动物染色体工程与转基因动物ppt课件.pptx

第十二章第十二章 动物染色体工程与转基动物染色体工程与转基因动物因动物生命科学与技术学院陶宏征动物染色体工程动物染色体工程动物染色体工程（物染色体工程（chromosome engineering）是指人是指人们按按预先的先的设计、消减或、消减或替替换同种或异种同种或异种动物物细胞染色体的技胞染色体的技术。第一节第一节 多倍体动物多倍体动物多倍体动物（多倍体动物（polyploid animalpolyploid animal）是指细胞是指细胞中含有超多正常体细胞染色体组数的动物个体中含有超多正常体细胞染色体组数的动物个体自然界中动物多倍性现象比较少见。原因是：高等动物的远缘杂交能力很弱，这样难以形成杂种个体；多倍体动物高度不育，染色体异常通常会造成胚胎死亡尽管如此，在低等脊椎动物中还是有少数多倍体动物存在，包括鱼类、两栖类和爬行类，一般都是同源多倍体。动物多倍体育种有着重要的意义。Triploid Grass Carp三倍体草鱼三倍体草鱼一一 多倍体动物培育多倍体动物培育与植物多倍体育种多采用化学有道不同，多倍体动物常采用物理方法。物理方法主要包括温度休克法、水静压法、机械创伤法、辐射高盐高碱法等（一）物理方法（一）物理方法1.温度休克法温度休克法冷休克法：用0-5低温处理热休克法：用30左右高温处理温度休克法廉价、处理量大、易操作，但是诱导率较低。使用温度休克法诱导多倍体的关键能否成功地组织细胞分裂或卵母细胞第二极体的释放。多用于鱼类2.水静压法水静压法采用较高的水静压可移植卵母细胞第二极体的释放或细胞分裂产生多倍体。具有诱导率高、处理时间段（3-5min）、对受精卵损伤小、成活率高等优点该法多用于鱼类三倍体培育（二）化学方法（二）化学方法化学方法是指应用某些化学药品（如秋水仙素、细胞松弛素、6-二甲基氨基嘌呤、聚乙二醇、咖啡因等）诱导多倍体。用化学方法需注意处理的开始时间、持续时间和药物使用浓度。化学方法在生产上不常用，因为成功率低，并且有些化学药品有毒，会对胚胎存活率产生影响，还易对生产者产生危害。（三）生物学方法（三）生物学方法主要指远缘杂交，利用染色体加倍个体与未加倍个体杂交产下多倍体。如四倍体个体与二倍体个体杂交产下三倍体。二二 多倍体动物鉴定多倍体动物鉴定（一）染色体技术和核型分析（一）染色体技术和核型分析简单可靠、提供直接证据（二）核仁数目的银染色法测定（二）核仁数目的银染色法测定单倍体细胞含一个核仁，而二倍体、三倍体和四倍体细胞分别含有二、三、四个核仁（三）细胞核体积测量（三）细胞核体积测量染色体数目的倍增与细胞核体积增大是平行的。一般来说，单倍体细胞的体积只有二倍体的一般，是三倍体、四倍体的1/3、1/4左右。通常测定红细胞的核体积来比较（四）（四）DNA含量测定含量测定在同一物种内，染色体组数和DNA含量成正比例关系。第二节第二节 转基因动物转基因动物转基因基因动物（物（transgenic animal）是指在基是指在基因因组内内稳定地整合外源基因，并且外源基因定地整合外源基因，并且外源基因可以可以稳定地定地遗传给后代的基因工程后代的基因工程动物。物。一一 转基因方法转基因方法（一）原核期胚胎显微注射法（一）原核期胚胎显微注射法通过激素使用使雌性动物超数排卵，并与雄鼠交配，取出受精卵。然后借助于显微镜将钝化的DNA溶液迅速注入受精卵的雄核内。将该受精卵移植到另外一只假受孕母鼠的输卵管内，正常发育、繁殖出转基因鼠。这种方法转入的基因长度可达数百kb，并能随机第整合在受体细胞染色体DNA上。该方法比较经典，应用广泛、效果比较稳定缺点是有时候会导致转基因动物基因组的重排、易位、缺失或定点突变。（二）胚胎干细胞方法（二）胚胎干细胞方法 胚胎干细胞（ES）是一种含正常二倍染色体的具有发育全能性的细胞，因此只要将外源DNA导入胚胎干细胞就可以实现基因的转移。可以通过核移植、聚合、注射法产生转基因动物。（三）精子载体法（三）精子载体法精子载体法是一种直接用精子作为外源DNA载体的转移方法。基本方法是：精子直接与外源DNA混合培养，外源基因可以进入精子头部，受精后就克发育成转基因动物。与显微注射技术相比，具有简单、广泛适用的特点（四）逆转录病毒感染法（四）逆转录病毒感染法将目的基因重组到逆转录病毒载体上，人为感染着床前或着床后的胚胎，或直接将胚胎与能释放逆转录病毒的细胞共孵育达到感染目的，通过病毒将外源目的基因插入整合到宿主基因DNA中。由于逆转录病毒的高效率感染和在宿主细胞DNA上的高度整合特性，可以提高基因转移效率。（五）卵细胞显微注射法（五）卵细胞显微注射法由于处于减数分裂中期（MII）的卵细胞无核膜的时间远长于处于有丝分裂的细胞，因此为逆转录病毒载体介导的基因插入提供了更大的可能性。将外源基因克隆至逆转录病毒载体，然后将其显微注射到受精前卵细胞的卵周隙，然后在体外受精，培养至囊胚期，移入假孕的雌性动物子宫内发育。二二 转基因动物的鉴定转基因动物的鉴定（一）（一）Southern分析分析提取待检动物组织DNA，消化后电泳，转膜后选择适当的探针进行杂交，通过放射自显影检测。该方法的优点是结果可靠，但缺点是工作量大，操作繁琐。（二）聚合酶链式反应（二）聚合酶链式反应（PCR）技术）技术针对目的基因设计特异性引物，以组织提取的DNA为模板进行PCR扩增，通过对扩增产物进行序列分析就可以实现转基因动物的鉴定。但是PCR方法有时会存在假阳性。三三 基因改良动物基因改良动物转基因技术为动物品种改良提供了有效途径，具有周期短、成本低、选择效率高、不受有性繁殖的限制等优点。目前，转基因技术已经被用于提高生长速度、抗病育种、抗冻品种培育等领域（一）快速生长和肉质改善（一）快速生长和肉质改善转生长激素基因的猪等动物的生长速度和饲料利用效率显著提高，瘦肉率也有所增加。（二）增加羊毛产量和性能（二）增加羊毛产量和性能四、转基因动物乳腺生物反应器四、转基因动物乳腺生物反应器转基因动物生物反应器是指利用转基因活体动物的某种能够高效表达外源蛋白的器官或组织来生产活性蛋白的技术，这些蛋白一般是药用蛋白或营养保健蛋白。用于表达的产所包括动物乳腺、血液、泌尿系统、精囊腺等，还包括禽蛋和昆虫乳腺生物反乳腺生物反应器（器（mammary gland bioreacor）是将外源基因置是将外源基因置于乳腺特异性于乳腺特异性调节序列之下，使之在乳腺中表达，然后通序列之下，使之在乳腺中表达，然后通过乳汁乳汁获得重要价得重要价值的生物活性蛋白的技的生物活性蛋白的技术。采用转基因动物生产基因工程药物，最理想的表达场所是乳腺。乳腺是一个外分泌器官，乳汁不进入体内循环，因此不会影响到转基因动物本身的生理代谢。从转基因乳汁中获取目的基因产物，不但产量高、以提取，而且表达的蛋白经过重复呢的修饰加工，具有稳定的生物活性。利用转基因技术在哺乳动物特异组织系统内生产人类药用蛋白是当今生物制药的研究热点之一，利用动物乳腺生物反应器生产生物活性蛋白将有望发展为一个新兴的产业。建立转基因动物乳腺生物反应器的大致流程：建立转基因动物乳腺生物反应器的大致流程：构建相应的乳腺表达载体，分离人类药用蛋白的编码基因，将乳蛋白基因的启动子与外源基因连接，再与乳腺特异性表达调节元件相连接形成乳腺细胞表达载体通过转基因技术得到转基因动物在泌乳期选择动物乳汁中表达有药物蛋白的个体