿肿瘤瘤。如如：甲甲基基胆胆蒽蒽穿穿线线法法穿穿入入幼幼鼠鼠子子宫宫颈颈，将将子子宫宫颈颈切切除除，移移植植于于同同系系成成年年小小鼠皮下，鼠皮下，3 3个月后诱发异位子宫颈癌个月后诱发异位子宫颈癌可可移移植植性性肿肿瘤瘤 肿肿瘤瘤组组织织在在同同种种或或异异种种动动物物体体内内传传代代后后获获得的生物学特性学相对稳定的肿瘤。得的生物学特性学相对稳定的肿瘤。同种可移植性肿瘤同种可移植性肿瘤 可分为实体瘤、腹水瘤、淋巴瘤、白可分为实体瘤、腹水瘤、淋巴瘤、白血病血病 到到19971997年我国年我国6565株。株。腹水瘤：将可移植性实体瘤接种于同种动物腹腔或腹壁，腹水瘤：将可移植性实体瘤接种于同种动物腹腔或腹壁，待肿瘤生长后形成腹水，再接接种于同系肿瘤。用于药待肿瘤生长后形成腹水，再接接种于同系肿瘤。用于药物筛选。物筛选。异种可移植性瘤：异种可移植性瘤：免免疫疫力力正正常常动动物物：免免疫疫隔隔离离区区 如如眼眼前前房房、脑脑内内，或或免免疫疫抑制，如抑制，如X X线照射线照射/可的松可的松 免疫缺陷动物免疫缺陷动物 移植部位移植部位原位移植（原位移植（orthotopic implantationorthotopic implantation）异异位位移移植植(ectopic(ectopic implantation)implantation)皮皮下下、肾肾包包膜膜下下、腹腹腔腔可移植性肿瘤的参考标准可移植性肿瘤的参考标准传传15-2015-20代以上代以上接种成活率接种成活率100%100%，自发消消退率，自发消消退率5%2(2年年)的的状状态态,此时肿瘤细胞处于此时肿瘤细胞处于G0G0期或增殖和凋亡相平衡。期或增殖和凋亡相平衡。微微小小转转移移灶灶（micro-metastasismicro-metastasis）:在在原原发发灶灶以以外外用用常常规规临临床床检检查方法不能发现的肿瘤病灶查方法不能发现的肿瘤病灶微小残留灶：治疗后在原发灶遗留的小量肿瘤细胞微小残留灶：治疗后在原发灶遗留的小量肿瘤细胞转基因动物肿瘤模型转基因动物肿瘤模型理论基础：理论基础：1 1 肿瘤是癌基因突变肿瘤是癌基因突变/抑癌基因失活的结果抑癌基因失活的结果 2 2 基因功能在进化中是保守的基因功能在进化中是保守的 转基因动物转基因动物外源基因在动物染色体稳定整合并遗传给后代的动物。外源基因在动物染色体稳定整合并遗传给后代的动物。用途：生物医药用途：生物医药 基因表达调控基因表达调控 单基因表达调控单基因表达调控 多基因表达调控多基因表达调控 基因敲除（基因敲除（knock out)knock out)转基因方法转基因方法 DNA DNA 逆转录病毒逆转录病毒/DNA/DNA转染转染 胚胎干细胞胚胎干细胞 显微注射显微注射受精卵受精卵 四细胞胚胎四细胞胚胎 囊胚囊胚 原肠胚原肠胚 转基因动物转基因动物 显微注射显微注射 逆转录病毒逆转录病毒DNA DNADNA DNA纤维注射与逆转录病毒转染的比较纤维注射与逆转录病毒转染的比较转基因方式转基因方式 显微注射显微注射 逆转逆转录病毒转染录病毒转染DNADNA导入导入 50kb,50kb,单细胞受精卵单细胞受精卵 10-15kb,4610-15kb,46细细胞卵胞卵培养液培养液 M16 M16 高营养液高营养液移卵移卵 输卵管输卵管 子宫子宫整合整合 随机整合，多拷贝随机整合，多拷贝 随机整合，随机整合，嵌合体，嵌合体，单拷贝单拷贝表达表达 受旁侧序列影响受旁侧序列影响 受病毒受病毒LTRLTR影响，影响，在一定范围内表达水平在一定范围内表达水平 易缺失易缺失 与拷贝数成正比与拷贝数成正比传代传代 可传代可传代 整合至整合至生殖细胞的可传代生殖细胞的可传代显微注射法建立转基因鼠的一般实验程序显微注射法建立转基因鼠的一般实验程序 供体母供体母鼠鼠 注射激素、交配注射激素、交配 鼠受精卵鼠受精卵目的基因目的基因 显微注射显微注射 注射注射DNADNA的受精卵的受精卵 假孕母鼠假孕母鼠 娩出幼鼠娩出幼鼠 鉴定鉴定C57BL/6C57BL/6肝癌模型肝癌模型p53-/-+p53+/+HBV+p53+/-HBV+p53+/+p53-/-+p53+/+HBV+p53+/-HBV+p53+/+p53+/-p53+/-HBV+HBV+P53+/-P53+/-HBV-HBV-p53+/+p53+/+HBV HBV+P53+/+P53+/+HBV-HBV-AFB1 10mg/kg i.p AFB1 10mg/kg Group HBV p53 AFB1 SEX N HCCGroup HBV p53 AFB1 SEX N HCC Ia +/-+M 7 7/7 Ia +/-+M 7 7/7 +/-+F 8 5/8 +/-+F 8 5/8 IIa +/+M 16 11/16 IIa +/+M 16 11/16 +/+F 6 0/6 +/+F 6 0/6 IIIa -+/-+M 7 2/7 IIIa -+/-+M 7 2/7 -+/-+F 9 1/9 -+/-+F 9 1/9 IVa -+/+M 10 1/10 IVa -+/+M 10 1/10 -+/+F 7 0/7 -+/+F 7 0/7 Ib +/-M 8 1/8 Ib +/-M 8 1/8 IIb +/+-F 5 0/5 IIb +/+-F 5 0/5后面内容直接删除就行后面内容直接删除就行资料可以编辑修改使用资料可以编辑修改使用资料可以编辑修改使用资料可以编辑修改使用主要经营：网络软件设计、图文设计制作、主要经营：网络软件设计、图文设计制作、发布广告等发布广告等公司秉着以优质的服务对待每一位客户，做公司秉着以优质的服务对待每一位客户，做到让客户满意！到让客户满意！致力于数据挖掘，合同简历、论文写作、致力于数据挖掘，合同简历、论文写作、PPTPPT设计、计划书、策划案、学习课件、各设计、计划书、策划案、学习课件、各类模板等方方面面，打造全网一站式需求类模板等方方面面，打造全网一站式需求The user can demonstrate on a projector The user can demonstrate on a projector or computer,or print the presentation or computer,or print the presentation and make it into a film to be used in a and make it into a film to be used in a wider fieldwider field